Здесь представлен подробный протокол выделения и характеристики микросредовых популяций костного мозга по мышиным моделям миелодиспластических синдромов и острого миелоидного лейкоза. Этот метод выявляет изменения в некроветворной нише костного мозга, включая эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки, с прогрессированием заболевания.
Микроокружение костного мозга состоит из отдельных клеточных популяций, таких как мезенхимальные стромальные клетки, эндотелиальные клетки, клетки остеолинии и фибробласты, которые обеспечивают поддержку гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Помимо поддержания нормальных ГСК, микроокружение костного мозга также играет роль в развитии заболеваний гемопоэтических стволовых клеток, таких как миелодиспластические синдромы (МДС) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). МДС-ассоциированные мутации в ГСК приводят к блокированию дифференцировки и прогрессирующей недостаточности костного мозга, особенно у пожилых людей. МДС часто может прогрессировать до резистентного к терапии ОМЛ, заболевания, характеризующегося быстрым накоплением незрелых миелоидных бластов. Известно, что микроокружение костного мозга изменяется у пациентов с этими миелоидными новообразованиями. В данной работе описан комплексный протокол по выделению и фенотипической характеристике клеток микроокружения костного мозга из мышиных моделей миелодиспластического синдрома и острого миелоидного лейкоза. Выделение и характеристика изменений в популяциях ниши костного мозга может помочь определить их роль в инициации и прогрессировании заболевания и может привести к разработке новых терапевтических средств, нацеленных на способствующие раку изменения в стромальных популяциях костного мозга.
Микроокружение костного мозга состоит из гемопоэтических клеток, негемопоэтических стромальных клеток и внеклеточного матрикса 1,2. Это микроокружение может способствовать самообновлению гемопоэтических стволовых клеток, регулировать дифференцировку линий и обеспечивать структурную и механическую поддержку костной ткани 1,2,3,4,5. Стромальная ниша включает костно-линейные клетки, фибробласты, нервные клетки и эндотелиальные клетки6, в то время как гемопоэтическая ниша состоит из лимфоидной и миелоидной популяций 1,2,3. В дополнение к поддержанию нормальных ГСК, микроокружение костного мозга также может играть роль в развитии заболеваний гемопоэтических стволовых клеток, таких как МДС и ОМЛ 7,8,9,10,11. Было показано, что мутации в клетках остеолинии способствуют развитию МДС, ОМЛ и других миелопролиферативных новообразований 10,12,13,14.
Миелодиспластические синдромы представляют собой группу предлейкозных заболеваний, которые возникают в результате мутаций в гемопоэтических стволовых клетках. МДС часто ассоциируется с блокированием дифференцировки ГСК и выработкой диспластических клеток, что часто может привести к недостаточности костного мозга. МДС является наиболее часто диагностируемым миелоидным новообразованием в Соединенных Штатах и ассоциируется с 3-летней выживаемостью 35%-45%15. МДС часто ассоциируется с высоким риском трансформации в острый миелоидный лейкоз. Это может быть фатальным осложнением, так как ОМЛ, вызванный МДС, устойчив к большинству методов лечения и склонен к рецидиву. ОМЛ, возникающий de novo из-за транслокаций или мутаций в кроветворном стволе и предшественниках, также часто устойчив к стандартной химиотерапии16,17. Поскольку МДС и ОМЛ являются в первую очередь заболеваниями пожилых людей, большинство из которых диагностируются в возрасте старше 60 лет, большинство пациентов не имеют права на лечебную трансплантацию костного мозга. Таким образом, существует значительная потребность в выявлении новых регуляторов прогрессирования заболевания. Поскольку микроокружение костного мозга может обеспечивать поддержку злокачественных клеток14, определение изменений в нише костного мозга с прогрессированием заболевания может привести к выявлению новых терапевтических средств, направленных на ингибирование ремоделирования опухолевых ниш. Таким образом, существует значительная потребность в выявлении новых регуляторов прогрессирования заболевания. С этой целью крайне важно идентифицировать и охарактеризовать изменения в популяциях стромальных клеток костного мозга, которые могут обеспечить поддержку злокачественным клеткам.
Было создано несколько мышиных моделей ОМЛ и МДС, которые могут быть использованы для изучения изменений микроокружения костного мозга во время инициации и прогрессирования заболевания 6,1,19,20,21,22. Описаны протоколы выявления изменений в популяциях стромальных клеток костного мозга с использованием мышиных моделей ретровирусно индуцированного ОМЛ 6,20, а также коммерчески доступной модели трансформации МДС в ОМЛ высокого риска Nup98-HoxD13 (NHD13). Мыши, пересаженные клетками ОМЛ de novo, умирают от болезни через 20-30 дней6. У мышей NHD13 развиваются цитопения и дисплазия костного мозга примерно через 15-20 недель, которая в конечном итоге трансформируется в ОМЛ, и почти 75% мышей умирают от болезни примерно на 32 неделе. Для анализа популяций микроокружения костного мозга мышиной модели кости собирают кости, переваривают костный мозг и костные спикулы с помощью ферментативного расщепления, а затем клетки обогащают для CD45-/Ter119-негемопоэтических популяций с помощью магнитной сортировки. Несмотря на то, что подобные анализы были описаны ранее 11,13,22,23,24,25, они часто фокусируются либо на костном мозге, либо на костной ткани и не включают в свои анализы клетки из обоих источников. Комбинированная характеристика этих популяций в сочетании с анализом экспрессии генов может обеспечить всестороннее понимание того, как клеточное кроветворное микроокружение обеспечивает поддержку инициации и прогрессирования заболевания (рис. 1). В то время как протокол, описанный ниже, фокусируется на ретровирусно-индуцированной модели ОМЛ и генетической модели МДС, эти стратегии могут быть легко адаптированы для изучения изменений в нише костного мозга любой интересующей нас мышиной модели.
Модели мышиного лейкоза широко использовались для идентификации внутриклеточных и нишевых сигналов, способствующих прогрессированию агрессивного миелоидного лейкоза 6,19,21. Представлен комплексный протокол на основе проточной цитом…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить URMC Flow Cytometry Core. Эта работа была поддержана премией Американского общества гематологов, премией Фонда исследования лейкемии и грантами NIH R01DK133131 и R01CA266617 присуждены J.B.
1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Incubator | BINDER | C150-UL | |
Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |