Summary
Yetişkin sineklerin sık sık taze gıda şişelerine aktarılmasına alternatif olarak Drosophila suşları için uzun süreli bir koruma yöntemi oldukça arzu edilir. Bu protokol, Drosophila primordial germ hücrelerinin dondurularak saklanmasını ve agametik konakçı embriyolara nakledilmeleri yoluyla suşun yeniden canlandırılmasını açıklar.
Abstract
Drosophila suşları, yetişkin sineklerin sık sık yeni şişelere aktarılmasıyla korunmalıdır. Bu, mutasyonel bozulma ve fenotipik değişiklikler tehlikesi taşır. Bu nedenle, bu tür değişiklikler olmadan uzun süreli koruma için alternatif bir yöntemin geliştirilmesi zorunludur. Önceki başarılı girişimlere rağmen, Drosophila embriyolarının dondurularak saklanması, düşük tekrarlanabilirlik nedeniyle hala pratik kullanımda değildir. Burada, kriyo ile korunmuş PGC'lerin agametik Drosophila melanogaster (D. melanogaster) konakçı embriyolarına nakli yoluyla primordial germ hücresi (PGC) kriyoprezervasyonu ve suş canlanması için bir protokol tanımlanmıştır. PGC'ler kriyoprotektif ajanlara (CPA'lar) karşı oldukça geçirgendir ve suşlar arasındaki gelişimsel ve morfolojik varyasyon, embriyo kriyoprezervasyonundan daha az sorunludur. Bu yöntemde, yaklaşık 30 donör embriyodan PGC'ler toplanır, CPA tedavisinden sonra bir iğneye yüklenir ve daha sonra sıvı nitrojen içinde dondurularak saklanır. Donör kaynaklı gametler üretmek için, bir iğnedeki dondurularak saklanmış PGC'ler çözülür ve daha sonra yaklaşık 15 agametik konakçı embriyoya bırakılır. Bu protokol ile en az %15 verimli sinek sıklığı elde edildi ve verimli çift başına düşen döl sayısı her zaman orijinal suşu canlandırmak için fazlasıyla yeterliydi (ortalama döl sayısı 77.2 ± 7.1'dir), bu da dondurularak saklanmış PGC'lerin germ hattı kök hücrelerine dönüşme yeteneğini gösterir. İğne başına ortalama verimli sinek sayısı 1.1 ± 0.2 idi ve 26 iğneden 9'u iki veya daha fazla verimli döl üretti. 11 iğnenin, en az bir dişi ve bir erkeğin dahil olduğu 6 veya daha fazla döl üretmek için yeterli olduğu bulundu. Agametik konakçı, yeni ortaya çıkan dişi ve erkek sinekleri çaprazlayarak suşu hızlı bir şekilde canlandırmayı mümkün kılar. Ek olarak, PGC'ler, genom düzenleme gibi genetik mühendisliği uygulamalarında kullanılma potansiyeline sahiptir.
Introduction
Yetişkin sineklerin yeni gıda şişelerine aktarılmasıyla Drosophila suşlarının bakımı, kaçınılmaz olarak zaman içinde mutasyonların ve epigenetik değişikliklerin birikmesine neden olur. Drosophila suşlarının bu tür değişiklikler olmadan uzun süreli bakımı için alternatif bir yöntemin geliştirilmesi, özellikle tüm genomun korunması gereken referans suşlar için zorunludur. Drosophila embriyolarını veya yumurtalıklarını kriyoprezervasyona yönelik birkaç başarılı girişim tanımlanmıştır 1,2,3. Ne yazık ki, düşük tekrarlanabilirlik nedeniyle hala pratik kullanımda değiller. Gerçekten de, erken evre embriyolar, kriyoprotektif ajan (CPA) geçirgenliğini ve difüzyonunu engelleyen yüksek yumurta sarısı içeriği nedeniyle kriyoprezervasyondan sonra düşük bir hayatta kalma oranına sahiptir 2,3. CPA geçirgenliği, geç evre embriyoların mumsu katmanları tarafından da ciddi şekilde sınırlandırılmıştır. Embriyoların yüksek bir hayatta kalma oranına ve daha ince bir balmumu tabakasına sahip olduğu, suşa özgü bir zaman periyodu bulmak zor ve zaman alıcıdır. Son zamanlarda, Zhan ve ark.4 embriyo geçirgenliği, CPA yüklemesi ve vitrifikasyon yöntemlerini geliştirdi ve çoklu suşların embriyolarını başarıyla dondurarak sakladı. Bununla birlikte, yöntemlerin uygulanması kolay değildir, çünkü geçirgenlikten sonra embriyoların canlılığı zayıf olma eğilimindedir. Bu nedenle, alternatif yaklaşımların daha da iyileştirilmesine ve geliştirilmesine hala ihtiyaç vardır. İlkel germ hücrelerinin (PGC'ler) dondurularak saklanmasını içeren yöntemler, Drosophila suşlarının uzun süreli bakımı için alternatif bir yaklaşımdır.
PGC (kutup hücresi olarak da adlandırılır) transplantasyonu, zigotik ölümcül mutasyonların maternal etkileri ve germ hücrelerinin cinsiyet tayini gibi süreçleri incelemek için germ hattı kimeraları, özellikle dişiler üretmek için kullanılmıştır 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGC'ler embriyolardan çok daha küçüktür ve çoğu kriyoprotektan için oldukça geçirgen olmaları muhtemeldir. Ayrıca, suşlar arasındaki gelişimsel ve morfolojik varyasyon daha az sorunludur ve agametik bir konakçı, tüm genomların hızlı bir şekilde restorasyonunu sağlar. Yakın zamanda, Drosophila suşlarında kaçınılmaz olan genetik ve epigenetik değişiklikleri önleyen yeni bir PGC kriyoprezervasyon13 yöntemi geliştirdik. Burada ayrıntılı protokolü sunuyoruz.
Bu kriyoprezervasyon yöntemi, PGC işleme ve enstrümantasyonunda özel uzmanlık gerektirir. Adım adım yaklaşım, aşina olmayanlar için etkili bir çözüm olsa da, enstrümantasyon gereksinimleri nedeniyle küçük laboratuvarlar için uygun olmayabilir. Bu PGC kriyoprezervasyon protokolü, daha küçük gelişimsel ve morfolojik farklılıklar nedeniyle embriyo kriyoprezervasyon protokollerinden farklı Drosophila türleri ve farklı böcek türleri ile kullanım için daha kolay uyarlanabilir. PGC'ler, genom düzenleme 14,15,16 gibi genetik mühendisliği uygulamalarında da potansiyel olarak kullanılabilir. Özetle, bu yöntem, stok merkezlerinde ve diğer laboratuvarlarda, sinek ve diğer böcek türlerini değişiklik yapmadan uzun süre korumak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekipman hazırlığı
- Mikromanipülatör sistemi: Hücreleri toplamak ve nakletmek için bir mikromanipülatör sistemi kurun (Şekil 1A).
- PGC-toplama cam slaytları (Şekil 2A)
- Heptan tutkalı hazırlamak için yaklaşık 30 cm uzunluğunda çift taraflı bant kesin ve gece boyunca 7 mL teknik (normal) dereceli heptan çözeltisine batırın.
- Bir cam slaytın arkasına embriyo hizalaması için iki paralel referans çizgisi çizin.
- Yukarıdaki heptan yapıştırıcı damlalarını bir Pasteur pipeti kullanarak cam slayt üzerine (çizgiler olmadan yan tarafta) yayın. Sürgünün yüzeyini beyaz olana kadar havayla kurutun.
- Heptan tutkal damlalarının eklenmesini ve yayılmasını tekrarlayın ve slaydı tekrar kurutun.
NOT: Yapıştırıcı, sıvı çözeltilerin düz yüzeye yayılmasını önler ve sulu çözeltilerin bir iğneye yüklenmesini kolaylaştırır. - Embriyo havuzu çerçeveleri yapmak için, bir kesme tahtası üzerine elektrik bandı gibi üç kat 0,2 mm kalınlığında standart vinil bant yapıştırın. Bandı 1,5 cm genişliğinde dikdörtgenler halinde kesin. Ardından, 2 ila 3 mm'lik bir çerçeve bırakarak üç bant katmanını da kesin.
NOT: Embriyolar hizalandıktan sonra, embriyolar için bir havuz oluşturmak üzere bir embriyo havuzu çerçevesi yapıştırılır.
- Transplantasyon iğneleri
NOT: Bu çalışma sırasında piyasada bulunan tüm iğneler, PGC kriyoprezervasyonu için çok dar veya çok genişti.- Bir cam kılcal damar ve bir çektirme kullanarak bir iğne yapın. Isıtıcı seviyesi 85.0-98.4, mıknatıs ana seviyesi 57.8 ve mıknatıs alt seviyesi 45.0 olan bir NARISHIGE PN-31 çektirme kullanıyoruz.
- Yaklaşık duvar kalınlığı 1 μm ve ucu yaklaşık 200 μm olan, iç çapı 10-12 μm olan bir iğne yapmak için, iğne ucunu aşağıdaki üç aşamalı işlemde parlatın (Şekil 3). İlk olarak, iğne ucunu, ucun iç çapı 10-12 μm olana kadar 780 rpm hızında 30°'lik bir açıyla zımparalayın. Bu ilk taşlama adımı yaklaşık 1 saat sürer.
NOT: İğne ucunun kırılmasını önlemek için önce bileme taşını döndürün ve ardından iğneyi yavaşça bileme taşının üzerine doğru hareket ettirin. - İstenilen açıyı izlemek için iğnenin üstüne bir çizgi çizin. İğneyi saat yönünün tersine 90° döndürün ve 180 rpm hızında tekrar parlatın. Bu işlem yaklaşık 5 dakika sürer.
- İğneyi saat yönünde 45° döndürün ve bir saniye boyunca 180 rpm hızında parlatın.
- Mikroskop tablasına bir damla kromik asit karışımı (DİKKAT: toksik) içeren bir toplama camı lamı yerleştirin. İğneyi kılcal tutucuya (Şekil 1D) kaydırma yüzeyine göre 10°-13° açıyla takın, iğneyi dikkatlice aşağı doğru hareket ettirin ve ucu kromik asit karışımına daldırın.
- Pistonu çekerek ve iterek (Şekil 1B), iğnedeki cam kalıntılarını gidermek için çözeltiyi iğneden birkaç kez mekanik olarak yükleyin ve boşaltın. Dış duvarı da temizlediğinizden emin olun.
- Kromik asidi tamamen çıkarmak için iğnenin içini ve dışını iki kez damıtılmış suyla yıkayın.
2. PGC'lerin toplanması ve dondurularak saklanması
- Embriyoların toplanması
- İlgilenilen donör suşunun uygun sayıda sineğini (embriyo toplama kabı için her cinsiyet için yaklaşık 450) bir embriyo toplama plakası (Şekil 1E) ile bir embriyo toplama kabına aktarın ve 25 ° C'de inkübe edin. Genellikle oda sıcaklığında (23-25 °C) daha az kalabalık koşullarda yetiştirilen 3-5 günlük ebeveyn sinekleri kullanıyoruz.
- İki adet 30 dakikalık ön toplama yapın ve bırakılan yumurtaları atın. Dişiler yumurta kanalında gelişen döllenmiş yumurtaları tutabildiklerinden, bu adım adım 2.1.3'te yumurtlamayı senkronize etmek için gereklidir (Şekil 4).
- İki ön toplamadan sonra, embriyoları 50 dakika boyunca toplayın ve daha sonra embriyoların blastoderm aşamasına (erken evre 5,17) gelişmesine izin vermek için toplanan embriyoları 25 ° C'de nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. Kuluçka süresi genellikle 100 dakikadır, ancak suşa bağlı olarak 120 dakikaya kadar uzatılabilir (Şekil 4).
NOT: Nemlendirilmiş bir oda, plastik bir kutunun altına nemli bir kağıt havlu yerleştirilerek ve kullanımdan önce üzerine bir su sisi püskürtülerek yapılır. Erken evre-5 embriyolarda PGC oluşumu tamamlanmıştır ancak somatik hücreselleşme tamamlanmamıştır. Bir embriyonun tam aşaması, adım 2.4'te bir bileşik mikroskop altında belirlenir.
- Dekoryonlayıcı embriyolar
- Paslanmaz çelik hasır süzgecin üzerine bir damla damıtılmış su bırakın (150 göz, 109 μm açıklık, 60 μm tel çapı; Şekil 1F). Forseps kullanarak, embriyo toplama plakasından embriyoları toplayın ve su damlacığına koyun.
- Suyu emmek için kağıt mendili alttan süzgecin üzerine bastırın. Embriyolara taze% 5 (Cl olarak) sodyum hipoklorit çözeltisi damlacıkları ekleyin ve süzgeci 10 saniye boyunca sürekli olarak hafifçe vurun.
- Embriyoları doğrudan damıtılmış su ile sıçratarak yıkayın ve suyu emmesi için kağıt mendili alttan süzgecin üzerine bastırın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- Dekoryonlu embriyoların hizalanması
- Stereo mikroskop altında, embriyoları transfer etmek için forseps kullanın. Dekoryonlu embriyoları iki referans çizgisi boyunca bir PGC toplama cam slaytı üzerinde iki sıra halinde hizalayın (Şekil 2A). Embriyolar, önleri sağa (manipüle edilecek taraf) ve ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirilir.
NOT: Bu adım, genellikle yaklaşık 40 embriyoyu hizaladığımız 20 dakika içinde tamamlanmalıdır. - PGC toplama cam slaytındaki embriyoların etrafına bir embriyo havuzu çerçevesi yapıştırın. 1 μL CPA solüsyonu (1x Ephrussi-Beadle Ringer solüsyonu, EBR, %20 etilen glikol ve 1 M sükroz içerir; 1x EBR: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 ve pH 6.9'da 10 mM Hepe) çerçevenin çevrelediği alanda iki ayrı noktaya damlatın ve embriyoların kurumasını önlemek için havuzu silikon yağı ile doldurun (Şekil 2A).
NOT: CPA çözeltisini hazırlamak için, 10.26 g sakarozu, 3 mL 10 x EBR çözeltisi içeren yaklaşık 20 mL damıtılmışH2Oiçinde tamamen çözün. 6 mL etilen glikol ekleyin ve ardından 30 mL'ye kadar damıtılmışH2Oekleyin. İyice karıştırdıktan sonra, çözeltiyi 0,22 mm'lik tek kullanımlık bir membrandan süzün.
- Stereo mikroskop altında, embriyoları transfer etmek için forseps kullanın. Dekoryonlu embriyoları iki referans çizgisi boyunca bir PGC toplama cam slaytı üzerinde iki sıra halinde hizalayın (Şekil 2A). Embriyolar, önleri sağa (manipüle edilecek taraf) ve ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirilir.
- PGC'lerin Toplanması
- Adım 2.3.2'deki PGC toplama cam lamını, mikromanipülatör sistemi ile donatılmış bir mikroskobun tablasına yerleştirin. İğneyi kılcal damar tutucuya takın ve sol sıradaki ilk embriyoyu ve iğne ucunu aynı odak düzlemine getirin. Silikon yağını iğneye 2-3 saniye yükleyin.
- Sol sıradaki embriyolardan PGC toplamaya başlayın. 20x objektif lens kullanarak, iğne ucunu yavaşça embriyonun ön ucunun yüzeyine doğru hareket ettirin ve iğneyi hareket ettirerek değil, mikroskop aşamasını hareket ettirerek embriyoyu arka uca doğru nüfuz ettirin.
- İğne ucu arka uca ulaştığında, iğneyi hafifçe geri çekin ve somatik hücre tabakasının hemen içindeki iğnedeki yumurta sarısını tamamen boşaltın.
- İğnedeki basıncı sabit tutarken, iğne ucunu arka kutbun hemen içindeki PGC'lere doğru hareket ettirin ve nazikçe, ancak fazla zaman harcamadan PGC'leri yükleyin.
- İğneyi embriyodan hızlı bir şekilde çekin ve yumurta sarısı ve diğer kirleticileri iğneden silikon yağ havuzuna boşaltın, PGC'leri iğnede tutun. Ardından, havuzdan temiz silikon yağı yükleyin.
- Sol sıradaki diğer embriyolar için 2.4.2'den 2.4.5'e kadar olan adımları tekrarlayın. Yeni bir embriyodan PGC'leri toplamadan önce, yüklü PGC'leri iğnede tutarken, adım 2.4.5'te yüklenen silikon yağının mümkün olduğunca çoğunu somatik hücre tabakasının içine bırakın. Bu, yeni yüklenen PGC'lerin, aralarında herhangi bir müdahale malzemesi olmadan daha önce toplanan PGC'lere bitişik olmasını sağlar.
- Sol sıradaki embriyolardan PGC toplama işlemini tamamladıktan sonra, PGC'leri yumurta sarısı ve diğer kirleticilerden mümkün olduğunca ayırın. Bunu başarmak için, iğnedeki tüm PGC'leri bir embriyonun yüzeyine bırakın ve yumurta sarısını veya diğer kirleticileri başka bir komşu embriyoya çıkarın.
- Ardından, sağ sıradaki embriyolardan PGC'leri toplayın. Sağ ve sol sıralardan toplanan PGC'leri birleştirin.
- PGC'lere kriyoprotektif ajan (CPA) uygulanması
- İğneyi bir damlada CPA ile yıkadıktan sonra, başka bir damlada taze CPA'yı iğneye yükleyin ve embriyo üzerinde biriken PGC'lere CPA ekleyin. EBM'nin hacmi, PGC'lerinkine eşit olmalıdır.
- CPA'nın eklenmesinden 1-2 saniye sonra PGC kümesinden mümkün olduğunca fazla CPA'yı kaldırın. PGC'ler hafifçe küçülür ve EBM eklendikten hemen sonra kare şeklinde olur.
- İğneyi boşaltın ve ardından silikon yağını 5 sn veya daha uzun süre yükleyin. Toplanan tüm PGC'leri yükleyin ve ardından silikon yağını bir kez daha 5 sn veya daha uzun süre yükleyin. PGC'ler artık iki silikon yağı tabakası arasına sıkıştırılmıştır (Şekil 2B).
NOT: Mümkün olduğunca çok yumurta sarısı, CPA ve diğer kirleticilerin çıkarılması önemlidir.
- Kriyoprezervasyon PGC'ler
- Üç vanayı açın (Şekil 1C) ve ardından iğneyi mikromanipülatörden ayırın. İğnenin yüzeyindeki yağı yumuşak kağıt mendille kurulayın. İğnenin ucuna doğrudan dokuya dokunmayın.
- İğneyi bir iğne tutucuya takın ve vinil bant kullanarak tabandaki yerine kilitleyin (Şekil 1H). Tutucu boruya bir etiket yapıştırın.
- Flaş, tutucuyu iğne aşağı bakacak şekilde sıvı nitrojene batırarak dondurun. Sıvının raftan çıkması durana kadar tutucuyu serbest bırakmayın.
- Tutucuyu buhar fazı alanında değil, sıvı faz alanındaki bir sıvı nitrojen depolama tankında saklayın.
3. PGC'lerin çözülmesi ve nakledilmesi
- Agametik konakçı sineklerden embriyoların toplanması, dekoryonlanması ve hizalanması
- 2. adımı izleyerek agametik konakçı sineklerden embriyoları toplayın ve dekoryonatın.
- Evre 5 agametik konakçı embriyoları bir transplantasyon cam lamı üzerinde hizalayın. Ancak bu sefer posterioru sağa (manipüle edilecek taraf) ve ventrali üste doğru yönlendirin (Şekil 5). Yaklaşık 30 embriyoyu 20 dakikada iki sıra halinde sıralayın.
- Embriyoları hizalarken, oda nemi gerektiriyorsa 2-10 dakika boyunca bir nemlendirici çalıştırın (Tablo 1). İdeal nem %30 ila %40'tır, ancak bu termal koşullara bağlı olarak değişebilir.
- Konakçı embriyolarda PGC'lerin çözülmesi ve nakli
- Dondurularak saklanmış PGC'leri hızlı bir şekilde çözmek için, iğneyi içeren tutucuyu, iğne aşağı bakacak şekilde oda sıcaklığında 1x EBR çözeltisine kaydırın ve 10 saniye boyunca su altında tutun.
- Transplantasyon cam lamını mikroskop tablasına yerleştirin. Dondurularak çözülmüş iğneyi kılcal damar tutucuya takın ve sol sıradaki ilk embriyoyu ve iğne ucunu aynı odak düzlemine getirin.
- 20x objektif lens kullanarak, iğne ucunu yavaşça embriyonun arka ucunun yüzeyine doğru hareket ettirin.
- Her embriyonun dışını nazikçe dürtün ve yavaşça orijinal şekillerine döndüklerinden emin olun. Dürtme, embriyonun iç basıncının çok yüksek veya çok düşük olmadığını doğrulayacaktır.
- İğneyi yavaşça hareket ettirin ve arka kutuptan bir embriyoya nüfuz edin.
- Yaklaşık 10-20 PGC'yi arka kutbun hemen içine, tam olarak vitellin membranı ile embriyonun somatik hücre tabakası arasına yavaşça yerleştirin. Bunları somatik hücre tabakasına bırakmaktan kaçının. Perivitellin sıvısı embriyodan dışarı sızarsa, sızan sıvıyı iğneye emdirin ve çıkarın.
- İğneyi embriyodan geri çekin. Sonraki embriyolar için 3.2.5 ve 3.2.6 adımlarını tekrarlayın.
4. Embriyoların kuluçkalanması ve donör suşlarının eski haline getirilmesi
- Nakledilen PGC'leri almayan embriyoları çıkarın ve kalan embriyoları nemlendirilmiş bir odada (Şekil 1G) 25 °C'de inkübe edin.
- Transplantasyondan 24 saat veya daha uzun bir süre sonra ve yumurtadan çıktıktan sonra mümkün olan en kısa sürede, yumurtadan çıkan larvaları almak ve standart Drosophila gıda şişelerine aktarmak için forseps kullanın ve 25 ° C'de inkübe edin.
- Suşu canlandırmak için yeni ortaya çıkan dişileri ve erkekleri çaprazlayın (Şekil 6).
NOT: Agametik konakçılar, dengeleyici kromozom suşlarına geçmeden tüm genomu bir kerede geri yüklemeyi mümkün kılar. Agametik erkeklerin bir şişede bir arada yaşaması önemli olmayacaktır çünkü dişiler, onlarla çiftleşseler bile, yeniden yaşamaya karşı azalmış duyarlılık da dahil olmak üzere uzun vadeli çiftleşme sonrası tepkiler göstermezler18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dondurularak saklanan PGC transplantasyonunun etkinliği Asaoka ve ark.13 tarafından bildirilmiştir ve sıvı nitrojen içinde 1 gün veya daha uzun süre dondurularak saklanan PGC'lerin transplantasyonu için Tablo 2'de verilmiştir. Kuluçka oranı 168/208 nakledilen embriyo (%80.8) ve embriyodan yetişkine canlılık 87/208 (%41.8) idi. Döl sineği sıklığı 28/87 (%32.2) idi. Bu sıklık, 8 ila 30 gün boyunca dondurularak saklanan PGC'ler ve 31-150 gün boyunca dondurularak saklananlar arasında farklılık göstermedi (20/57'ye karşı 8/30, G' = 0.63, p >0.1, d.f. = 1). Çift başına ortalama döl sayısı 77.2 ± 7.1 (n = 18, 28-122) idi, bu da dondurularak saklanan PGC'lerin germ hattı kök hücrelerine dönüşme yeteneğini gösteriyordu. 26 iğneden 10'u döl üretmedi, 7 iğne 1 döl üretti, 7 iğne 2 döl üretti ve 2 iğne 3 veya 4 döl üretti. İğne başına ortalama verimli sinek sayısı 1.1 ± 0.2 idi. Bu verilere dayanarak,% 95 güvenle, en az bir dişi ve bir erkeğin dahil edildiği 6 veya daha fazla döl üretmek için 11 iğne yeterlidir.
Yukarıdaki deneylerde, PGC'lerde (nanos>ovo-A, OvoA_OE embriyolar) ovo-A mRNA'yı eksprese eden embriyoları agametik konakçı olarak kullandık. Nakledilen nanos>ovo-A çiftlerinden üretilen 669 F1 dişi ve 720 F1 erkeğinden, konakçı PGC'lerden türetilen bir kaçış yoktu. Birkaç oskar (osk) mutantı da sıcaklığa duyarlı agametik 20,21'dir. Yüksek homozigot canlılığa ve agametik fenotipe sahip bir osk mutantı artık mevcut olmadığından, CRISPR/Cas9 destekli genom düzenleme ile osk[8] missense mutant20'yi yeniden yarattık. Bu sinekler 25 °C'de tamamen agametikti (230 dişiden 0'ı ve 192 erkekten kaçanları), ancak 23 °C'de birkaç kaçış ortaya çıktı (248 dişiden 1'i ve 290 erkekten 1'i). nanos>ovo-A bu nedenle agametik konakçı embriyolar olarak önerilmektedir. Hem UASp-ovo-A hem de nanos-Gal4 stokları13 yakında KYOTO Drosophila Stok Merkezi'nden temin edilebilecek.
Şekil 1: Gerekli ekipman. (A) Hücreleri toplamak ve nakletmek için bir mikromanipülatör sistemi. i) ters mikroskop, ii) mekanik mikromanipülatör, iii) şırınga, iv) kılcal tutucu, v) üç musluk, vi) nemlendirici ve vii) stereo mikroskop. (B) Bir şırınga. (C) Üç bir musluk ve silikon tüpler, bir şırınga ve bir kılcal tutucuyu birbirine bağlar. (D) Bir mikromanipülatöre bir iğne ve bir kılcal tutucu takılır. (E) Embriyo toplama plakalı (6 cm çapında, 7,7 cm yüksekliğinde) bir embriyo toplama kabı. (F) Paslanmaz çelik hasır süzgeç. (G) Cam slaytlı nemli oda olarak kullanılan bir kap. Nemi korumak için altına ıslak kağıt yerleştirin ve kapağı kapatın. (H) Kriyoprezervasyon için iğneli bir iğne tutucu. (I) Kriyoprezervasyon için bir saklama rafı ve iğneli bir kutu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir PGC toplama cam lamı ve bir kriyoprezervasyon iğnesi. (A) Yapıştırıcı ile kaplanmış bir ilkel germ hücresi (PGC) toplama cam slaytı. Dekoryonlu embriyolar iki sıra halinde hizalanır ve önleri sağa (manipüle edilecek taraf) ve ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirilir. Bir embriyo havuzu çerçevesi yapıştırılır, iki damla kriyoprotektif ajan (CPA) çözeltisi biriktirilir ve havuz silikon yağı ile doldurulur. (B) Bir iğne mümkün olduğunca az miktarda yumurta sarısı ve diğer kirleticileri içermelidir. PGC'ler, sıvı nitrojen içinde dondurularak saklandığında iki silikon yağı tabakası arasına sıkıştırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İğnenin yapımı. Uygun delik boyutuna ve keskin uca sahip bir iğne yapmak için üç aşamalı uç parlatma yöntemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Embriyo toplama şeması. İki ön toplamadan sonra, genellikle günde üç veya dört kez topluyoruz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Konakçı embriyo hizalaması. Konakçı embriyoların bir cam slayt üzerinde hizalanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: PGC kriyoprezervasyon yöntemine genel bakış. İlkel germ hücresi (PGC) kriyoprezervasyonunu gerçekleştirmek için izlenen tüm adımlara genel bir bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Oda nemi | |||
| < %30 | ~ %30 | > %30 | |
| Konakçı embriyoları hizalayın (~20 dk) |
2 - 10 dakika nemlendirici kullanın | 1 dakika boyunca aralıklı olarak nemlendirici kullanın | Nemlendirici kullanmayın |
| Donör PGC'leri çözün | Uygulanamaz | Uygulanamaz | Uygulanamaz |
| Hava kurumalı PGC'ler | Bu adımı atla | Bu adımı atla | 5 dk |
| Silikon yağı uygulayın | Uygulanamaz | Uygulanamaz | Uygulanamaz |
| PGC'leri nakledin | Uygulanamaz | Uygulanamaz | Uygulanamaz |
| Tüm bu adımlar 50 dakika içinde tamamlanmalıdır. | |||
Tablo 1: Embriyo hizalaması ve PGC çözdürme sırasında embriyoların kurutulması.
| Donör suşu | Kriyoprezervasyon süresi | Nakledilen embriyo sayısı (A) | Yumurtadan çıkan larva sayısı (B) (kuluçka kabiliyeti, B/A) |
Kapalı yetişkin sayısı (C) (yumurtadan yetişkine canlılık, C/A) |
Doğurgan ergin sayısı (D) (verimli sineklerin sıklığı, D/C) |
| M17 Serisi | 8 - 30 gün | 134 | 108 (80.6%) |
57 (42.5%) |
20 (35.1%) |
| M17 Serisi | 31 - 150 gün | 74 | 60 (81.1%) |
30 (40.5%) |
8 (26.7%) |
| M17: yw; TM6B, P{Dfd-GMR-nvYFP}4, Sb[1] Tb[1] ca[1]/ Pri[1] | |||||
Tablo 2: Dondurularak saklanmış PGC transplantasyonunun etkinliği. Bu tablo13'ten değiştirilmiştir. Tüm veriler agametik ana bilgisayarlardan alınmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PGC kriyoprezervasyonu ve canlandırmasında başarı için kritik bir faktör iyi embriyoların kullanılmasıdır. Embriyo toplama için genç dişiler (örneğin, 3 ila 5 günlük) kullanılmalıdır. Hem donör hem de konakçı embriyolar mikroskobik inceleme ile değerlendirilir ve sadece blastoderm aşamasındakiler (evre 5) kullanılır12. PGC toplama için, genellikle 20 dakikalık bir süre içinde yaklaşık 40 donör embriyoyu hizalarız ve erken evre 5'te yaklaşık 30 embriyodan PGC toplarız; Daha yaşlı ve kusurlu embriyolar kullanılmaz. Kriyoprezervasyon ve çözdürme işleminden sonra, PGC'ler şekillerini korumalıdır; PGC'ler başarısız korumada yırtılır. Konakçı embriyolar da evre 5'te olmalı ve orta derecede bir iç basınca sahip olmalıdır; Embriyolar, nazikçe dürtüldükten sonra yavaşça orijinal şekillerine dönmelidir. Aşırı ve yetersiz kurutulmuş embriyolar transplantasyondan sonra normal şekilde gelişmeyecektir. PGC'lerin heteroseksüel transplantasyonu Drosophila 5,10'da gamet üretemediğinden, PGC'lerin çoklu donör embriyolardan konakçı embriyolara transplantasyonunun verimli yetişkinler vermesi daha olasıdır. Bu amaçla, genellikle iğne başına yaklaşık 30 embriyodan PGC topluyoruz.
Kriyoprotektanlar olarak, etilen glikol, dimetil sülfoksit ve gliserolü çeşitli konsantrasyonlarda sakaroz ile birlikte denedik. %20 etilen glikol ve 1 M sakkaroz içeren EBR'yi en iyi13 olarak belirledik; bununla birlikte, farklı kriyoprotektanların kullanımı PGC'nin korunmasını iyileştirebilir22.
Bu kriyoprezervasyon yöntemi, PGC kullanımında özel beceriler gerektirir ve PGC'leri rahatça toplamak ve nakletmek için yaklaşık 6 haftalık bir eğitim gerekir. Beceri yeterliliğini değerlendirmek ve geliştirmek için bu altı eğitim adımına ayrılabilir: 1) embriyoları bir cam slayt üzerinde hizalamak, 2) bir manipülatörü kontrol etmek, 3) PGC'leri bir embriyodan başka bir embriyoya kriyoprezervasyon olmadan nakletmek, 4) 10 veya daha fazla embriyodan PGC'leri 5 ila 10 embriyoya nakletmek, 5) CPA uygulandıktan sonra PGC'leri nakletmek ve 6) dondurarak çözüldükten sonra PGC'leri nakletmek. Her adım 1 hafta sürebilir. 3. adımdaki kısa vadeli hedefler, %40'lık bir kuluçka oranı, %10-20'lik bir embriyo-yetişkin canlılığı ve %20'lik bir verimli sinek sıklığıdır.
PGC kriyoprezervasyonu, maliyetli enstrümantasyon ve yüksek vasıflı personel gerektirir. Bu nedenle, bu yöntem birçok laboratuvar tarafından benimsenmeyebilir. Bununla birlikte, mevcut PGC yönteminin birkaç önemli yönü vardır. İlk olarak, PGC'ler embriyolardan çok daha küçüktür ve kriyoprotektanlara karşı çok geçirgendir. Buna karşılık, kriyoprotektan geçirgenliği, embriyo kriyoprezervasyonunda en ciddi sorun olan Drosophila embriyolarının mumsu katmanları tarafından ciddi şekilde sınırlandırılmıştır. Gerçekten de, önceki çalışmalar, embriyoların yüksek bir hayatta kalma oranına ve daha ince bir balmumu tabakasına sahip olduğu bir zaman penceresi bulmak için büyük çaba sarf etmiştir. İkincisi, suşlar arasındaki gelişimsel ve morfolojik varyasyonla ilgilidir. PGC'ler erken evre-5 embriyolardan (yumurtlamadan 2 saat 30 dk-3 saat 20 dakika sonra) toplanırken, embriyo kriyoprezervasyonu evre-16 embriyolarda (yumurtlamadan 14-22 saat sonra) yapılır. Bu nedenle embriyolar çok daha yaşlıdır ve PGC kriyoprezervasyonu ile karşılaştırıldığında kriyoprezervasyon için en uygun zaman penceresinde çok daha büyük suş varyasyonu gösterir. Gerçekten de, donör kaynaklı döl üreten konakçıların sıklığı, konakçılar agametik olmasa da, Asaoka ve ark.13 tarafından incelenen beş suş arasında farklılık göstermedi. Ayrıca, PGC'ler genom düzenleme gibi genetik mühendisliği uygulamalarında kullanılma potansiyeline sahiptir 14,15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Sinek suşları için KYOTO Drosophila Stok Merkezi'ne teşekkür ederiz. Ayrıca, makalenin İngilizce düzenlemesi için Bayan Wanda Miyata'ya ve bu makalenin taslağını düzenlediği için Edanz'dan (https://jp.edanz.com/ac) Dr. Jeremy Allen'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı'ndan (AMED) T.T.-S.-K.'ye hibeler (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146), AMED'den S.K.'ye hibeler (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145), AMED'den T.T.-S.-K.'ye hibeler (JP20km0210172) ile desteklenmiştir. ve S.K., Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (JSPS) T.T.-S.-K.'ye Bilimsel Araştırma Hibesi (C) (JP19K06780) ve JSPS'den SK'ye Yenilikçi Alanlarda Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (JP18H05552)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
References
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al.
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P.
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , Second Edition, Springer, Berlin, Heidelberg. (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genetics. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
