Summary
Un protocole détaillé pour isoler et caractériser les populations microenvironnementales de moelle osseuse à partir de modèles murins de syndromes myélodysplasiques et de leucémie myéloïde aiguë est présenté. Cette technique permet d’identifier les changements dans la niche de la moelle osseuse non hématopoïétique, y compris les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, avec la progression de la maladie.
Abstract
Le microenvironnement de la moelle osseuse est constitué de populations cellulaires distinctes, telles que les cellules stromales mésenchymateuses, les cellules endothéliales, les cellules ostéolignées et les fibroblastes, qui soutiennent les cellules souches hématopoïétiques (CSH). En plus de soutenir les CSH normales, le microenvironnement de la moelle osseuse joue également un rôle dans le développement de troubles des cellules souches hématopoïétiques, tels que les syndromes myélodysplasiques (SMD) et la leucémie myéloïde aiguë (LAM). Les mutations associées aux SMD dans les CSH entraînent un blocage de la différenciation et une insuffisance progressive de la moelle osseuse, en particulier chez les personnes âgées. Le SMD peut souvent évoluer vers une LAM résistante au traitement, une maladie caractérisée par une accumulation rapide de blastes myéloïdes immatures. On sait que le microenvironnement de la moelle osseuse est altéré chez les patients atteints de ces néoplasmes myéloïdes. Ici, un protocole complet pour isoler et caractériser phénotypiquement les cellules microenvironnementales de la moelle osseuse à partir de modèles murins de syndrome myélodysplasique et de leucémie myéloïde aiguë est décrit. L’isolement et la caractérisation des changements dans les populations de niche de la moelle osseuse peuvent aider à déterminer leur rôle dans l’initiation et la progression de la maladie et peuvent conduire à la mise au point de nouvelles thérapies ciblant les altérations favorisant le cancer dans les populations stromales de la moelle osseuse.
Introduction
Le microenvironnement de la moelle osseuse est constitué de cellules hématopoïétiques, de cellules stromales non hématopoïétiques et de la matrice extracellulaire 1,2. Ce microenvironnement peut favoriser l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques, réguler la différenciation des lignées et fournir un soutien structurel et mécanique au tissu osseux 1,2,3,4,5. La niche stromale comprend les cellules ostéolinéaires, les fibroblastes, les cellules nerveuses et les cellules endothéliales6, tandis que la niche hématopoïétique comprend les populations lymphoïdes et myéloïdes 1,2,3. En plus de soutenir les CSH normales, le microenvironnement de la moelle osseuse peut également jouer un rôle dans le développement de troubles des cellules souches hématopoïétiques tels que le SMD et la LMA 7,8,9,10,11. Il a été démontré que les mutations dans les cellules ostéoliférantes favorisent le développement du SMD, de la LAM et d’autres néoplasmes myéloprolifératifs 10,12,13,14.
Les syndromes myélodysplasiques sont un groupe de troubles pré-leucémiques qui résultent de mutations dans les cellules souches hématopoïétiques. Le SMD est souvent associé à un blocage de la différenciation des CSH et à la production de cellules dysplasiques, ce qui peut souvent entraîner une insuffisance de la moelle osseuse. Le SMD est le néoplasme myéloïde le plus fréquemment diagnostiqué aux États-Unis et est associé à un taux de survie à 3 ans de 35 % à 45 %15. Le SMD est souvent associé à un risque élevé de transformation en leucémie myéloïde aiguë. Il peut s’agir d’une complication fatale, car la LMA dérivée du SMD est résistante à la plupart des thérapies et susceptible de rechuter. La LAM qui survient de novo en raison de translocations ou de mutations dans la tige hématopoïétique et les progéniteurs est également souvent résistante à la chimiothérapie standard16,17. Étant donné que le SMD et la LMA sont principalement des maladies de personnes âgées, la majorité d’entre eux étant diagnostiqués avant l’âge de 60 ans, la plupart des patients ne sont pas admissibles à une greffe de moelle osseuse curative. Il y a donc un besoin important d’identifier de nouveaux régulateurs de la progression de la maladie. Étant donné que le microenvironnement de la moelle osseuse peut fournir un soutien aux cellules malignes14, la définition des changements dans la niche de la moelle osseuse avec la progression de la maladie peut conduire à l’identification de nouvelles thérapies visant à inhiber le remodelage de la niche tumorale. Il est donc important d’identifier de nouveaux régulateurs de la progression de la maladie. À cette fin, il est essentiel d’identifier et de caractériser les changements dans les populations de cellules stromales de la moelle osseuse qui peuvent fournir un soutien aux cellules malignes.
Plusieurs modèles murins de LAM et de SMD ont été générés et peuvent être utilisés pour étudier les changements dans le microenvironnement de la moelle osseuse au cours de l’initiation et de la progression de la maladie 6,1,19,20,21,22. Ici, les protocoles permettant d’identifier les changements dans les populations de cellules stromales de la moelle osseuse à l’aide de modèles murins de LAM 6,20 induite rétroviralement, ainsi que le modèle Nup98-HoxD13 (NHD13) disponible dans le commerce de la transformation du SMD à haut risque en LAM19, sont décrits. Les souris transplantées avec des cellules de LAM de novo succombent à la maladie en 20 à 30 jours6. Les souris NHD13 développent des cytopénies et une dysplasie de la moelle osseuse vers 15 à 20 semaines, qui se transforme finalement en LAM, et près de 75 % des souris succombent à la maladie vers 32 semaines. Pour analyser les populations du microenvironnement de moelle osseuse modèle murin, les os sont prélevés, la moelle osseuse et les spicules osseux sont digérés par digestion enzymatique, puis les cellules sont enrichies pour les populations non hématopoïétiques CD45-/Ter119- par tri magnétique. Bien que des analyses similaires aient déjà été décrites 11,13,22,23,24,25, elles se concentrent souvent sur la moelle osseuse ou l’os et n’intègrent pas de cellules des deux sources dans leurs analyses. La caractérisation combinée de ces populations, en conjonction avec des analyses de l’expression génique, peut fournir une compréhension complète de la façon dont le microenvironnement hématopoïétique cellulaire fournit un soutien à l’initiation et à la progression de la maladie (Figure 1). Bien que le protocole décrit ci-dessous se concentre sur un modèle de LAM induite par rétroviralité et un modèle de SMD génétique, ces stratégies peuvent être facilement adaptées pour étudier les changements dans la niche de la moelle osseuse de n’importe quel modèle murin d’intérêt.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité des ressources animales de l’Université de Rochester. Les souris ont été élevées et maintenues dans les installations de soins aux animaux de l’Université de Rochester. Pour modéliser les SMD à haut risque, on utilise le modèle19 de souris murines NHD13 disponible dans le commerce. Dans ce modèle, les cellules stromales de la moelle osseuse sont analysées chez les souris femelles NHD13 à l’âge de 8 semaines, avant l’apparition de la maladie. De novo La LAM est générée comme décrit précédemment 6,11,20. Les oncogènes utilisés pour induire la LMA, tels que MLL-AF9 et NRas, sont marqués avec GFP ou YFP, ce qui permet d’analyser les populations de moelle osseuse non leucémiques GFP à l’aide de la cytométrie en flux. En bref, des souris femelles C57BL/6J âgées de 10 semaines sont transplantées avec des cellules murines GFP/YFP+ AML, et la moelle osseuse est prélevée 2 semaines après la greffe. Bien que les souris femelles soient utilisées dans cette étude à des fins de démonstration, ce protocole peut être effectué avec des souris mâles ou femelles. Elle peut également être réalisée à l’aide d’un fémur ou de tous les os longs.
1. Prélèvement de moelle osseuse
REMARQUE : Pour plus de détails sur le protocole de dissection animale, veuillez vous référer à Amend et al.26.
- Nettoyez le mortier et le pilon avec de l’éthanol à 70 %, rincez-les avec un tampon FACS réfrigéré (tableau 1) et placez-les sur de la glace pour qu’ils refroidissent avant de commencer la récolte. Placez également le tampon MAC (tableau 1) sur le banc pour lui permettre d’atteindre la température ambiante.
- Euthanasier l’animal en suivant les lignes directrices et les protocoles de l’établissement en matière de soins et d’utilisation des animaux.
- Sur la paillasse, vaporisez abondamment la souris avec de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce que sa fourrure soit mouillée. À l’aide d’une pince et de ciseaux courbés, soulevez la peau de l’abdomen et faites deux incisions d’environ 0,5 mm de longueur des deux côtés de la souris, latéralement à partir de l’abdomen. Ensuite, faites une incision de 0,5 mm distale à partir de l’abdomen. Tirez vers le bas pour enlever la peau et la fourrure des pattes de la souris.
- Placez les ciseaux perpendiculairement au bassin, appuyez tout en tirant sur le fémur avec une pince. La tête fémorale doit se détacher du bassin. Séparez le fémur et le tibia au niveau de l’articulation fémoro-patellaire. Placez les os dans le tampon FACS dans une plaque à 6 puits sur de la glace.
- Retirez les tissus des os à l’aide d’un tissu de qualité laboratoire et placez les os nettoyés dans une nouvelle plaque à 6 puits avec un tampon FACS frais sur de la glace.
- Placez tous les os dans le mortier avec 2 à 5 mL de tampon FACS afin que tous les os soient immergés dans le tampon (ajustez le volume du tampon en fonction du nombre d’os que vous traitez). Écrasez et broyez les os à l’aide du pilon dans un mouvement circulaire jusqu’à ce que le tissu de la moelle osseuse soit libéré.
- À l’aide d’une seringue de 3 ml, homogénéiser la moelle osseuse en tirant vers le haut et en évacuant le liquide du mortier.
- À l’aide d’une seringue de 3 ml, extraire le liquide du mortier et le filtrer à travers une crépine de 70 μm dans un tube de 50 ml sur de la glace. Rincez les morceaux d’os/tissu du filtre dans le mortier avec le tampon FACS et revenez à l’étape 1.7 pour homogénéiser et filtrer une deuxième fois. Celle-ci constitue la fraction de moelle osseuse.
- Rincez les morceaux d’os restants (spicules) dans le mortier avec le tampon FACS et rincez-les dans un tube de 15 ml à l’aide du tampon FACS pour assurer un rendement cellulaire maximal. Il s’agit de la fraction des spicules osseux.
2. Digestion de la moelle osseuse
- Centrifuger la moelle osseuse à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Décanter et jeter le surnageant.
- Remettre la moelle osseuse en suspension dans 2 mL du mélange de digestion de la moelle osseuse (tableau 1) et la transférer dans un tube de 15 mL. Incuber à 37 °C pendant 45 min sur un rotateur.
- Ajouter 10 mL de tampon FACS pour arrêter la digestion enzymatique. Filtrez le mélange à travers une crépine de 70 μm dans un nouveau tube de 50 ml.
- Pelleter le mélange à 400 x g pendant 7 min à 4 °C.
- Remettre en suspension la pastille de moelle osseuse dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir le tableau des matériaux). Incuber 4 min sur glace.
- Ajouter 10 mL de tampon FACS pour arrêter la lyse. Filtrez le mélange à travers une crépine de 70 μm dans un nouveau tube de 50 ml.
- Pulvériser le mélange à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de tampon FACS.
3. Digestion des spicules osseux
- Faites vortex les spicules osseux de l’étape 1.9 et laissez-les se déposer. Décanter le surnageant et conserver l’os en bas.
- Remettre les spicules osseux en suspension dans 1 mL du mélange de digestion des spicules osseux (tableau 1).
- Placez les tubes sur un rotateur de tubes pendant 60 min à 37 °C.
- Ajouter 10 mL de tampon FACS pour arrêter la digestion enzymatique. Filtrer le mélange à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans le tube de 50 mL contenant de la moelle osseuse lysée et digérée par les globules rouges.
4. Coloration
- Mélangez délicatement les spicules osseux et la suspension de cellules de moelle osseuse.
- Utiliser 10 μL de la suspension cellulaire pour compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre en utilisant une coloration à base de bleu de trypan à 0,4 %, comme décrit dans les protocoles publiés27. Collectez 50 000 cellules pour un contrôle non coloré de la suspension cellulaire.
- Centrifuger les cellules restantes à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 100 μL de tampon FACS.
REMARQUE : Les anticorps peuvent être titrés pour déterminer la dilution idéale. La sélection des anticorps (épitopes et fluorochromes) peut être personnalisée. - Pour la coloration avec des anticorps pour la déplétion magnétique, ajouter le bloc FC (1 μL par 25 x 106 cellules), le CD45-APC (10 μL par 25 x 106 cellules) et le Ter119-APC (4 μL par 25 x 106 cellules) (voir le tableau des matériaux).
- Incuber sur glace pendant 20 min. Laver avec un tampon FACS, retirer 50 000 cellules (~50 μL) pour le contrôle coloré par APC, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et remettre en suspension dans 100 μL de tampon FACS.
- Pour la coloration de la suspension cellulaire avec des microbilles pour l’appauvrissement magnétique, ajouter des mIgG (8 μL par 25 x 106 cellules) et des microbilles anti-APC (20 μL par 25 x 106 cellules) (voir le tableau des matériaux).
- Incuber sur glace pendant 20 min. Laver avec un tampon FACS de 10 mL, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
5. Épuisement de l’échantillon par tri magnétique
REMARQUE : Cette étape est effectuée à l’aide d’un séparateur magnétique manuel disponible dans le commerce conformément aux instructions du fabricant. Cette étape peut également être effectuée à l’aide d’un séparateur automatisé (voir Tableau des matériaux).
- Préparez la colonne LD en la lavant avec 2 mL de tampon MACs (tableau 1). Jetez l’effluent et changez le tube de collecte.
- Remettre en suspension jusqu’à 1 x 108 cellules dans un tampon MAC et les filtrer à travers un tube à essai de 5 ml avec un capuchon de crépine de cellules de 35 μm.
- Placez la colonne LD sur le support du séparateur magnétique. Placez un tube à essai de 5 mL sous la colonne pour recueillir l’éluat.
- Ajoutez la suspension de cellule à la colonne LD préparée. Laissez la fraction négative s’écouler dans le tube de collecte. Lavez la colonne deux fois avec 1 mL de tampon MACs, en recueillant l’éluat dans le même tube. Il s’agit de la fraction négative utilisée à l’étape 5.6 ci-dessous.
- Retirez la colonne LD du support du séparateur magnétique et placez-la sur un nouveau tube à essai de 5 ml. À l’aide d’une pipette, verser 3 mL de tampon dans la colonne afin d’éliminer les cellules qui ont été marquées positivement, à l’aide du piston de colonne.
- Centrifuger les fractions négative et positive à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Mettez-les en suspension dans 100 μL de tampon FACS.
- Compter 10 μL des fractions négatives et positives avec 0,4 % de bleu de trypan. Les volumes pour l’ostéo-analyse/coloration du panel endothélial ci-dessous seront basés sur ce nombre de cellules.
- Utilisez 50 000 cellules vivantes de la fraction positive pour les contrôles de contrôle par cytométrie en flux.
6. Ostéo-analyse/coloration du panneau endothélial
REMARQUE : La compensation doit être effectuée conformément aux protocoles standard de cytométrie en flux, y compris tous les contrôles de coloration et de déclenchement appropriés.
- Pour la coloration de la fraction négative CD45/Ter119 (1 μL de chaque anticorps pour 1 x 106 cellules), ajouter CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE et CD140a-PE-Cy5 (voir le tableau des matériaux).
- Incuber sur glace pendant 20 min. Laver avec 2 mL de tampon FACS, puis centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Ajouter 1 mL de tampon FACS et une dilution de 1 :1000 de PI pour la coloration vivante/morte, puis filtrer l’échantillon à travers un tube à essai de 5 mL avec un capuchon de crépine de 35 μm.
- Analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux multicolore.
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Representative Results
Cet article décrit une méthode basée sur la cytométrie en flux pour analyser les populations microenvironnementales de moelle osseuse, telles que les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, à partir de modèles murins de SMD et de leucémie (Figure 1). La figure 2 illustre la stratégie de déclenchement pour la détection des populations d’intérêt, en commençant par la sélection des cellules (P1) dans la fraction digérée et appauvrie en CD45/Ter119 par le biais d’un profil de diffusion vers l’avant et sur les côtés. Des exemples de contrôle des cellules dans un échantillon de leucémie sont présentés à P1 (figure 2A). Les singulets sont sélectionnés et les doublets sont exclus de cette analyse, P2 (figure 2B). La figure 2C montre des portes permettant de sélectionner des cellules vivantes négatives à l’iode de propidium, P3. Pour se concentrer sur les populations stromales non hématopoïétiques, les cellules qui sont CD45-/Ter119-, P4 (APC, axe Y) vs. SSC-A sont sélectionnés (Figure 2D). Cette stratégie initiale de contrôle est commune à tous les échantillons à analyser.
Le modèle murin de leucémie est utilisé pour illustrer le déclenchement des cellules endothéliales dans les figures 2E-G. La figure 2E illustre le CD31 positif (Pe-Cy7, axe Y) par rapport à la figure 2E Cellules SSC-A chez une souris non cancéreuse ainsi que chez une souris leucémique, fermées par P4. Les cellules marquées positivement avec CD31 sont des cellules endothéliales, P5. Dans la figure 2F, les cellules endothéliales artériolaires sont identifiées comme CD45-Ter119-CD31+Sca1+, P6, et les cellules endothéliales sinusoïdales sont identifiées comme CD45-Ter119-CD31+Sca1-, P7 (BV421, axe Y) vs. SSC-A.
Bien que cette analyse se concentre sur les cellules microenvironnementales de la moelle osseuse non leucémiques, elle est également utile pour déterminer la charge tumorale. Cela peut être fait avec une petite fraction d’échantillon non digéré/non appauvri avant de commencer l’expérience. Dans ce contrôle expérimental (lignes pointillées) Figure 2G, P8 représente la charge tumorale dans l’échantillon et P9 représente les cellules non cancéreuses.
Le modèle murin MDS est utilisé pour illustrer l’analyse des cellules stromales mésenchymateuses de la figure 2H-J. La figure 2H illustre le CD31 négatif (Pe-Cy7, axe Y) par rapport à la figure 2H. Cellules SSC-A, fermées par P4. Les populations de cellules stromales mésenchymateuses chez une souris témoin de type sauvage et une souris SMD sont illustrées à la figure 2I. Fermées par P10, les cellules stromales mésenchymateuses sont identifiées comme CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+, P113 (Pe, axe Y ; Pe-Cy5, axe X). Le témoin expérimental (lignes pointillées), la figure 2J montre des exemples de témoins de contrôle d’une seule couleur, d’une seule coloration CD51 et d’une seule coloration CD140a utilisés pour contrôler les CSM montrées dans les échantillons expérimentaux de la figure 2I.
Ces données indiquent que les cellules endothéliales artériolaires se développent de manière significative dans le microenvironnement de la LMA, avec une perte concomitante dans les populations endothéliales sinusoïdales (Figure 2F), ce qui est cohérent avec des études antérieures utilisant des xénogreffes dérivées de patients chez des souris immunodéficientes28. Il est probable que la faible expansion des cellules stromales mésenchymateuses observée chez les souris NHD13 à l’âge de 8 semaines (Figure 2I) puisse augmenter à 16-20 semaines, lorsque ces souris commencent à présenter des caractéristiques de SMD25. Bien que seul le modèle de leucémie soit utilisé pour illustrer la population de cellules endothéliales et que le modèle murin MDS soit utilisé pour illustrer les populations de cellules stromales mésenchymateuses, des stratégies similaires de coloration et de déclenchement peuvent être utilisées pour analyser les différentes populations microenvironnementales dans l’un ou l’autre de ces modèles, ou en fait, dans tout modèle murin génétiquement modifié d’intérêt.
Figure 1 : Isolement des cellules stromales de la moelle osseuse. Le schéma montre le processus d’isolement des cellules stromales non hématopoïétiques de la moelle osseuse des souris témoins et leucémiques. En bref, les spicules osseux et la moelle osseuse sont digérés séparément, puis mis en commun. La population CD45-Ter119- est enrichie par tri magnétique, et colorée avec des panels d’anticorps contre les populations d’intérêt, telles que les cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales. Les cellules sont ensuite analysées par cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Stratégie de déclenchement pour les cellules non hématopoïétiques de la moelle osseuse et du stromal. (A-D) Stratégie de déclenchement par cytométrie en flux utilisée pour sélectionner les populations digérées, CD45-/Ter119-, non hématopoïétiques (P4) dans le modèle murin de leucémie et de SMD. (E) Les cellules endothéliales de la moelle osseuse leucémique (P5, CD31+) peuvent être subdivisées en cellules endothéliales (F) artériolaires (P6) Sca1+ ou Sca1- sinusoïdale (P7). (G) Greffe de leucémie dans un échantillon de LAM où P8 représente la greffe tandis que P9 représente les cellules non cancéreuses. Les lignes pointillées indiquent qu’il s’agit d’un témoin expérimental. (H) Cellules CD31 de la moelle osseuse de P4, MDS, P10 (I) Cellules stromales mésenchymateuses (CD51+/CD140a+, P11). (J) Exemple de contrôles de contrôle à une seule couleur, CD51 (à gauche) et CD140a (à droite) utilisés pour déterminer les portes des cellules stromales mésenchymateuses en (I). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Solution | Réactif | Concentration | Montant à ajouter |
| Tampon FACS | HBSS (en anglais seulement) | 10 fois | 100 ml |
| EDTA | 0,5 M | 4 mL | |
| Sérum de veau fœtal | - | 50 ml | |
| Eau | - | 848 mL | |
| Mélange de digestion de la moelle osseuse | HBSS (en anglais seulement) | 1 fois | 2 mL |
| DNase 1 | 1 μg/mL dans 1x DPBS | 20 μL | |
| Dispase II Poudre | - | 4 mg (en anglais seulement) | |
| Collagénase de type IV | - | 2 mg (en anglais seulement) | |
| Mélange de digestion de spicule osseux | Le DPBS | 1 fois | 320 mL |
| Collagénase de type 1 | - | 1 g | |
| Sérum de veau fœtal | - | 80 ml | |
| Tampon MACs | BSA | 66 g/mol | 5 grammes |
| Le DPBS | 10 fois | 100 ml | |
| EDTA | 0,5 M | 4 mL | |
| Eau | - | 896 L |
Tableau 1 : Composition des solutions et des tampons utilisés dans la présente étude.
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Discussion
Les modèles de leucémie murine ont été largement utilisés pour identifier les signaux intrinsèques et de niche cellulaires qui favorisent la progression agressive de la leucémie myéloïde 6,19,21. Ici, un protocole complet basé sur la cytométrie en flux pour définir la composition cellulaire du microenvironnement de la moelle osseuse dans des modèles murins de SMD et de LAM est présenté.
Avant d’acquérir des données de cytométrie en flux à partir d’échantillons expérimentaux, il est important de compenser soigneusement le chevauchement de la fluorescence. Il est également essentiel d’inclure tous les contrôles appropriés de coloration et de barrière. Ces étapes permettront à l’expérimentateur de confirmer que la coloration positive ou négative des anticorps représente une expression précise des marqueurs cellulaires d’intérêt et n’est pas un artefact de chevauchement spectral de fluorescence ou d’autofluorescence. Bien que ce protocole décrive des marqueurs de surface cellulaire sélectionnés, les panels d’anticorps peuvent être étendus en fonction des besoins expérimentaux. Par exemple, CD144 (Ve-Cadhérine) peut être administré in vivo avant la récolte des souris et peut servir de marqueur spécifique supplémentaire des cellules endothéliales 5,29. Bien que les fluorophores et les clones d’anticorps indiqués ici puissent être modifiés, des titrages doivent être effectués pour déterminer leur dilution idéale. Pour définir catégoriquement toutes les populations cellulaires dans la niche de la moelle osseuse, le séquençage de l’ARN unicellulaire peut être utilisé pour établir le paysage de la niche de la moelle osseuse au cours de l’initiation et de la progression du SMD/LAM 23,24,30.
Il est essentiel de préparer l’échantillon avec soin selon les étapes décrites dans ce protocole. Lors de l’homogénéisation des os, il est crucial que le mortier et le pilon soient refroidis, et toutes les étapes sont effectuées sur de la glace pour éviter la mort cellulaire et assurer une récupération cellulaire élevée. Il est très important d’enlever tous les tissus entourant les os avant l’homogénéisation pour éviter la contamination d’autres types de cellules indésirables. Pendant la lyse et la digestion des globules rouges, il est important d’arrêter la réaction enzymatique avec une quantité appropriée de tampon FACS et de le remettre en suspension complètement dans un tampon frais, sinon les cellules continueront à digérer et finiront par mourir.
La séparation des fractions osseuse et moelle osseuse est essentielle car les spicules osseux nécessitent un mélange différent d’enzymes pour le tampon de digestion et ont besoin de plus de temps pour digérer. Dans les digestions osseuses, la collagénase de type 1 est utile pour digérer les fibrilles de collagénase que l’on trouve couramment dans la matrice extracellulaire et les fibres de collagène31. De plus, certaines cellules de la moelle osseuse situées à proximité de l’endoste resteront attachées à l’os après homogénéisation et ne seront libérées que par digestion enzymatique. Lors de la digestion de la moelle osseuse, la collagénase de type IV est utilisée pour digérer la membrane basale des cellules épithéliales et endothéliales dans la moelle osseuse32, tandis que la dispase clive principalement la fibronectine31. La moelle osseuse nécessite moins de temps pour être digérée car les associations entre les cellules et la matrice sont plus faibles. L’incubation de la fraction de moelle osseuse dans des conditions similaires peut endommager les populations d’intérêt. L’utilisation de deux tampons de digestion différents augmente considérablement le nombre de populations de stomies pouvant être détectées, et fournit ainsi un ensemble de données plus important à analyser.
La plupart des protocoles disponibles pour analyser les populations microenvironnementales de moelle osseuse murine utilisent une seringue pour évacuer la moelle osseuse des os longsuniquement 13,24. La méthode actuelle d’écrasement des os permet d’acquérir des données à partir d’autres os tels que le bassin, réduit considérablement le temps de préparation des échantillons et atténue la possibilité de blessures avec des aiguilles pointues. Étant donné que l’os est constitué d’ostéoblastes matures et d’autres populations cellulaires qui peuvent fournir un soutien aux cellules hématopoïétiques normales et malignes, cette méthode d’inclusion de cellules des spicules osseux permet une représentation plus précise du microenvironnement de la moelle osseuse dans l’échantillon. Bien qu’une étude antérieure ait digéré séparément la moelle osseuse et les spicules osseux11, elle n’a pas démontré de coloration de l’ostéolignage et des cellules endothéliales dans le même échantillon. Une deuxième étude a utilisé des mélanges d’enzymes exclusifs disponibles dans le commerce pour digérer la moelle osseuse et les spicules osseux23, et a analysé les données à l’aide de la technologie de séquençage de l’ARN unicellulaire, beaucoup plus coûteuse. Cette méthode d’enrichissement des cellules CD45-/Ter119- sélectionne les cellules d’intérêt et réduit considérablement le temps nécessaire à l’acquisition des données sur le cytomètre en flux. Ainsi, comparée à d’autres méthodes de pointe telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire, cette méthode basée sur la cytométrie en flux est plus accessible, plus rentable et ne nécessite pas d’analyse sophistiquée par des bioinformaticiens qualifiés 23,24,30.
Il est important de noter que ce protocole peut être utilisé pour caractériser le microenvironnement de la moelle osseuse non seulement de n’importe lequel des modèles murins disponibles de SMD et de LAM, mais aussi de tout modèle génétique de souris. Des méthodes similaires peuvent également être efficaces pour analyser les changements dans la niche de la moelle osseuse murine des modèles de xénogreffe dérivée du patient (PDX). Ces méthodes peuvent être utiles pour les études visant à déterminer les mécanismes par lesquels les SMD/LAM affectent leur niche médullaire. Compte tenu des défis techniques associés à l’échantillonnage de grandes quantités de moelle osseuse de patients humains, ces analyses de modèles murins constituent un outil efficace pour approfondir la compréhension du microenvironnement malin de la moelle osseuse et définir son rôle dans la progression de la maladie.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le centre de cytométrie en flux de l’URMC. Ces travaux ont été soutenus par le prix de l’American Society of Hematology, le prix de la Fondation pour la recherche sur la leucémie et les subventions du NIH R01DK133131 et R01CA266617 attribués à J.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
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