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Cancer Research

मायलोइड्सप्लास्टिक सिंड्रोम और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंटल आबादी की पहचान करना

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/66093
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3, 1,2, 1,3,4, 1,5, 1,3
1Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 4Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, 5Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

Summary

यहां मायलोइड्सप्लास्टिक सिंड्रोम और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया के मुराइन मॉडल से अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंटल आबादी को अलग करने और चिह्नित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह तकनीक रोग की प्रगति के साथ एंडोथेलियल और मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं सहित गैर-हेमटोपोइएटिक अस्थि मज्जा आला में परिवर्तन की पहचान करती है।

Abstract

अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट में अलग-अलग सेल आबादी होती है, जैसे कि मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाएं, एंडोथेलियल कोशिकाएं, ऑस्टियोलिनेज कोशिकाएं और फाइब्रोब्लास्ट्स, जो हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) के लिए समर्थन प्रदान करते हैं। सामान्य एचएससी का समर्थन करने के अलावा, अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल विकारों के विकास में भी भूमिका निभाता है, जैसे कि मायलोइड्सप्लास्टिक सिंड्रोम (एमडीएस) और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)। एचएससी में एमडीएस से जुड़े उत्परिवर्तन भेदभाव और प्रगतिशील अस्थि मज्जा विफलता में एक ब्लॉक का कारण बनते हैं, खासकर बुजुर्गों में। एमडीएस अक्सर चिकित्सा प्रतिरोधी एएमएल में प्रगति कर सकता है, एक बीमारी जो अपरिपक्व माइलॉयड विस्फोटों के तेजी से संचय की विशेषता है। अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट को इन माइलॉयड नियोप्लाज्म वाले रोगियों में बदलने के लिए जाना जाता है। यहां, मायलोइड्सप्लास्टिक सिंड्रोम और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया के म्यूरिन मॉडल से अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंटल कोशिकाओं को अलग करने और फेनोटाइपिक रूप से चिह्नित करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। अस्थि मज्जा आला आबादी में परिवर्तनों को अलग करने और चिह्नित करने से रोग की शुरुआत और प्रगति में उनकी भूमिका निर्धारित करने में मदद मिल सकती है और अस्थि मज्जा स्ट्रोमल आबादी में कैंसर को बढ़ावा देने वाले परिवर्तनों को लक्षित करने वाले उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास को जन्म दे सकता है।

Introduction

अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट में हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं, गैर-हेमटोपोइएटिक स्ट्रोमल कोशिकाएं और बाह्य मैट्रिक्स 1,2 होते हैं। इस microenvironment hematopoietic स्टेम सेल आत्म नवीकरण को बढ़ावा देने, वंश भेदभाव को विनियमित, और हड्डी के ऊतकों 1,2,3,4,5 के लिए संरचनात्मक और यांत्रिक सहायता प्रदान कर सकते हैं. स्ट्रोमल आला ऑस्टियोवंश कोशिकाओं, fibroblasts, तंत्रिका कोशिकाओं, और endothelial कोशिकाओं6 शामिल हैं, जबकि hematopoietic आला लिम्फोइड और माइलॉयड आबादी 1,2,3 के होते हैं. सामान्य एचएससी का समर्थन करने के अलावा, अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट एमडीएस और एएमएल 7,8,9,10,11जैसे हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल विकारों के विकास में भी भूमिका निभा सकता है। ऑस्टियोलिनेज कोशिकाओं में उत्परिवर्तन एमडीएस, एएमएल, और अन्य मायलोप्रोलिफेरेटिव नियोप्लाज्म 10,12,13,14के विकास को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है।

मायलोइड्सप्लास्टिक सिंड्रोम प्री-ल्यूकेमिक विकारों का एक समूह है जो हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं में उत्परिवर्तन से उत्पन्न होता है। एमडीएस अक्सर एचएससी भेदभाव और डिस्प्लास्टिक कोशिकाओं के उत्पादन में एक ब्लॉक से जुड़ा होता है, जो अक्सर अस्थि मज्जा विफलता का कारण बन सकता है। एमडीएस संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे अधिक पाया जाने वाला माइलॉयड नियोप्लाज्म है और 35% -45% 15 की 3 साल की जीवित रहने की दर से जुड़ा हुआ है। एमडीएस अक्सर तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में परिवर्तन के उच्च जोखिम से जुड़ा होता है। यह एक घातक जटिलता हो सकती है, क्योंकि एमडीएस-व्युत्पन्न एएमएल अधिकांश उपचारों के लिए प्रतिरोधी है और पुनरुत्थान की संभावना है। हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज में अनुवाद या उत्परिवर्तन के कारण डी नोवो उत्पन्न होने वाले एएमएल भी अक्सर मानक कीमोथेरेपी16,17 के लिए प्रतिरोधी होते हैं। चूंकि एमडीएस और एएमएल मुख्य रूप से बुजुर्गों की बीमारियां हैं, जिनमें से अधिकांश का निदान 60 वर्ष से अधिक आयु के साथ होता है, इसलिए अधिकांश रोगी उपचारात्मक अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के लिए अयोग्य हैं। इस प्रकार, रोग की प्रगति के उपन्यास नियामकों की पहचान करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। चूंकि अस्थि मज्जा microenvironment घातक कोशिकाओं14 के लिए समर्थन प्रदान कर सकते हैं, रोग की प्रगति के साथ अस्थि मज्जा आला में परिवर्तन को परिभाषित करने ट्यूमर आला रीमॉडेलिंग बाधा के उद्देश्य से उपन्यास चिकित्सा विज्ञान की पहचान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, रोग की प्रगति के उपन्यास नियामकों की पहचान करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। यह अंत करने के लिए, अस्थि मज्जा स्ट्रोमल सेल आबादी में परिवर्तन की पहचान करना और चिह्नित करना महत्वपूर्ण है जो घातक कोशिकाओं के लिए समर्थन प्रदान कर सकता है।

एएमएल और एमडीएस के कई murine मॉडल उत्पन्न किया गया है और रोग दीक्षा और प्रगति 6,1,19,20,21,22 के दौरान अस्थि मज्जा microenvironment में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहां, रेट्रोविराली प्रेरित एएमएल 6,20 के म्यूरिन मॉडल का उपयोग करके अस्थि मज्जा स्ट्रोमल सेल आबादी में परिवर्तन की पहचान करने के लिए प्रोटोकॉल, साथ ही एएमएलपरिवर्तन 19 के लिए उच्च जोखिम वाले एमडीएस के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Nup98-HoxD13 (NHD13) मॉडल का वर्णन किया गया है। डे नोवो एएमएल कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित चूहे 20-30दिनों में बीमारी के शिकार 6. NHD13 चूहों में 15-20 सप्ताह के आसपास साइटोपेनिया और अस्थि मज्जा डिस्प्लेसिया विकसित होता है, जो अंततः एएमएल में बदल जाता है, और लगभग 75% चूहे 32 सप्ताह के आसपास बीमारी के शिकार हो जाते हैं। murine मॉडल अस्थि मज्जा microenvironment आबादी का विश्लेषण करने के लिए, हड्डियों काटा जाता है, अस्थि मज्जा और हड्डी spicules एंजाइमी पाचन का उपयोग पचा रहे हैं, और कोशिकाओं को तो CD45-/Ter119- चुंबकीय छँटाई द्वारा गैर hematopoietic आबादी के लिए समृद्ध कर रहे हैं. जबकि इसी तरह के विश्लेषण पहले 11,13,22,23,24,25 वर्णित किए गए हैं, वे अक्सर अस्थि मज्जा या हड्डी पर ध्यान केंद्रित करते हैं और अपने विश्लेषण में दोनों स्रोतों से कोशिकाओं को शामिल नहीं करते हैं। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में इन आबादी के संयुक्त लक्षण वर्णन, कैसे सेलुलर हेमटोपोइएटिक microenvironment रोग दीक्षा और प्रगति(चित्रा 1) के लिए समर्थन प्रदान करता है की एक व्यापक समझ प्रदान कर सकते हैं. जबकि नीचे वर्णित प्रोटोकॉल पूर्वव्यापी प्रेरित एएमएल मॉडल और एक आनुवंशिक एमडीएस मॉडल पर केंद्रित है, इन रणनीतियों को आसानी से ब्याज के किसी भी murine मॉडल के अस्थि मज्जा आला में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों पशु संसाधन पर रोचेस्टर विश्वविद्यालय समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किए गए. चूहों को रोचेस्टर विश्वविद्यालय में पशु देखभाल सुविधाओं में नस्ल और रखरखाव किया गया था। उच्च जोखिम वाले एमडीएस को मॉडल करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एनएचडी 13 मुराइन मॉडल19 कार्यरत है। इस मॉडल में, अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं का विश्लेषण महिला एनएचडी 13 चूहों में 8 सप्ताह की उम्र में, बीमारी की शुरुआत से पहले किया जाता है। डे नोवो एएमएल पहले वर्णित 6,11,20 के रूप में उत्पन्न होता है। एमएलएल-एएफ 9 और एनआरएएस जैसे एएमएल को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ऑन्कोजीन को जीएफपी या वाईएफपी के साथ टैग किया जाता है, जो प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके गैर-ल्यूकेमिक जीएफपी-अस्थि मज्जा आबादी के विश्लेषण की अनुमति देता है। संक्षेप में, 10 सप्ताह की महिला C57BL/6J चूहों को murine GFP/YFP+ AML कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है, और अस्थि मज्जा को प्रत्यारोपण के 2 सप्ताह बाद काटा जाता है। जबकि महिला चूहों प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए इस अध्ययन में उपयोग किया जाता है, इस प्रोटोकॉल या तो पुरुष या महिला चूहों के साथ आयोजित किया जा सकता है. यह एक फीमर या सभी लंबी हड्डियों का उपयोग करके भी किया जा सकता है।

1. अस्थि मज्जा की कटाई

नोट: पशु विच्छेदन प्रोटोकॉल पर विवरण के लिए, कृपया संशोधन एट अल.26 देखें।

  1. 70% इथेनॉल के साथ मोर्टार और मूसल को साफ करें, उन्हें ठंडा एफएसीएस बफर(तालिका 1)के साथ कुल्ला, और फसल शुरू करने से पहले उन्हें ठंडा करने के लिए बर्फ पर रखें। इसके अलावा, बेंच पर मैक बफर (तालिका 1) रखें ताकि यह कमरे के तापमान तक पहुंच सके।
  2. संस्थागत पशु देखभाल के बाद पशु को इच्छामृत्यु दें और दिशानिर्देशों और प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
  3. benchtop पर, अच्छी तरह से 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे जब तक अपने फर गीला है. संदंश और घुमावदार कैंची का प्रयोग, पेट पर त्वचा लिफ्ट और पेट से पार्श्व, माउस के दोनों किनारों पर लंबाई में लगभग 0.5 मिमी दो चीरों बनाते हैं. अगला, पेट से एक 0.5 मिमी चीरा बाहर का कर. माउस के पैरों से त्वचा और फर को हटाने के लिए नीचे खींचें।
  4. श्रोणि के लंबवत कैंची रखें, संदंश के साथ फीमर पर खींचते समय नीचे दबाएं। ऊरु सिर को श्रोणि से अलग होना चाहिए। पेटेलोफेमोरल संयुक्त पर फीमर और टिबिया को अलग करें। बर्फ पर एक 6 अच्छी तरह से थाली में FACS बफर में हड्डियों रखें.
  5. प्रयोगशाला ग्रेड ऊतक का उपयोग हड्डियों से ऊतक निकालें और बर्फ पर ताजा FACS बफर के साथ एक नई 6 अच्छी तरह से थाली में साफ हड्डियों जगह.
  6. एफएसीएस बफर के 2-5 एमएल के साथ मोर्टार में सभी हड्डियों को रखें ताकि सभी हड्डियों को बफर में डुबोया जा सके (आप कितनी हड्डियों को संसाधित कर रहे हैं इसके आधार पर बफर की मात्रा समायोजित करें)। मूसल का उपयोग करके हड्डियों को एक गोलाकार गति में क्रश और पीस लें जब तक कि अस्थि मज्जा ऊतक जारी न हो जाए।
  7. एक 3 एमएल सिरिंज का प्रयोग, ऊपर खींच और मोर्टार से तरल नीचे फ्लश द्वारा अस्थि मज्जा homogenize.
  8. एक 3 एमएल सिरिंज का प्रयोग, मोर्टार से तरल खींच और बर्फ पर एक 50 एमएल ट्यूब में एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फिल्टर. फिल्टर से हड्डी/ऊतक के टुकड़ों को एफएसीएस बफर के साथ मोर्टार में वापस कुल्ला और दूसरी बार समरूप और तनाव के लिए चरण 1.7 पर लौटें। यह अस्थि मज्जा अंश का गठन करता है।
  9. शेष हड्डी के टुकड़े (spicules) वापस FACS बफर के साथ मोर्टार में कुल्ला और अधिकतम सेल उपज सुनिश्चित करने के लिए FACS बफर का उपयोग कर एक 15 एमएल ट्यूब में उन्हें फ्लश. यह हड्डी स्पाइक्यूल्स अंश है।

2. अस्थि मज्जा का पाचन

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अस्थि मज्जा को सेंट्रीफ्यूज करें। छानना और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  2. अस्थि मज्जा पाचन मिश्रण (तालिका 1) के 2 एमएल में अस्थि मज्जा को फिर से निलंबित करें और इसे 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक रोटेटर पर 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. एंजाइमी पाचन को रोकने के लिए एफएसीएस बफर के 10 एमएल जोड़ें। एक नई 50 एमएल ट्यूब में एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से मिश्रण फ़िल्टर.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिन के लिए 400 x ग्राम पर मिश्रण को गोली दें।
  5. आरबीसी लाइसिस बफर के 1 एमएल में अस्थि मज्जा गोली को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। बर्फ पर 4 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. लाइसिस को रोकने के लिए एफएसीएस बफर के 10 एमएल जोड़ें। एक नई 50 एमएल ट्यूब में एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से मिश्रण फ़िल्टर.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर मिश्रण को गोली दें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और एफएसीएस बफर के 100 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें।

3. हड्डी के स्पाइक्यूल्स का पाचन

  1. भंवर हड्डी कदम 1.9 से spicules और उन्हें बसने के लिए अनुमति देते हैं. सतह पर तैरनेवाला छानना और तल पर हड्डी को बनाए रखें.
  2. हड्डी स्पाइक्यूल पाचन मिश्रण (तालिका 1) के 1 एमएल में हड्डी के स्पाइक्यूल्स को फिर से निलंबित करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर ट्यूबों रखें.
  4. एंजाइमी पाचन को रोकने के लिए एफएसीएस बफर के 10 एमएल जोड़ें। आरबीसी-लाइस्ड और पचाने वाली अस्थि मज्जा युक्त 50 एमएल ट्यूब में 70 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर के माध्यम से मिश्रण को फ़िल्टर करें।

4. धुंधला हो जाना

  1. धीरे हड्डी spicules और अस्थि मज्जा सेल निलंबन मिश्रण.
  2. सेल निलंबन के 10 माइक्रोन का उपयोग 0.4% trypan नीले आधारित धुंधला का उपयोग कर एक hemocytometer पर रहते सेल नंबर की गणना करने के लिए, प्रकाशित प्रोटोकॉल27 में वर्णित के रूप में. सेल निलंबन से एक दाग नियंत्रण के लिए 50,000 कोशिकाओं लीजिए.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर शेष कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और उन्हें FACS बफर के 100 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें।
    नोट: आदर्श कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए एंटीबॉडी को शीर्षक दिया जा सकता है। एंटीबॉडी चयन (एपिटोप्स और फ्लोरोक्रोम) को अनुकूलित किया जा सकता है।
  4. चुंबकीय कमी के लिए एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना के लिए, एफसी ब्लॉक (25 x 106 कोशिकाओं प्रति 1 माइक्रोन), सीडी 45-एपीसी (25 x 106 कोशिकाओं प्रति 10 माइक्रोन), और टेर 119-एपीसी (25 x 106 कोशिकाओं प्रति 4 माइक्रोन) ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें।
  5. 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. एफएसीएस बफर के साथ धोएं, एपीसी-दाग नियंत्रण के लिए 50,000 कोशिकाओं (~ 50 माइक्रोन) को हटा दें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, और एफएसीएस बफर के 100 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें।
  6. चुंबकीय रिक्तीकरण के लिए माइक्रोबीड्स के साथ सेल निलंबन के धुंधला होने के लिए, एमआईजीजी (8 माइक्रोन प्रति 25 x 106 कोशिकाओं) और एंटी-एपीसी माइक्रोबीड्स (20 माइक्रोन प्रति 25 x 106 कोशिकाओं) ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें।
  7. 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. 10 एमएल एफएसीएस बफर के साथ धो लें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।

5. चुंबकीय छँटाई द्वारा नमूने की कमी

नोट: यह कदम निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैनुअल चुंबकीय विभाजक का उपयोग करके किया जाता है। यह चरण एक स्वचालित विभाजक के साथ भी किया जा सकता है (सामग्री की तालिकादेखें)।

  1. मैक बफर(तालिका 1)के 2 एमएल के साथ इसे धोकर एलडी कॉलम तैयार करें। बहिःस्राव को त्यागें और संग्रह ट्यूब बदलें।
  2. मैक बफर में 1 x 108 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और उन्हें 35 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर कैप के साथ 5 एमएल टेस्ट ट्यूब के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  3. एलडी कॉलम को चुंबकीय विभाजक स्टैंड पर रखें। एल्यूएट इकट्ठा करने के लिए कॉलम के नीचे एक 5 एमएल टेस्ट ट्यूब रखें।
  4. तैयार LD स्तंभ के लिए सेल निलंबन जोड़ें। ऋणात्मक अंश संग्रह ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह करने के लिए अनुमति दें. मैक बफर के 1 एमएल के साथ कॉलम को दो बार धोएं, एक ही ट्यूब में एल्यूट इकट्ठा करें। यह नीचे चरण 5.6 में इस्तेमाल नकारात्मक अंश है.
  5. चुंबकीय विभाजक स्टैंड से एलडी कॉलम निकालें और इसे एक नई 5 एमएल टेस्ट ट्यूब पर रखें। कॉलम प्लंजर का उपयोग करके, सकारात्मक रूप से लेबल की गई कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए कॉलम में बफर के 3 एमएल को बांटने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर नकारात्मक और सकारात्मक अंशों को सेंट्रीफ्यूज करें। उन्हें FACS बफर के 100 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें।
  7. 0.4% ट्रिपैन नीले रंग के साथ नकारात्मक और सकारात्मक अंशों के 10 माइक्रोन की गणना करें। नीचे ऑस्टियो-विश्लेषण/एंडोथेलियल पैनल धुंधला के लिए वॉल्यूम इस सेल काउंट पर आधारित होगा।
  8. प्रवाह साइटोमेट्री गेटिंग नियंत्रण के लिए सकारात्मक अंश से 50,000 जीवित कोशिकाओं का उपयोग करें।

6. ऑस्टियो-विश्लेषण/एंडोथेलियल पैनल दाग

नोट: मुआवजा मानक प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल के बाद किया जाना चाहिए, जिसमें सभी उपयुक्त धुंधला और गेटिंग नियंत्रण शामिल हैं।

  1. CD45/Ter119 नकारात्मक अंश (1 x 106 कोशिकाओं प्रति प्रत्येक एंटीबॉडी का 1 माइक्रोन) के धुंधला होने के लिए, CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE, और CD140a-PE-Cy5 जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. एफएसीएस बफर के 2 एमएल के साथ धो लें, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  3. एफएसीएस बफर के 1 एमएल और लाइव/डेड धुंधला के लिए पीआई का 1:1000 कमजोर पड़ने जोड़ें, फिर 35 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर कैप के साथ 5 एमएल टेस्ट ट्यूब के माध्यम से नमूना फ़िल्टर करें।
  4. एक बहु रंग प्रवाह साइटोमीटर पर कोशिकाओं का विश्लेषण.

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Representative Results

यह लेख एमडीएस और ल्यूकेमिया म्यूरिन मॉडल(चित्रा 1)से अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंटल आबादी, जैसे एंडोथेलियल और मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि का वर्णन करता है। चित्रा 2 आगे और साइड तितर बितर प्रोफ़ाइल के माध्यम से पचाने और सीडी 45 / टेर 119 समाप्त अंश में कोशिकाओं (पी 1) के चयन के साथ शुरुआत, ब्याज की आबादी का पता लगाने के लिए गेटिंग रणनीति को दर्शाया गया है। ल्यूकेमिया नमूने में कोशिकाओं के उदाहरण गेटिंग पी 1 (चित्रा 2 ए) में दिखाए गए हैं। सिंगलेट्स का चयन किया जाता है और डबल्स को इस विश्लेषण, पी 2 (चित्रा 2 बी) से बाहर रखा गया है। चित्रा 2 सी प्रोपिडियम आयोडीन नकारात्मक जीवित कोशिकाओं, पी 3 का चयन करने के लिए द्वार दिखाता है। गैर-हेमटोपोइएटिक स्ट्रोमल आबादी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, कोशिकाएं जो सीडी 45-/टेर 119-, पी 4 (एपीसी, वाई-अक्ष) बनाम हैं। एसएससी-ए का चयन किया जाता है (चित्र 2डी)। यह प्रारंभिक गेटिंग रणनीति सभी नमूनों का विश्लेषण करने के लिए आम है।

ल्यूकेमिया murine मॉडल आंकड़े 2E-G में endothelial कोशिकाओं के लिए गेटिंग वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. चित्रा 2E सीडी 31 सकारात्मक (पीई-Cy7, वाई-अक्ष) बनाम दर्शाया गया है। एक गैर-कैंसर नियंत्रण माउस के साथ-साथ एक ल्यूकेमिक माउस में एसएससी-ए कोशिकाएं, पी 4 के माध्यम से गेटेड हैं। सीडी 31 के साथ सकारात्मक रूप से लेबल की गई कोशिकाएं एंडोथेलियल कोशिकाएं, पी 5 हैं। चित्रा 2 एफ में, पी 5 के माध्यम से गेटेड किया गया, धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं को सीडी 45-टेर 119-सीडी 31 + एससीए 1 +, पी 6 के रूप में पहचाना जाता है, और साइनसोइडल एंडोथेलियल कोशिकाओं को सीडी 45-टेर 119-सीडी 31 + एससीए 1-, पी 7 (बीवी 421, वाई-अक्ष) बनाम के रूप में पहचाना जाता है। एसएससी-ए।

यद्यपि यह विश्लेषण गैर-ल्यूकेमिक अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंटल कोशिकाओं पर केंद्रित है, यह ट्यूमर के बोझ को निर्धारित करने में भी सहायक है। यह प्रयोग शुरू करने से पहले अपचित/गैर-समाप्त नमूने के एक छोटे से अंश के साथ किया जा सकता है। इस प्रयोगात्मक नियंत्रण (धराशायी लाइनों) चित्रा 2 जी में, पी 8 नमूने में ट्यूमर के बोझ का प्रतिनिधित्व करता है और पी 9 गैर कैंसर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है।

एमडीएस murine मॉडल चित्रा 2H-J में mesenchymal स्ट्रोमल कोशिकाओं के विश्लेषण वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. चित्रा 2 एच सीडी 31 नकारात्मक (पीई-सीवाई 7, वाई-अक्ष) बनाम दर्शाया गया है। एसएससी-ए कोशिकाएं, पी 4 के माध्यम से गेटेड हैं। एक जंगली प्रकार के नियंत्रण माउस और एमडीएस माउस में मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल आबादी चित्रा 2 आई में दिखाया गया है। P10 के माध्यम से गेटेड मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं को CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+, P113 (Pe, Y-axis; पे-Cy5, X-अक्ष)। प्रयोगात्मक नियंत्रण (धराशायी लाइनें), चित्रा 2J चित्रा 2I में प्रयोगात्मक नमूनों में दिखाए गए एमएससी के लिए गेट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एकल-रंग गेटिंग नियंत्रण, सीडी 51 एकल दाग और सीडी 140 ए एकल दाग के उदाहरण दिखाता है।

यह डेटा इंगित करता है कि धमनी एंडोथेलियल कोशिकाएं एएमएल माइक्रोएन्वायरमेंट में काफी विस्तार करती हैं, साइनसोइडल एंडोथेलियल आबादी (चित्रा 2एफ) में सहवर्ती नुकसान के साथ, इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों28 में रोगी व्युत्पन्न एक्सनोग्राफ्ट्स का उपयोग करके पहले के अध्ययनों के अनुरूप। यह संभावना है कि 8 सप्ताह की उम्र में एनएचडी 13 चूहों में देखे गए मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं में छोटा विस्तार (चित्रा 2I) 16-20 सप्ताह में बढ़ सकता है, जब ये चूहे एमडीएस25 की विशेषताओं को प्रदर्शित करना शुरू करते हैं। यद्यपि केवल ल्यूकेमिया मॉडल का उपयोग एंडोथेलियल सेल आबादी को चित्रित करने के लिए किया जाता है और एमडीएस म्यूरिन मॉडल का उपयोग मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल आबादी को चित्रित करने के लिए किया जाता है, इसी तरह की धुंधला और गेटिंग रणनीतियों का उपयोग इन मॉडलों में से किसी एक में विभिन्न माइक्रोएन्वायरमेंटल आबादी का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, या वास्तव में, ब्याज के किसी भी आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मुराइन मॉडल में।

Figure 1
चित्रा 1: अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं का अलगाव। योजनाबद्ध नियंत्रण और ल्यूकेमिक चूहों से गैर-हेमटोपोइएटिक अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं को अलग करने की प्रक्रिया को दर्शाता है। संक्षेप में, हड्डी के स्पाइक्यूल्स और अस्थि मज्जा को अलग-अलग पचाया जाता है और फिर जमा किया जाता है। CD45-Ter119- जनसंख्या चुंबकीय छँटाई से समृद्ध होती है, और मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे ब्याज की आबादी के खिलाफ एंटीबॉडी पैनलों से सना हुआ है। कोशिकाओं का विश्लेषण तब प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: गैर-हेमटोपोइएटिक अस्थि मज्जा और स्ट्रोमल कोशिकाओं के लिए गेटिंग रणनीति। (एडी) फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति का उपयोग ल्यूकेमिया और एमडीएस मुराइन मॉडल दोनों में पचाने वाले, सीडी 45-/टेर 119-, गैर-हेमटोपोइएटिक आबादी (पी 4) का चयन करने के लिए किया जाता है। (ई) ल्यूकेमिया अस्थि मज्जा एंडोथेलियल कोशिकाओं (पी 5, सीडी 31 +) को (एफ) एससीए 1 + धमनी (पी 6) या एससीए 1- साइनसोइडल एंडोथेलियल कोशिकाओं (पी 7) के रूप में उप-विभाजित किया जा सकता है। (जी) एएमएल नमूने में ल्यूकेमिया एनग्राफ्टमेंट जहां पी 8 एनग्राफ्टमेंट का प्रतिनिधित्व करता है जबकि पी 9 गैर-कैंसर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। बिंदीदार रेखाएं इंगित करती हैं कि यह साजिश एक प्रयोगात्मक नियंत्रण है। (एच) पी 4, एमडीएस अस्थि मज्जा सीडी 31- कोशिकाओं, पी 10 (आई) मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (सीडी 51 + / सीडी 140 ए +, पी 11) के माध्यम से गेटेड । (जे) उदाहरण एकल रंग गेटिंग नियंत्रण, सीडी 51 (बाएं) और सीडी 140 ए (दाएं) (आई) में मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं के लिए फाटकों को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विलयन अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता जोड़ने के लिए राशि
FACS बफर एचबीएसएस 10x 100 एमएल
ईडीटीए 0.5 एम 4 एमएल
भ्रूण गोजातीय सीरम - 50 एमएल
पानी - 848 एमएल
अस्थि मज्जा पाचन मिश्रण एचबीएसएस 1x 2 एमएल
डीएनएएस 1 1x DPBS में 1 μg/mL 20 माइक्रोन
डिस्पेस II पाउडर - 4 मिलीग्राम
कोलेजनेज टाइप IV - 2 मिलीग्राम
अस्थि स्पाइक्यूल पाचन मिश्रण डीपीबीएस 1x 320 एमएल
कोलेजनेज टाइप 1 - 1 ग्राम
भ्रूण गोजातीय सीरम - 80 एमएल
मैक बफर बीएसए 66 ग्राम/मोल 5 ग्राम
डीपीबीएस 10x 100 एमएल
ईडीटीए 0.5 एम 4 एमएल
पानी - 896 एल

तालिका 1: वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले समाधान और बफ़र्स की संरचना।

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Discussion

मुरीन ल्यूकेमिया मॉडल का उपयोग बड़े पैमाने पर सेल आंतरिक और आला-संचालित संकेतों की पहचान करने के लिए किया गया है जो आक्रामक माइलॉयड ल्यूकेमिया प्रगति 6,19,21को बढ़ावा देते हैं। यहां, एमडीएस और एएमएल के म्यूरिन मॉडल में अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट की सेलुलर संरचना को परिभाषित करने के लिए एक व्यापक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।

प्रयोगात्मक नमूनों से प्रवाह साइटोमेट्रिक डेटा प्राप्त करने से पहले, प्रतिदीप्ति ओवरलैप के लिए सावधानीपूर्वक क्षतिपूर्ति करना महत्वपूर्ण है। यह भी सभी उपयुक्त धुंधला और gating नियंत्रण शामिल करने के लिए आवश्यक है. ये कदम प्रयोगकर्ता को यह पुष्टि करने की अनुमति देंगे कि सकारात्मक या नकारात्मक एंटीबॉडी धुंधला हो जाना ब्याज के सेल मार्करों की सटीक अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है और प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय ओवरलैप या ऑटोफ्लोरेसेंस का एक आर्टिफैक्ट नहीं है। हालांकि यह प्रोटोकॉल चयनित सेल सतह मार्करों का वर्णन करता है, एंटीबॉडी पैनलों प्रयोगात्मक आवश्यकता के आधार पर विस्तार किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, CD144 (Ve-Cadherin) चूहों की कटाई से पहले विवो में प्रशासित किया जा सकता है और endothelial कोशिकाओं 5,29 के एक अतिरिक्त विशिष्ट मार्कर के रूप में काम कर सकते हैं. जबकि यहां बताए गए फ्लोरोफोर्स और एंटीबॉडी क्लोन को बदला जा सकता है, उनके आदर्श कमजोर पड़ने को निर्धारित करने के लिए अनुमापन किया जाना चाहिए। अस्थि मज्जा आला में सभी सेल आबादी को स्पष्ट रूप से परिभाषित करने के लिए, एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण का उपयोग एमडीएस/एएमएल दीक्षा औरप्रगति 23,24,30 के दौरान अस्थि मज्जा आला परिदृश्य स्थापित करने के लिए किया जा सकता है।

यह इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों के अनुसार ध्यान से नमूना तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है. हड्डियों को समरूप करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि मोर्टार और मूसल को ठंडा किया जाए, और कोशिका मृत्यु को रोकने और उच्च कोशिका वसूली सुनिश्चित करने के लिए बर्फ पर सभी कदम उठाए जाएं। अन्य अवांछित सेल प्रकारों के संदूषण को रोकने के लिए समरूप बनाने से पहले हड्डियों के आसपास के सभी ऊतकों को निकालना बहुत महत्वपूर्ण है। आरबीसी लाइसिस और पाचन के दौरान, एफएसीएस बफर की उचित मात्रा के साथ एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को रोकना और ताजा बफर में अच्छी तरह से फिर से निलंबित करना महत्वपूर्ण है, या कोशिकाएं पचाना जारी रखेंगी और अंततः मर जाएंगी।

हड्डी और अस्थि मज्जा अंशों को अलग करना आवश्यक है क्योंकि हड्डी के स्पाइक्यूल्स को पाचन बफर के लिए एंजाइमों के एक अलग मिश्रण की आवश्यकता होती है और पचाने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है। हड्डी पाचन में, कोलेजेनेज प्रकार 1 आमतौर पर बाह्य मैट्रिक्स और कोलेजन फाइबर31 में पाए जाते हैं जो कोलेजनेज फाइब्रिल पचाने के लिए उपयोगी है. इसके अतिरिक्त, एंडोस्टेम के करीब स्थित कुछ अस्थि मज्जा कोशिकाएं समरूप होने के बाद हड्डी से जुड़ी रहेंगी और केवल एंजाइमेटिक पाचन द्वारा जारी की जाती हैं। अस्थि मज्जा को पचाते समय, कोलेजनेज प्रकार IV का उपयोग अस्थि मज्जा32 के भीतर उपकला और एंडोथेलियल कोशिकाओं के तहखाने की झिल्ली को पचाने के लिए किया जाता है, जबकि डिस्पेस मुख्य रूप से फाइब्रोनेक्टिन31 को साफ करता है। अस्थि मज्जा को पचाने के लिए कम समय की आवश्यकता होती है क्योंकि कोशिकाओं और मैट्रिक्स के बीच संबंध कमजोर होते हैं। समान परिस्थितियों में अस्थि मज्जा अंश को सेते हुए ब्याज की आबादी को नुकसान पहुंचा सकता है। दो अलग-अलग पाचन बफ़र्स का उपयोग करने से स्टोमल आबादी की संख्या में काफी वृद्धि होती है जिसका पता लगाया जा सकता है, और इस प्रकार विश्लेषण करने के लिए एक बड़ा डेटा सेट प्रदान करता है।

murine अस्थि मज्जा microenvironmental आबादी का विश्लेषण करने के लिए सबसे उपलब्ध प्रोटोकॉल केवल लंबी हड्डियों13,24 से अस्थि मज्जा फ्लश करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें. हड्डियों को कुचलने की वर्तमान विधि श्रोणि जैसी अन्य हड्डियों से डेटा प्राप्त करने की क्षमता प्रदान करती है, नमूना तैयार करने के समय को काफी कम करती है, और तेज सुइयों के साथ चोटों की संभावना को कम करती है। यह देखते हुए कि हड्डी में परिपक्व ओस्टियोब्लास्ट और अन्य सेल आबादी होती है जो सामान्य और घातक हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को सहायता प्रदान कर सकती है, हड्डी के स्पाइक्यूल्स से कोशिकाओं को शामिल करने की यह विधि नमूने में अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व करने में सक्षम बनाती है। जबकि एक पिछले अध्ययन ने अस्थि मज्जा और हड्डी के स्पाइक्यूल्स को अलग-अलग11 पचाया, इसने एक ही नमूने में ऑस्टियोलिनेज और एंडोथेलियल कोशिकाओं के धुंधला होने का प्रदर्शन नहीं किया। एक दूसरे अध्ययन अस्थि मज्जा और हड्डी spicules23 पचाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मालिकाना एंजाइम घोला जा सकता है का इस्तेमाल किया, और काफी अधिक महंगी एकल सेल आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण किया. CD45-/Ter119- कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने की यह विधि ब्याज की कोशिकाओं के लिए चयन करती है, और प्रवाह साइटोमीटर पर डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय को काफी कम कर देती है। इस प्रकार, इस तरह के एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के रूप में कला तरीकों के अन्य राज्य की तुलना में, इस प्रवाह साइटोमेट्री आधारित विधि अधिक सुलभ, लागत प्रभावी है और प्रशिक्षित जैव सूचना विज्ञानियों 23,24,30 द्वारा परिष्कृत विश्लेषण की आवश्यकता नहीं है.

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग न केवल एमडीएस और एएमएल के उपलब्ध म्यूरिन मॉडल बल्कि किसी भी आनुवंशिक माउस मॉडल के अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। इसी तरह के तरीके रोगी व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल के म्यूरिन अस्थि मज्जा आला में परिवर्तनों का विश्लेषण करने में भी प्रभावी हो सकते हैं। ये विधियां उन तंत्रों को निर्धारित करने के उद्देश्य से अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकती हैं जिनके द्वारा एमडीएस / एएमएल अपने अस्थि मज्जा आला को प्रभावित करते हैं। मानव रोगियों से बड़ी मात्रा में अस्थि मज्जा के नमूने से जुड़ी तकनीकी चुनौतियों को देखते हुए, murine मॉडल के ये विश्लेषण घातक अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट की समझ को आगे बढ़ाने और रोग की प्रगति में इसकी भूमिका को परिभाषित करने के लिए एक प्रभावी उपकरण हैं।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया।

Acknowledgments

हम यूआरएमसी फ्लो साइटोमेट्री कोर को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को अमेरिकन सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी स्कॉलर अवार्ड, ल्यूकेमिया रिसर्च फाउंडेशन पुरस्कार और एनआईएच अनुदान R01DK133131 द्वारा समर्थित किया गया था और जेबी को सम्मानित किया R01CA266617 था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL pipette Tips  Genesee Scientific  24-165RL
1.7 mL Microcentrifuge Tubes AVANT L211511-CS
10 µL pipette Tips Genesee Scientific  24-140RL
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes Globe scientific 1760
1000 mL Vacuum Filtration Flask NEST 344021
15 mL Centrifuge Tube VWR 10026-076
2 mL Aspirating Pipette NEST 325011
200 µL pipette Tips Genesee Scientific  24-150-RL
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes Globe scientific 1780
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes Globe scientific 1740
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube  12 x 75 mm style Falcon 352054
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style Falcon 352235
50 mL Centrifuge Tube NEST 602052
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid Falcon 353046
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier VWR 56616-031
APC MicroBeads Miltenyi  130-090-855
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec GmBH 4425745
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Biosciences 553141 0.5 mg/mL 
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906 66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) Invitrogen 404-5981 0.2 mg/mL
C57BL/6J Mice Jackson Laboratory  664
Carbon Dioxide Gas Tank Airgas CD50
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 Invitrogen 25-0311-82 0.2 mg/mL
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC Invitrogen 17-0451-82 0.2 mg/mL
Cell Strainer 70 µm Nylon  Falcon 352350
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL Cole-Parmer EW-63100-62
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138-500MG
Collagenase Type I STEMCELL 7415
Corning Mini Centrifuge CORNING 6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller Corning 4099
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4513
Dispase II, powder Gibco 117105041
DPBS 10x gibco 14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer Invitrogen 00-4333-57
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) VWR 89125-174
Fine scissors - sharp Fine Science Tools 14061-10
Foundation B Fetal Bovine Serum GeminiBio 900-208
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits FisherScientific  F167370G
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x gibco 14185-052
Hemocytometer Fisher 02-671-10
Incubator  BINDER C150-UL
Kimwipes KIMTECH K222101
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Nuaire NU-425-400
LD Columns Miltenyi Biotec GmBH 130-042-901
LSE Vortex Mixer CORNING 6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1 Becton, Dickinson and Company 647800L6
MACS MULTI STAND  Miltenyi Biotec GmBH 130-042-303
MACsmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec GmBH 130-090-753
mIgG Millipore-Sigma 18765-10mg 2 mg/mL 
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice Jackson Laboratory  010505
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) Biolegend 104106 0.2 mg/mL
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) Biolegend 135920 0.2 mg/mL
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122 10,000 U/mL
Plastipak 3 mL Syringe Becton, Dickinson and Company 309657
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water ThermoFisher Scientific P3566
QuadroMACS  Separator  Miltenyi Biotec GmBH 130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge Thermo Scientific  75009521
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC Invitrogen 17-5921-82 0.2 mg/mL
Trypan Blue Solution 0.4% Gibco 15-250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0  Invitrogen 15575-038

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References

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मायलोइड्सप्लास्टिक सिंड्रोम और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंटल आबादी की पहचान करना
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Kaszuba, C. M., Rodems, B. J.,… More

Kaszuba, C. M., Rodems, B. J., Sharma, S., Franco, E. I., Ashton, J. M., Calvi, L. M., Bajaj, J. Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (201), e66093, doi:10.3791/66093 (2023).

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