Summary
Здесь представлен подробный протокол выделения и характеристики микросредовых популяций костного мозга по мышиным моделям миелодиспластических синдромов и острого миелоидного лейкоза. Этот метод выявляет изменения в некроветворной нише костного мозга, включая эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки, с прогрессированием заболевания.
Abstract
Микроокружение костного мозга состоит из отдельных клеточных популяций, таких как мезенхимальные стромальные клетки, эндотелиальные клетки, клетки остеолинии и фибробласты, которые обеспечивают поддержку гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Помимо поддержания нормальных ГСК, микроокружение костного мозга также играет роль в развитии заболеваний гемопоэтических стволовых клеток, таких как миелодиспластические синдромы (МДС) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). МДС-ассоциированные мутации в ГСК приводят к блокированию дифференцировки и прогрессирующей недостаточности костного мозга, особенно у пожилых людей. МДС часто может прогрессировать до резистентного к терапии ОМЛ, заболевания, характеризующегося быстрым накоплением незрелых миелоидных бластов. Известно, что микроокружение костного мозга изменяется у пациентов с этими миелоидными новообразованиями. В данной работе описан комплексный протокол по выделению и фенотипической характеристике клеток микроокружения костного мозга из мышиных моделей миелодиспластического синдрома и острого миелоидного лейкоза. Выделение и характеристика изменений в популяциях ниши костного мозга может помочь определить их роль в инициации и прогрессировании заболевания и может привести к разработке новых терапевтических средств, нацеленных на способствующие раку изменения в стромальных популяциях костного мозга.
Introduction
Микроокружение костного мозга состоит из гемопоэтических клеток, негемопоэтических стромальных клеток и внеклеточного матрикса 1,2. Это микроокружение может способствовать самообновлению гемопоэтических стволовых клеток, регулировать дифференцировку линий и обеспечивать структурную и механическую поддержку костной ткани 1,2,3,4,5. Стромальная ниша включает костно-линейные клетки, фибробласты, нервные клетки и эндотелиальные клетки6, в то время как гемопоэтическая ниша состоит из лимфоидной и миелоидной популяций 1,2,3. В дополнение к поддержанию нормальных ГСК, микроокружение костного мозга также может играть роль в развитии заболеваний гемопоэтических стволовых клеток, таких как МДС и ОМЛ 7,8,9,10,11. Было показано, что мутации в клетках остеолинии способствуют развитию МДС, ОМЛ и других миелопролиферативных новообразований 10,12,13,14.
Миелодиспластические синдромы представляют собой группу предлейкозных заболеваний, которые возникают в результате мутаций в гемопоэтических стволовых клетках. МДС часто ассоциируется с блокированием дифференцировки ГСК и выработкой диспластических клеток, что часто может привести к недостаточности костного мозга. МДС является наиболее часто диагностируемым миелоидным новообразованием в Соединенных Штатах и ассоциируется с 3-летней выживаемостью 35%-45%15. МДС часто ассоциируется с высоким риском трансформации в острый миелоидный лейкоз. Это может быть фатальным осложнением, так как ОМЛ, вызванный МДС, устойчив к большинству методов лечения и склонен к рецидиву. ОМЛ, возникающий de novo из-за транслокаций или мутаций в кроветворном стволе и предшественниках, также часто устойчив к стандартной химиотерапии16,17. Поскольку МДС и ОМЛ являются в первую очередь заболеваниями пожилых людей, большинство из которых диагностируются в возрасте старше 60 лет, большинство пациентов не имеют права на лечебную трансплантацию костного мозга. Таким образом, существует значительная потребность в выявлении новых регуляторов прогрессирования заболевания. Поскольку микроокружение костного мозга может обеспечивать поддержку злокачественных клеток14, определение изменений в нише костного мозга с прогрессированием заболевания может привести к выявлению новых терапевтических средств, направленных на ингибирование ремоделирования опухолевых ниш. Таким образом, существует значительная потребность в выявлении новых регуляторов прогрессирования заболевания. С этой целью крайне важно идентифицировать и охарактеризовать изменения в популяциях стромальных клеток костного мозга, которые могут обеспечить поддержку злокачественным клеткам.
Было создано несколько мышиных моделей ОМЛ и МДС, которые могут быть использованы для изучения изменений микроокружения костного мозга во время инициации и прогрессирования заболевания 6,1,19,20,21,22. Описаны протоколы выявления изменений в популяциях стромальных клеток костного мозга с использованием мышиных моделей ретровирусно индуцированного ОМЛ 6,20, а также коммерчески доступной модели трансформации МДС в ОМЛ высокого риска Nup98-HoxD13 (NHD13). Мыши, пересаженные клетками ОМЛ de novo, умирают от болезни через 20-30 дней6. У мышей NHD13 развиваются цитопения и дисплазия костного мозга примерно через 15-20 недель, которая в конечном итоге трансформируется в ОМЛ, и почти 75% мышей умирают от болезни примерно на 32 неделе. Для анализа популяций микроокружения костного мозга мышиной модели кости собирают кости, переваривают костный мозг и костные спикулы с помощью ферментативного расщепления, а затем клетки обогащают для CD45-/Ter119-негемопоэтических популяций с помощью магнитной сортировки. Несмотря на то, что подобные анализы были описаны ранее 11,13,22,23,24,25, они часто фокусируются либо на костном мозге, либо на костной ткани и не включают в свои анализы клетки из обоих источников. Комбинированная характеристика этих популяций в сочетании с анализом экспрессии генов может обеспечить всестороннее понимание того, как клеточное кроветворное микроокружение обеспечивает поддержку инициации и прогрессирования заболевания (рис. 1). В то время как протокол, описанный ниже, фокусируется на ретровирусно-индуцированной модели ОМЛ и генетической модели МДС, эти стратегии могут быть легко адаптированы для изучения изменений в нише костного мозга любой интересующей нас мышиной модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по ресурсам животных Университета Рочестера. Мыши были выведены и содержались в учреждениях по уходу за животными в Университете Рочестера. Для моделирования МДС высокого риска используется коммерчески доступная мышиная модельNHD13 19. В этой модели стромальные клетки костного мозга анализируются у самок мышей NHD13 в возрасте 8 недель, до начала заболевания. De novo AML генерируется, как описано ранее 6,11,20. Онкогены, используемые для индуцирования ОМЛ, такие как MLL-AF9 и NRas, помечены GFP или YFP, что позволяет анализировать нелейкозные популяции GFP-костного мозга с помощью проточной цитометрии. Вкратце, 10-недельным самкам мышей C57BL/6J трансплантируют мышиные клетки GFP/YFP+ AML, а костный мозг извлекают через 2 недели после трансплантации. В то время как самки мышей используются в этом исследовании в демонстрационных целях, этот протокол может быть проведен как с самцами, так и с самками мышей. Она также может быть проведена с использованием как одной бедренной кости, так и всех длинных костей.
1. Забор костного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о протоколе вскрытия животных, пожалуйста, обратитесь к Amend et al.26.
- Очистите ступку и пестик 70% этанолом, промойте их охлажденным буфером FACS (Таблица 1) и положите на лед для охлаждения перед началом сбора урожая. Кроме того, поместите буфер MACs (Таблица 1) на стол, чтобы он нагрелся до комнатной температуры.
- Усыпляйте животное в соответствии с рекомендациями и протоколами по уходу за животными и их использованию.
- На столешнице тщательно опрыскайте мышь 70% этанолом, пока ее шерсть не станет влажной. С помощью щипцов и изогнутых ножниц поднимите кожу на животе и сделайте два надреза длиной примерно 0,5 мм с обеих сторон мыши, сбоку от живота. Далее делают разрез 0,5 мм дистальнее живота. Потяните вниз, чтобы удалить кожу и шерсть с лапок мыши.
- Расположите ножницы перпендикулярно тазу, надавите при этом щипцами на бедренную кость. Головка бедренной кости должна отделяться от таза. Отделите бедренную и большеберцовую кости в пателлофеморальном суставе. Поместите кости в буфер FACS в 6-луночную тарелку на льду.
- Удалите ткань из костей с помощью лабораторной ткани и поместите очищенные кости в новую 6-луночную пластину со свежим буфером FACS на льду.
- Поместите все кости в ступку с 2-5 мл буфера FACS так, чтобы все кости были погружены в буфер (отрегулируйте объем буфера в зависимости от того, сколько костей вы обрабатываете). Измельчите и измельчите косточки пестиком круговыми движениями до тех пор, пока ткань костного мозга не освободится.
- С помощью шприца объемом 3 мл гомогенизируйте костный мозг, вытягивая и смывая жидкость из раствора.
- С помощью шприца объемом 3 мл вытащите жидкость из раствора и профильтруйте ее через ситечко с ячейками 70 мкм в пробирку объемом 50 мл на льду. Промойте кусочки кости/ткани из фильтра обратно в раствор с буфером FACS и вернитесь к шагу 1.7 для гомогенизации и процеживания во второй раз. Это фракция костного мозга.
- Промойте оставшиеся костные кусочки (спикулы) обратно в раствор с буфером FACS и промойте их в пробирку объемом 15 мл с использованием буфера FACS, чтобы обеспечить максимальный выход клеток. Это фракция костных спикул.
2. Пищеварение костного мозга
- Центрифугируют костный мозг при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Сцедите и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте костный мозг в 2 мл смеси для переваривания костного мозга (табл. 1) и переложите ее в пробирку объемом 15 мл. Инкубируют при 37 °C в течение 45 мин на вращателе.
- Добавьте 10 мл буфера FACS, чтобы остановить ферментативное расщепление. Процедите смесь через ситечко с ячейками 70 мкм в новую пробирку объемом 50 мл.
- Гранулируйте смесь при 400 x g в течение 7 мин при 4 °C.
- Ресуспендант гранулы костного мозга в 1 мл лизисного буфера эритроцитов (см. таблицу материалов). Выдерживать 4 мин на льду.
- Добавьте 10 мл буфера FACS, чтобы остановить лизис. Процедите смесь через ситечко с ячейками 70 мкм в новую пробирку объемом 50 мл.
- Гранулируйте смесь при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл буфера FACS.
3. Переваривание костных спикул
- Вкрутите костные спикулы, начиная с шага 1.9, и дайте им осесть. Сцедите надосадочную жидкость и сохраните кость на дне.
- Ресуспендировать костные спикулы в 1 мл смеси для переваривания костных спикул (табл. 1).
- Поместите пробирки на вращатель пробирок на 60 минут при температуре 37 °C.
- Добавьте 10 мл буфера FACS, чтобы остановить ферментативное расщепление. Процедите смесь через ситечко с ячейками 70 мкм в пробирку объемом 50 мл, содержащую эритроциты, лизированные и переваренные костный мозг.
4. Окрашивание
- Аккуратно смешайте костные спикулы и суспензию клеток костного мозга.
- Используйте 10 мкл клеточной суспензии для подсчета количества живых клеток на гемоцитометре с использованием 0,4% окрашивания на основе трипанового синего, как описано в опубликованных протоколах27. Соберите 50 000 клеток для неокрашенного контроля из клеточной суспензии.
- Центрифугируют оставшиеся клетки при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно поместите ее в 100 мкл буфера FACS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела могут быть титрованы для определения идеального разведения. Выбор антител (эпитопов и флуорохромов) можно настроить. - Для окрашивания антителами для магнитного истощения добавляют FC Block (1 мкл на 25 x 106 клеток), CD45-APC (10 мкл на 25 x 106 клеток) и Ter119-APC (4 мкл на 25 x 106 клеток) (см. таблицу материалов).
- Инкубировать на льду 20 мин. Промыть буфером FACS, удалить 50 000 клеток (~50 мкл) для контроля окрашивания APC, центрифугировать при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C и ресуспендировать в 100 мкл буфера FACS.
- Для окрашивания клеточной суспензии микрогранулами для магнитного истощения добавляют микрогранулы mIgG (8 мкл на 25 x 106 клеток) и Anti-APC (20 мкл на 25 x 106 клеток) (см. таблицу материалов).
- Инкубировать на льду 20 мин. Промыть буфером FACS объемом 10 мл, центрифугировать при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
5. Истощение образца магнитной сортировкой
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется с помощью имеющегося в продаже ручного магнитного сепаратора в соответствии с инструкциями производителя. Этот шаг также может быть выполнен с помощью автоматического сепаратора (см. Таблицу материалов).
- Подготовьте колонку ЛД, промыв ее 2 мл буфера ПДК (табл. 1). Выбросьте стоки и замените сборную трубку.
- Ресуспендируйте до 1 x 10,8 ячеек в буфере MACs и отфильтруйте их через пробирку объемом 5 мл с крышкой сетчатого фильтра 35 мкм.
- Поместите колонну LD на подставку магнитного сепаратора. Поместите пробирку объемом 5 мл под колонку для сбора элюата.
- Добавьте клеточную суспензию в подготовленный столбик ЛД. Дайте отрицательной фракции протечь в сборную трубку. Промойте колонку дважды 1 мл буфера ПДК, собрав элюат в ту же пробирку. Это отрицательная дробь, используемая в шаге 5.6 ниже.
- Снимите колонку LD с подставки магнитного сепаратора и поместите ее в новую пробирку объемом 5 мл. С помощью пипетки дозируйте 3 мл буфера в колонку, чтобы вымыть клетки, которые были положительно помечены, с помощью поршня колонки.
- Центрифугируют отрицательную и положительную фракции при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C. Ресуспендируйте их в 100 мкл буфера FACS.
- Отсчитайте 10 мкл отрицательной и положительной фракций с 0,4% трипанового синего. Объемы для остеоанализа/окрашивания эндотелиальных панелей, приведенные ниже, будут основаны на этом количестве клеток.
- Используйте 50 000 живых клеток из положительной фракции для управления стробированием методом проточной цитометрии.
6. Остеоанализ/окрашивание эндотелиальной панели
ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсация должна выполняться в соответствии со стандартными протоколами проточной цитометрии, включая все соответствующие средства контроля окрашивания и стробирования.
- Для окрашивания отрицательной фракции CD45/Ter119 (1 мкл каждого антитела на 1 x 106 клеток) добавляют CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE и CD140a-PE-Cy5 (см. таблицу материалов).
- Инкубировать на льду 20 мин. Промыть 2 мл буфера FACS, затем центрифугировать при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C.
- Добавьте 1 мл буфера FACS и разбавление PI 1:1000 для окрашивания, затем отфильтруйте образец через пробирку объемом 5 мл с крышкой от сетчатого фильтра 35 мкм.
- Анализируйте клетки на многоцветном проточном цитометре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В данной статье описан метод анализа микросредовых популяций костного мозга, таких как эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки, на основе проточной цитометрии на мышиных моделях МДС и лейкемии (рис. 1). На рисунке 2 показана стратегия стробирования для обнаружения интересующих популяций, начиная с отбора клеток (P1) в переваренной и обедненной CD45/Ter119 фракции через профиль прямого и бокового рассеяния. Пример стробирования клеток в образце лейкемии показан на рисунке P1 (рис. 2A). Синглеты выбираются, а дублеты исключаются из этого анализа, P2 (рис. 2B). На рисунке 2С показаны вентили для отбора пропидиевых йодотрицательных живых клеток, P3. Чтобы сосредоточиться на негемопоэтических стромальных популяциях, клетках, которые являются CD45-/Ter119-, P4 (APC, ось Y) vs. SSC-A (Рисунок 2D). Эта начальная стратегия стробирования является общей для всех анализируемых образцов.
Мышиная модель лейкемии используется для иллюстрации стробирования эндотелиальных клеток на рисунках 2E-G. На рисунке 2E показаны CD31 положительные (Pe-Cy7, ось Y) и CD31. Клетки SSC-A у мышей, не страдающих раком, а также у лейкозных мышей, управляемых через P4. Клетки, положительно меченные CD31, являются эндотелиальными клетками, P5. На рисунке 2F, построенном через P5, артериолярные эндотелиальные клетки идентифицированы как CD45-Ter119-CD31+Sca1+, P6, а синусоидальные эндотелиальные клетки идентифицированы как CD45-Ter119-CD31+Sca1-, P7 (BV421, ось Y) vs. ССК-А.
Несмотря на то, что этот анализ сосредоточен на нелейкозных клетках микроокружения костного мозга, он также полезен для определения опухолевой нагрузки. Это можно сделать с небольшой фракцией непереваренного/необедненного образца до начала эксперимента. В этом экспериментальном контроле (пунктирные линии) на рисунке 2G P8 представляет опухолевую нагрузку в образце, а P9 — нераковые клетки.
Мышиная модель MDS используется для иллюстрации анализа мезенхимальных стромальных клеток на рисунке 2H-J. На рисунке 2H показан CD31 отрицательный (Pe-Cy7, ось Y) и CD31 в сравнении с CD31. Ячейки SSC-A, стробированные через P4. Популяции мезенхимальных стромальных клеток у контрольной мыши дикого типа и мыши MDS показаны на рисунке 2I. Стромальные клетки, пробитые через P10, идентифицируются как CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+, P113 (Pe, Y-ось; Pe-Cy5, ось X). Экспериментальный контроль (пунктирные линии), на рисунке 2J, показаны примеры одноцветных контрольных стробов, CD51 одиночного окрашивания и CD140a, используемых для затвора для МСК, показанных в экспериментальных образцах на рисунке 2I.
Эти данные указывают на то, что артериолярные эндотелиальные клетки значительно расширяются в микроокружении ОМЛ с сопутствующей потерей синусоидальных эндотелиальных популяций (рис. 2F), что согласуется с более ранними исследованиями с использованием ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, у мышей с иммунодефицитом28. Вполне вероятно, что небольшое расширение мезенхимальных стромальных клеток, наблюдаемое у мышей NHD13 в возрасте 8 недель (рис. 2I), может увеличиться на 16-20 неделе, когда эти мыши начинают проявлять характеристики MDS25. Несмотря на то, что для иллюстрации популяции эндотелиальных клеток используется только модель лейкемии, а для иллюстрации популяций мезенхимальных стромальных клеток используется мышиная модель МДС, аналогичные стратегии окрашивания и стробирования могут быть использованы для анализа различных популяций микросреды в любой из этих моделей, или даже в любой генетически модифицированной модели мышей, представляющей интерес.
Рисунок 1: Выделение стромальных клеток костного мозга. Схематически показан процесс выделения негемопоэтических стромальных клеток костного мозга от контрольных и лейкозных мышей. Короче говоря, костные спикулы и костный мозг перевариваются отдельно, а затем объединяются. Популяция CD45-Ter119- обогащается с помощью магнитной сортировки и окрашивается панелями антител против интересующих популяций, таких как мезенхимальные стромальные клетки и эндотелиальные клетки. Затем клетки анализируются методом проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегия стробирования для негемопоэтических клеток костного мозга и стромы. (А-Г) Стратегия стробирования с помощью проточной цитометрии, используемая для отбора переваренных, CD45-/Ter119-, негемопоэтических популяций (P4) как в мышиной модели лейкемии, так и в модели МДС. (E) Лейкозные эндотелиальные клетки костного мозга (P5, CD31+) могут быть подразделены на (F) Sca1+ артериолярные (P6) или Sca1- синусоидальные эндотелиальные клетки (P7). (G) Приживление лейкемии в образце ОМЛ, где P8 представляет собой приживление, а P9 представляет нераковые клетки. Пунктирные линии указывают на то, что данный график является экспериментальным контролем. (H) Через P4, CD31-клетки костного мозга МДС, P10 (I) мезенхимальные стромальные клетки (CD51+/CD140a+, P11). (J) Примеры одноцветных элементов управления, CD51 (слева) и CD140a (справа), используемые для определения ворот мезенхимальных стромальных клеток в (I). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Решение | Реагент | Концентрация | Сумма для добавления |
| Буфер FACS | ГБСС | В 10 раз | 100 мл |
| ЭДТА | 0,5 м | 4 мл | |
| Эмбриональная бычья сыворотка | - | 50 мл | |
| Вода | - | 848 мл | |
| Смесь для переваривания костного мозга | ГБСС | В 1 раз | 2 мл |
| ДНКаза 1 | 1 мкг/мл в 1x DPBS | 20 мкл | |
| Диспас II Порошок | - | 4 мг | |
| Коллагеназа IV типа | - | 2 мг | |
| Смесь для переваривания костных спикул | ДПБС | В 1 раз | 320 мл |
| Коллагеназа 1 типа | - | 1 г | |
| Эмбриональная бычья сыворотка | - | 80 мл | |
| Буфер MAC-адресов | БСА | 66 г/моль | 5 г |
| ДПБС | В 10 раз | 100 мл | |
| ЭДТА | 0,5 м | 4 мл | |
| Вода | - | 896 л |
Таблица 1: Состав растворов и буферов, использованных в настоящем исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модели мышиного лейкоза широко использовались для идентификации внутриклеточных и нишевых сигналов, способствующих прогрессированию агрессивного миелоидного лейкоза 6,19,21. Представлен комплексный протокол на основе проточной цитометрии для определения клеточного состава микроокружения костного мозга на мышиных моделях МДС и ОМЛ.
Перед получением данных проточной цитометрии из экспериментальных образцов важно тщательно компенсировать перекрытие флуоресценции. Также важно включить все соответствующие средства контроля окрашивания и стробирования. Эти шаги позволят экспериментатору подтвердить, что положительное или отрицательное окрашивание антител представляет собой точную экспрессию интересующих клеточных маркеров и не является артефактом флуоресценции, спектрального перекрытия или автофлуоресценции. Несмотря на то, что этот протокол описывает отдельные маркеры клеточной поверхности, панели антител могут быть расширены в зависимости от экспериментальной необходимости. Например, CD144 (Ve-Cadherin) может вводиться in vivo перед забором мышей и может служить дополнительным специфическим маркером эндотелиальных клеток 5,29. В то время как указанные здесь флуорофоры и клоны антител могут быть изменены, для определения их идеального разведения следует провести титрование. Для категорического определения всех клеточных популяций в нише костного мозга можно использовать секвенирование РНК отдельных клеток для определения ландшафта ниши костного мозга во время инициации и прогрессирования МДС/ОМЛ 23,24,30.
Крайне важно тщательно подготовить пробу в соответствии с шагами, описанными в этом протоколе. При гомогенизации костей крайне важно, чтобы ступка и пестик были охлаждены, а все этапы выполнялись на льду, чтобы предотвратить гибель клеток и обеспечить высокое восстановление клеток. Очень важно удалить все ткани, окружающие кости, перед гомогенизацией, чтобы предотвратить загрязнение другими нежелательными типами клеток. Во время лизиса и расщепления эритроцитов важно остановить ферментативную реакцию с помощью соответствующего количества буфера FACS и тщательно ресуспендировать в свежем буфере, иначе клетки продолжат перевариваться и в конечном итоге погибнут.
Разделение костной и костной фракций имеет важное значение, поскольку костные спикулы требуют другой смеси ферментов для буфера пищеварения и требуют больше времени для переваривания. В костном пищеварении коллагеназа типа 1 полезна для переваривания фибрилл коллагеназы, которые обычно находятся во внеклеточном матриксе и коллагеновых волокнах31. Кроме того, некоторые клетки костного мозга, расположенные близко к эндостею, остаются прикрепленными к кости после гомогенизации и высвобождаются только при ферментативном расщеплении. При переваривании костного мозга коллагеназа IV типа используется для переваривания базальной мембраны эпителиальных и эндотелиальных клеток в костном мозге32, в то время как диспаза в основном расщепляет фибронектин31. Костному мозгу требуется меньше времени для переваривания, так как связи между клетками и матриксом слабее. Инкубация фракции костного мозга в аналогичных условиях может нанести ущерб интересующим популяциям. Использование двух разных буферов пищеварения значительно увеличивает количество популяций устьиц, которые могут быть обнаружены, и, таким образом, обеспечивает больший набор данных для анализа.
Большинство доступных протоколов для анализа микросреды костного мозга мышей используют шприц для промывания костного мозга только от длинных костей13,24. Современный метод дробления костей обеспечивает возможность получения данных из других костей, таких как таз, значительно сокращает время подготовки образцов и снижает вероятность травм острыми иглами. Учитывая, что кость состоит из зрелых остеобластов и других клеточных популяций, которые могут поддерживать нормальные и злокачественные кроветворные клетки, этот метод включения клеток из костных спикул позволяет более точно представить микроокружение костного мозга в образце. В то время как одно предыдущее исследование расщепляло костный мозг и костные спикулы поотдельности, оно не продемонстрировало окрашивание костно-линейных и эндотелиальных клеток в одном и том же образце. Во втором исследовании использовались коммерчески доступные запатентованные смеси ферментов для переваривания костного мозга и костных спикул23, и были проанализированы данные с использованием значительно более дорогой технологии секвенирования РНК одиночных клеток. Этот метод обогащения клеток CD45-/Ter119- отбирает интересующие клетки и значительно сокращает время, необходимое для получения данных на проточном цитометре. Таким образом, по сравнению с другими современными методами, такими как секвенирование одноклеточной РНК, этот метод, основанный на проточной цитометрии, является более доступным, экономичным и не требует сложного анализа квалифицированными биоинформатиками 23,24,30.
Важно отметить, что этот протокол может быть использован для характеристики микроокружения костного мозга не только любой из доступных мышиных моделей МДС и ОМЛ, но и любой генетической модели мыши. Подобные методы также могут быть эффективны при анализе изменений в нише костного мозга мышей в моделях ксенотрансплантатов, полученных от пациентов (PDX). Эти методы могут быть полезны для исследований, направленных на определение механизмов, с помощью которых МДС/ОМЛ влияют на их нишу в костном мозге. Учитывая технические проблемы, связанные с отбором большого количества костного мозга у пациентов, этот анализ мышиных моделей является эффективным инструментом для дальнейшего понимания злокачественного микроокружения костного мозга и определения его роли в прогрессировании заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов не декларируется.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить URMC Flow Cytometry Core. Эта работа была поддержана премией Американского общества гематологов, премией Фонда исследования лейкемии и грантами NIH R01DK133131 и R01CA266617 присуждены J.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
- Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
- Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
- Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
- Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
- Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
- Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
- Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
- Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W.
- Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
- Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
- Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
- Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
- Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
- Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).
