Summary
Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.
Abstract
De micro-omgeving van het beenmerg bestaat uit verschillende celpopulaties, zoals mesenchymale stromale cellen, endotheelcellen, osteolineagecellen en fibroblasten, die ondersteuning bieden aan hematopoëtische stamcellen (HSC's). Naast het ondersteunen van normale HSC's, speelt de micro-omgeving van het beenmerg ook een rol bij de ontwikkeling van hematopoëtische stamcelaandoeningen, zoals myelodysplastische syndromen (MDS) en acute myeloïde leukemie (AML). MDS-geassocieerde mutaties in HSC's leiden tot een blokkade in differentiatie en progressief beenmergfalen, vooral bij ouderen. MDS kan vaak evolueren naar therapieresistente AML, een ziekte die wordt gekenmerkt door een snelle accumulatie van onrijpe myeloïde blasten. Het is bekend dat de micro-omgeving van het beenmerg veranderd is bij patiënten met deze myeloïde neoplasmata. Hier wordt een uitgebreid protocol beschreven voor het isoleren en fenotypisch karakteriseren van micro-omgevingscellen in het beenmerg van muizenmodellen van myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie. Het isoleren en karakteriseren van veranderingen in de nichepopulaties van het beenmerg kan helpen bij het bepalen van hun rol bij het ontstaan en de progressie van de ziekte en kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapieën die gericht zijn op kankerbevorderende veranderingen in de stromale populaties van het beenmerg.
Introduction
De micro-omgeving van het beenmerg bestaat uit hematopoëtische cellen, niet-hematopoëtische stromale cellen en de extracellulaire matrix 1,2. Deze micro-omgeving kan de zelfvernieuwing van hematopoëtische stamcellen bevorderen, de differentiatie van de afstamming reguleren en structurele en mechanische ondersteuning bieden aan het botweefsel 1,2,3,4,5. De stromale niche omvat osteolineagecellen, fibroblasten, zenuwcellen en endotheelcellen6, terwijl de hematopoëtische niche bestaat uit de lymfoïde en myeloïde populaties 1,2,3. Naast het ondersteunen van normale HSC's, kan de micro-omgeving van het beenmerg ook een rol spelen bij de ontwikkeling van hematopoëtische stamcelaandoeningen zoals MDS en AML 7,8,9,10,11. Van mutaties in osteolineagecellen is aangetoond dat ze de ontwikkeling van MDS, AML en andere myeloproliferatieve neoplasmata bevorderen 10,12,13,14.
Myelodysplastische syndromen zijn een groep pre-leukemische aandoeningen die voortkomen uit mutaties in hematopoëtische stamcellen. MDS wordt vaak geassocieerd met een blokkade in HSC-differentiatie en de productie van dysplastische cellen, wat vaak kan leiden tot beenmergfalen. MDS is het meest gediagnosticeerde myeloïde neoplasma in de Verenigde Staten en wordt geassocieerd met een 3-jaarsoverleving van 35%-45%15. MDS wordt vaak geassocieerd met een hoog risico op transformatie naar acute myeloïde leukemie. Dit kan een fatale complicatie zijn, aangezien MDS-afgeleide AML resistent is tegen de meeste therapieën en waarschijnlijk terugvalt. AML dat de novo ontstaat als gevolg van translocaties of mutaties in hematopoëtische stam en voorlopercellen is ook vaak resistent tegen standaard chemotherapie16,17. Aangezien MDS en AML voornamelijk ouderenziekten zijn, waarvan de meerderheid ouder dan 60 jaar wordt gediagnosticeerd, komen de meeste patiënten niet in aanmerking voor curatieve beenmergtransplantaties. Er is dus een grote behoefte om nieuwe regulatoren van ziekteprogressie te identificeren. Aangezien de micro-omgeving van het beenmerg ondersteuning kan bieden aan kwaadaardige cellen14, kan het definiëren van veranderingen in de beenmergniche met ziekteprogressie leiden tot de identificatie van nieuwe therapieën die gericht zijn op het remmen van de remodellering van tumorniches. Er is daarom een grote behoefte aan het identificeren van nieuwe regulatoren van ziekteprogressie. Daartoe is het van cruciaal belang om veranderingen in de stromale celpopulaties van het beenmerg te identificeren en te karakteriseren die ondersteuning kunnen bieden aan de kwaadaardige cellen.
Er zijn verschillende muizenmodellen van AML en MDS gegenereerd die kunnen worden gebruikt om veranderingen in de micro-omgeving van het beenmerg te bestuderen tijdens het begin en de progressie van de ziekte 6,1,19,20,21,22. Hier worden protocollen beschreven om veranderingen in de stromale celpopulaties van het beenmerg te identificeren met behulp van muizenmodellen van retroviraal geïnduceerde AML 6,20, evenals het in de handel verkrijgbare Nup98-HoxD13 (NHD13)-model van MDS naar AML-transformatie met een hoog risico19. Muizen die zijn getransplanteerd met de novo AML-cellen bezwijken binnen 20-30 dagen aan de ziekte. De NHD13-muizen ontwikkelen cytopenieën en beenmergdysplasie rond 15-20 weken, die uiteindelijk verandert in AML, en bijna 75% van de muizen bezwijkt rond 32 weken aan de ziekte. Om de micro-omgevingspopulaties van het muizenmodel in het beenmerg te analyseren, worden botten geoogst, worden beenmerg en botspicules verteerd met behulp van enzymatische spijsvertering en worden de cellen vervolgens verrijkt voor CD45-/Ter119-niet-hematopoëtische populaties door magnetische sortering. Hoewel vergelijkbare analyses eerder zijn beschreven 11,13,22,23,24,25, richten ze zich vaak op het beenmerg of het bot en nemen ze geen cellen uit beide bronnen op in hun analyses. De gecombineerde karakterisering van deze populaties, in combinatie met genexpressie-analyses, kan een uitgebreid inzicht verschaffen in hoe de cellulaire hematopoëtische micro-omgeving ondersteuning biedt voor het ontstaan en de progressie van de ziekte (Figuur 1). Hoewel het hieronder beschreven protocol zich richt op retroviraal geïnduceerd AML-model en een genetisch MDS-model, kunnen deze strategieën gemakkelijk worden aangepast om veranderingen in de beenmergniche van elk muizenmodel van belang te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de University of Rochester University Committee on Animal Resources. Muizen werden gefokt en onderhouden in de dierenverzorgingsfaciliteiten van de Universiteit van Rochester. Om MDS met een hoog risico te modelleren, wordt het in de handel verkrijgbare NHD13-muizenmodel19 gebruikt. In dit model worden stromale beenmergcellen geanalyseerd bij vrouwelijke NHD13-muizen op de leeftijd van 8 weken, vóór het begin van de ziekte. De novo AML wordt gegenereerd zoals eerder beschreven 6,11,20. De oncogenen die worden gebruikt om AML te induceren, zoals MLL-AF9 en NRas, zijn gelabeld met GFP of YFP, waardoor de analyse van de niet-leukemische GFP-beenmergpopulaties mogelijk is met behulp van flowcytometrie. In het kort, vrouwelijke C57BL/6J-muizen van 10 weken oud worden getransplanteerd met muizen GFP/YFP+ AML-cellen en het beenmerg wordt 2 weken na de transplantatie geoogst. Hoewel vrouwelijke muizen in dit onderzoek worden gebruikt voor demonstratiedoeleinden, kan dit protocol worden uitgevoerd met zowel mannelijke als vrouwelijke muizen. Het kan ook worden uitgevoerd met één dijbeen of alle lange botten.
1. Oogsten van beenmerg
OPMERKING: Voor details over het protocol voor het dissectien van dieren, zie Amend et al.26.
- Reinig de vijzel en stamper met 70% ethanol, spoel ze af met gekoelde FACS-buffer (tabel 1) en leg ze op ijs om af te koelen voordat je met de oogst begint. Plaats ook de MACs-buffer (tabel 1) op de bank om deze op kamertemperatuur te laten komen.
- Euthanaseer het dier volgens de richtlijnen en protocollen voor institutionele dierenverzorging en -gebruik.
- Spuit de muis op het werkblad grondig in met 70% ethanol totdat zijn vacht nat is. Til met een pincet en een gebogen schaar de huid op de buik op en maak twee incisies van ongeveer 0,5 mm lang aan beide zijden van de muis, lateraal van de buik. Maak vervolgens een incisie van 0,5 mm distaal van de buik. Trek naar beneden om de huid en vacht van de poten van de muis te verwijderen.
- Plaats een schaar loodrecht op het bekken, druk naar beneden terwijl u het dijbeen met een tang omhoog trekt. De heupkop moet loskomen van het bekken. Scheid het dijbeen en het scheenbeen bij het patellofemorale gewricht. Leg de botten in FACS-buffer in een bord met 6 putjes op ijs.
- Verwijder weefsel van de botten met behulp van weefsel van laboratoriumkwaliteit en plaats de gereinigde botten in een nieuwe plaat met 6 putjes met verse FACS-buffer op ijs.
- Plaats alle botten in de vijzel met 2-5 ml FACS-buffer zodat alle botten in de buffer worden ondergedompeld (pas het volume van de buffer aan op basis van het aantal botten dat u verwerkt). Plet en maal de botten met de stamper in een cirkelvormige beweging totdat het beenmergweefsel vrijkomt.
- Gebruik een spuit van 3 ml om het beenmerg te homogeniseren door de vloeistof uit de mortel omhoog te trekken en weg te spoelen.
- Trek met een spuit van 3 ml de vloeistof uit de vijzel en filtreer deze door een celzeef van 70 μm in een buis van 50 ml op ijs. Spoel de bot-/weefselbrokken van het filter terug in de mortel met FACS-buffer en keer terug naar stap 1.7 om een tweede keer te homogeniseren en te zeven. Dit vormt de beenmergfractie.
- Spoel de resterende botstukken (spicules) terug in de mortel met FACS-buffer en spoel ze in een buis van 15 ml met FACS-buffer om een maximale celopbrengst te garanderen. Dit is de botsplinterfractie.
2. Vertering van beenmerg
- Centrifugeer het beenmerg bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Decanteer en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer het beenmerg in 2 ml van het beenmergverteringsmengsel (tabel 1) en breng het over in een buisje van 15 ml. Incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten op een rotator.
- Voeg 10 ml FACS-buffer toe om de enzymatische vertering te stoppen. Filtreer het mengsel door een celzeef van 70 μm in een nieuw buisje van 50 ml.
- Pellet het mengsel op 400 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C.
- Resuspendeer de beenmergkorrel in 1 ml RBC-lysisbuffer (zie materiaaltabel). Incubeer gedurende 4 minuten op ijs.
- Voeg 10 ml FACS-buffer toe om de lysis te stoppen. Filtreer het mengsel door een celzeef van 70 μm in een nieuw buisje van 50 ml.
- Pellet het mengsel op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 100 μL FACS-buffer.
3. Vertering van botspicules
- Draai de botspicules uit stap 1.9 en laat ze bezinken. Decanteer het supernatans en bewaar het bot aan de onderkant.
- Resuspendeer de botspicules in 1 ml van het botspicule-verteringsmengsel (tabel 1).
- Plaats de buizen gedurende 60 minuten op een buisrotator bij 37 °C.
- Voeg 10 ml FACS-buffer toe om de enzymatische vertering te stoppen. Filtreer het mengsel door een celzeef van 70 μm in het buisje van 50 ml met RBC-gelyseerd en verteerd beenmerg.
4. Kleuring
- Meng voorzichtig de botspicules en de beenmergcelsuspensie.
- Gebruik 10 μL van de celsuspensie om het aantal levende cellen op een hemocytometer te tellen met behulp van 0,4% kleuring op basis van trypanblauw, zoals beschreven in gepubliceerde protocollen27. Verzamel 50.000 cellen voor een ongekleurde controle van de celsuspensie.
- Centrifugeer de resterende cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatans en resuspendeer ze in 100 μL FACS-buffer.
OPMERKING: Antilichamen kunnen worden getitreerd om de ideale verdunning te bepalen. De selectie van antilichamen (epitopen en fluorochromen) kan worden aangepast. - Voor kleuring met antilichamen voor magnetische depletie voegt u FC Block (1 μL per 25 x 106 cellen), CD45-APC (10 μL per 25 x 106 cellen) en Ter119-APC (4 μL per 25 x 106 cellen) toe (zie Materiaaltabel).
- Incubeer 20 minuten op ijs. Wassen met FACS-buffer, 50.000 cellen (~50 μL) verwijderen voor de APC-gekleurde controle, centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en resuspenderen in 100 μL FACS-buffer.
- Voor het kleuren van de celsuspensie met microbeads voor magnetische depletie, voeg mIgG (8 μL per 25 x 106 cellen) en Anti-APC microbeads (20 μL per 25 x 106 cellen) toe (zie Tabel met materialen).
- Incubeer 20 minuten op ijs. Wassen met 10 ml FACS-buffer, centrifugeren op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
5. Uitputting van het monster door magnetische sortering
NOTITIE: Deze stap wordt uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare handmatige magnetische scheider volgens de instructies van de fabrikant. Deze stap kan ook worden uitgevoerd met een geautomatiseerde scheider (zie Tabel met materialen).
- Bereid de LD-kolom voor door deze te wassen met 2 ml MACs-buffer (tabel 1). Gooi het effluent weg en vervang de opvangbuis.
- Resuspendeer maximaal 1 x 108 cellen in MACs-buffer en filtreer ze door een reageerbuis van 5 ml met een celzeefdop van 35 μm.
- Plaats de LD-kolom op de magneetscheiderstandaard. Plaats een reageerbuis van 5 ml onder de kolom om het eluaat op te vangen.
- Voeg de celsuspensie toe aan de voorbereide LD-kolom. Laat de negatieve fractie doorstromen in de opvangbuis. Was de kolom twee keer met 1 ml MACs-buffer en verzamel het eluaat in dezelfde buis. Dit is de negatieve fractie die in stap 5.6 hieronder wordt gebruikt.
- Verwijder de LD-kolom van de magnetische scheidingsstandaard en plaats deze op een nieuwe reageerbuis van 5 ml. Gebruik een pipet om 3 ml buffer in de kolom te doseren om cellen die positief zijn gelabeld weg te spoelen met behulp van de kolomplunjer.
- Centrifugeer de negatieve en positieve fracties bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer ze in 100 μL FACS-buffer.
- Tel 10 μL van de negatieve en positieve fracties met 0,4% Trypanblauw. De volumes voor de onderstaande osteo-analyse/endotheelpaneelkleuring zijn gebaseerd op dit celgetal.
- Gebruik 50.000 levende cellen uit de positieve fractie voor flowcytometrie gating controles.
6. Osteo-analyse/endotheelpaneelvlek
OPMERKING: Compensatie moet worden uitgevoerd volgens standaard flowcytometrieprotocollen, inclusief alle geschikte kleurings- en gatingcontroles.
- Voor kleuring van de CD45/Ter119 negatieve fractie (1 μL van elk antilichaam per 1 x 106 cellen) voegt u CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE en CD140a-PE-Cy5 toe (zie Materiaaltabel).
- Incubeer 20 minuten op ijs. Wassen met 2 ml FACS-buffer en vervolgens centrifugeren op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Voeg 1 ml FACS-buffer en een verdunning van 1:1000 PI toe voor levende/dode kleuring en filtreer het monster vervolgens door een reageerbuis van 5 ml met een celzeefdop van 35 μm.
- Analyseer de cellen op een meerkleurige flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit artikel beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde methode voor het analyseren van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg, zoals de endotheel- en mesenchymale stromale cellen, uit MDS- en leukemie-muizenmodellen (Figuur 1). Figuur 2 toont de poortstrategie voor de detectie van populaties van belang, te beginnen met de selectie van cellen (P1) in de verteerde en CD45/Ter119 verarmde fractie via het voorwaartse en zijwaartse verspreidingsprofiel. Voorbeelden van gating van cellen in een leukemiemonster worden weergegeven in P1 (Figuur 2A). Singlets worden geselecteerd en doubletten worden uitgesloten van deze analyse, P2 (Figuur 2B). Figuur 2C toont poorten om propidiumjodiumnegatieve levende cellen te selecteren, P3. Om zich te concentreren op niet-hematopoëtische stromale populaties, cellen die CD45-/Ter119-, P4 (APC, Y-as) vs. SSC-A zijn geselecteerd (Figuur 2D). Deze initiële poortstrategie is gebruikelijk voor alle monsters die worden geanalyseerd.
Het leukemie-muizenmodel wordt gebruikt om gating voor endotheelcellen te illustreren in figuren 2E-G. Figuur 2E toont CD31 positief (Pe-Cy7, Y-as) vs. SSC-A-cellen in een niet-kankercontrolemuis en een leukemische muis, omheind via P4. Cellen die positief zijn gelabeld met CD31 zijn endotheelcellen, P5. In figuur 2F, gated through P5, worden arteriolaire endotheelcellen geïdentificeerd als CD45-Ter119-CD31+Sca1+, P6, en sinusvormige endotheelcellen worden geïdentificeerd als CD45-Ter119-CD31+Sca1-, P7 (BV421, Y-as) vs. SSC-A.
Hoewel deze analyse zich richt op niet-leukemische micro-omgevingscellen in het beenmerg, is het ook nuttig om de tumorbelasting te bepalen. Dit kan worden gedaan met een klein deel van het onverteerde/niet-uitgeputte monster voordat het experiment wordt gestart. In deze experimentele controle (stippellijnen) Figuur 2G, P8 vertegenwoordigt de tumorbelasting in het monster en P9 vertegenwoordigt de niet-kankercellen.
Het MDS-muizenmodel wordt gebruikt om de analyse van mesenchymale stromale cellen in figuur 2H-J te illustreren. Figuur 2H toont CD31-negatief (Pe-Cy7, Y-as) vs. SSC-A-cellen, omheind via P4. Mesenchymale stromale celpopulaties in een wildtype controlemuis en MDS-muis zijn weergegeven in figuur 2I. Omheind door P10 worden mesenchymale stromale cellen geïdentificeerd als CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+, P113 (Pe, Y-as; Pe-Cy5, X-as). De experimentele controle (stippellijnen), Figuur 2J toont voorbeelden van enkelkleurige poortcontroles, CD51 enkele kleuring en CD140a enkele kleuring die worden gebruikt om de MSC's te poorten die worden getoond in de experimentele monsters in Figuur 2I.
Deze gegevens geven aan dat arteriolaire endotheelcellen aanzienlijk uitbreiden in de AML-micro-omgeving, met een gelijktijdig verlies in de sinusvormige endotheelpopulaties (Figuur 2F), in overeenstemming met eerdere studies met van patiënten afgeleide xenotransplantaten bij immunodeficiënte muizen28. Het is waarschijnlijk dat de kleine expansie in de mesenchymale stromale cellen die wordt waargenomen bij de NHD13-muizen op de leeftijd van 8 weken (Figuur 2I) kan toenemen na 16-20 weken, wanneer deze muizen kenmerken van MDS25 beginnen te vertonen. Hoewel alleen het leukemiemodel wordt gebruikt om de endotheelcelpopulatie te illustreren en het MDS-muizenmodel wordt gebruikt om de mesenchymale stromale celpopulaties te illustreren, kunnen vergelijkbare kleurings- en gatingstrategieën worden gebruikt om de verschillende micro-omgevingspopulaties in een van deze modellen te analyseren, of zelfs in elk genetisch gemanipuleerd muizenmodel van belang.
Figuur 1: Isolatie van stromale cellen in het beenmerg. Schematisch toont het proces van het isoleren van niet-hematopoëtische beenmergstromale cellen van controle- en leukemische muizen. In het kort worden botspicules en beenmerg afzonderlijk verteerd en vervolgens gepoold. De CD45-Ter119-populatie wordt verrijkt door magnetische sortering en gekleurd met antilichaampanelen tegen populaties van belang, zoals mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen. De cellen worden vervolgens geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gatingstrategie voor niet-hematopoëtische beenmerg- en stromale cellen. (A-D) Flowcytometrie gating-strategie gebruikt om verteerde, CD45-/Ter119-, niet-hematopoëtische populaties (P4) te selecteren in zowel het leukemie- als het MDS-muizenmodel. (E) Leukemie-endotheelcellen in het beenmerg (P5, CD31+) kunnen worden onderverdeeld in (F) Sca1+ arteriolaire (P6) of Sca1-sinusvormige endotheelcellen (P7). (G) Leukemie-implantatie in een AML-monster waarbij P8 staat voor implantatie en P9 voor niet-kankercellen. Stippellijnen geven aan dat dit perceel een experimentele controle is. (H) Gated via P4, MDS beenmerg CD31-cellen, P10 (I) Mesenchymale stromale cellen (CD51+/CD140a+, P11). (J) Voorbeeld van enkelkleurige poortcontroles, CD51 (links) en CD140a (rechts) die worden gebruikt om de poorten voor mesenchymale stromale cellen in (I) te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Reagens | Concentratie | Toe te voegen bedrag |
| FACS-buffer | HBSS | 10x | 100 ml |
| EDTA | 0,5 m | 4 ml | |
| Foetaal runderserum | - | 50 ml | |
| Water | - | 848 ml | |
| Mengsel van beenmergvertering | HBSS | 1x | 2 ml |
| DNase 1 | 1 μg/ml in 1x DPBS | 20 μL | |
| Dispase II Poeder | - | 4 mg | |
| Collagenase Type IV | - | 2 mg | |
| Botspicule spijsverteringsmengsel | DPBS | 1x | 320 ml |
| Collagenase Type 1 | - | 1 gr | |
| Foetaal runderserum | - | 80 ml | |
| MAC's bufferen | BSA | 66 g/mol | 5 gr |
| DPBS | 10x | 100 ml | |
| EDTA | 0,5 m | 4 ml | |
| Water | - | 896 L |
Tabel 1: Samenstelling van de oplossingen en buffers die in dit onderzoek zijn gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modellen voor leukemie bij muizen zijn op grote schaal gebruikt om intrinsieke en nichegestuurde signalen van cellen te identificeren die de progressie van agressieve myeloïde leukemie bevorderen 6,19,21. Hier wordt een uitgebreid op flowcytometrie gebaseerd protocol gepresenteerd om de cellulaire samenstelling van de micro-omgeving van het beenmerg in muizenmodellen van MDS en AML te definiëren.
Voorafgaand aan het verkrijgen van flowcytometrische gegevens van experimentele monsters, is het belangrijk om zorgvuldig te compenseren voor fluorescentieoverlapping. Het is ook essentieel om alle geschikte kleurings- en poortcontroles op te nemen. Deze stappen stellen de onderzoeker in staat om te bevestigen dat positieve of negatieve antilichaamkleuring een nauwkeurige expressie van celmarkers van belang vertegenwoordigt en geen artefact is van fluorescentie, spectrale overlap of autofluorescentie. Hoewel dit protocol geselecteerde markers op het celoppervlak beschrijft, kunnen de antilichaampanels worden uitgebreid op basis van experimentele behoefte. CD144 (Ve-Cadherin) kan bijvoorbeeld in vivo worden toegediend voordat de muizen worden geoogst en kan dienen als een extra specifieke marker van endotheelcellen 5,29. Hoewel de hier aangegeven fluoroforen en antilichaamklonen kunnen worden gewijzigd, moeten titraties worden uitgevoerd om hun ideale verdunning te bepalen. Om alle celpopulaties in de beenmergniche categorisch te definiëren, kan single-cell RNA-sequencing worden gebruikt om het beenmergnichelandschap vast te stellen tijdens de initiatie en progressie van MDS/AML 23,24,30.
Het is van cruciaal belang om het monster zorgvuldig voor te bereiden volgens de stappen die in dit protocol worden beschreven. Bij het homogeniseren van de botten is het van cruciaal belang dat de vijzel en stamper worden gekoeld en dat alle stappen op ijs worden uitgevoerd om celdood te voorkomen en een hoog celherstel te garanderen. Het is erg belangrijk om al het weefsel rond de botten te verwijderen voordat het wordt gehomogeniseerd om besmetting van andere ongewenste celtypen te voorkomen. Tijdens RBC-lysis en spijsvertering is het belangrijk om de enzymatische reactie te stoppen met een geschikte hoeveelheid FACS-buffer en grondig te resuspenderen in een verse buffer, anders zullen cellen blijven verteren en uiteindelijk afsterven.
Het scheiden van de bot- en beenmergfracties is essentieel omdat de botspicules een andere mix van enzymen nodig hebben voor de spijsverteringsbuffer en meer tijd nodig hebben om te verteren. Bij botvertering is collagenase type 1 nuttig voor het verteren van collagenasefibrillen die vaak worden aangetroffen in extracellulaire matrix en collageenvezels31. Bovendien zullen sommige beenmergcellen die zich dicht bij het endosteum bevinden, na homogenisatie aan het bot blijven vastzitten en alleen vrijkomen door enzymatische vertering. Bij het verteren van beenmerg wordt collagenase type IV gebruikt om het basale membraan van epitheel- en endotheelcellen in het beenmerg te verteren32, terwijl dispase voornamelijk fibronectinesplitst 31. Het beenmerg heeft minder tijd nodig om te verteren omdat de associaties tussen cellen en matrix zwakker zijn. Het incuberen van de beenmergfractie in vergelijkbare omstandigheden kan de populaties van belang schaden. Het gebruik van twee verschillende spijsverteringsbuffers verhoogt het aantal huidcellen dat kan worden gedetecteerd aanzienlijk, waardoor een grotere dataset kan worden geanalyseerd.
De meeste beschikbare protocollen om micro-omgevingspopulaties van muizen in het beenmerg te analyseren, gebruiken een injectiespuit om het beenmerg alleen van de lange botten te spoelen13,24. De huidige methode voor het verpletteren van botten biedt de mogelijkheid om gegevens van andere botten, zoals het bekken, te verkrijgen, de voorbereidingstijd van het monster aanzienlijk te verkorten en de kans op verwondingen met scherpe naalden te verkleinen. Aangezien het bot bestaat uit rijpe osteoblasten en andere celpopulaties die ondersteuning kunnen bieden aan normale en kwaadaardige hematopoëtische cellen, maakt deze methode om cellen uit de botspicules op te nemen een nauwkeurigere weergave van de micro-omgeving van het beenmerg in het monster mogelijk. Hoewel in een eerdere studie beenmerg en botspicules afzonderlijk werden verteerd11, toonde het geen kleuring van osteolineage en endotheelcellen in hetzelfde monster aan. Een tweede studie maakte gebruik van in de handel verkrijgbare gepatenteerde enzymmengsels om beenmerg en botspicules te verteren23, en analyseerde de gegevens met behulp van de aanzienlijk duurdere single-cell RNA-sequencing-technologie. Deze methode van verrijking voor CD45-/Ter119-cellen selecteert voor cellen van belang en vermindert de tijd die nodig is om gegevens op de flowcytometer te verkrijgen aanzienlijk. Dus, in vergelijking met andere state-of-the-art methoden zoals single-cell RNA-sequencing, is deze op flowcytometrie gebaseerde methode toegankelijker, kosteneffectiever en vereist geen geavanceerde analyse door getrainde bio-informatici 23,24,30.
Het is belangrijk op te merken dat dit protocol kan worden gebruikt om de micro-omgeving van het beenmerg te karakteriseren, niet alleen van elk van de beschikbare muizenmodellen van MDS en AML, maar van elk genetisch muismodel. Vergelijkbare methoden kunnen ook effectief zijn bij het analyseren van de veranderingen in de muizenbeenmergniche van van patiënten afgeleide xenotransplantaat (PDX)-modellen. Deze methoden kunnen nuttig zijn voor studies die gericht zijn op het bepalen van de mechanismen waarmee MDS/AML hun beenmergniche beïnvloeden. Gezien de technische uitdagingen die gepaard gaan met het bemonsteren van grote hoeveelheden beenmerg van menselijke patiënten, zijn deze analyses van muizenmodellen een effectief hulpmiddel om het begrip van de kwaadaardige micro-omgeving van het beenmerg te vergroten en de rol ervan in de ziekteprogressie te definiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten gemeld.
Acknowledgments
We willen de URMC Flow Cytometry Core bedanken. Dit werk werd ondersteund door de American Society of Hematology Scholar Award, de Leukemia Research Foundation Award en NIH-beurzen R01DK133131 en R01CA266617 toegekend aan JB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
- Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
- Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
- Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
- Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
- Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
- Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
- Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
- Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W.
- Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
- Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
- Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
- Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
- Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
- Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).
