Summary
Her presenteres en detaljert protokoll for å isolere og karakterisere benmargens mikromiljøpopulasjoner fra murine modeller av myelodysplastiske syndromer og akutt myelogen leukemi. Denne teknikken identifiserer endringer i den ikke-hematopoietiske benmargnisjen, inkludert endotel- og mesenkymale stromale celler, med sykdomsprogresjon.
Abstract
Benmargens mikromiljø består av forskjellige cellepopulasjoner, som mesenkymale stromale celler, endotelceller, osteolineageceller og fibroblaster, som gir støtte til hematopoietiske stamceller (HSC). I tillegg til å støtte normale HSC, spiller benmargens mikromiljø også en rolle i utviklingen av hematopoietiske stamcelleforstyrrelser, som myelodysplastisk syndrom (MDS) og akutt myelogen leukemi (AML). MDS-assosierte mutasjoner i HSC fører til en blokk i differensiering og progressiv benmargssvikt, spesielt hos eldre. MDS kan ofte utvikle seg til terapiresistent AML, en sykdom preget av en rask akkumulering av umodne myeloide blaster. Benmargens mikromiljø er kjent for å være endret hos pasienter med disse myeloide neoplasmene. Her beskrives en omfattende protokoll for å isolere og fenotypisk karakterisere benmargsmikromiljøceller fra murinmodeller av myelodysplastisk syndrom og akutt myelogen leukemi. Isolering og karakterisering av endringer i benmargens nisjepopulasjoner kan bidra til å bestemme deres rolle i sykdomsinitiering og progresjon, og kan føre til utvikling av nye terapeutiske midler rettet mot kreftfremmende endringer i benmargsstromale populasjoner.
Introduction
Benmargens mikromiljø består av hematopoietiske celler, ikke-hematopoietiske stromale celler og den ekstracellulære matriksen 1,2. Dette mikromiljøet kan fremme hematopoietisk stamcellefornyelse, regulere avstamningsdifferensiering og gi strukturell og mekanisk støtte til beinvevet 1,2,3,4,5. Den stromale nisjen inkluderer osteolineageceller, fibroblaster, nerveceller og endotelceller6, mens den hematopoietiske nisjen består av lymfoide og myeloide populasjoner 1,2,3. I tillegg til å støtte normale HSC-er, kan benmargens mikromiljø også spille en rolle i utviklingen av hematopoietiske stamcelleforstyrrelser som MDS og AML 7,8,9,10,11. Mutasjoner i osteolineære celler har vist seg å fremme utviklingen av MDS, AML og andre myeloproliferative neoplasmer 10,12,13,14.
Myelodysplastisk syndrom er en gruppe pre-leukemiske lidelser som oppstår fra mutasjoner i hematopoietiske stamceller. MDS er ofte forbundet med en blokk i HSC-differensiering og produksjon av dysplastiske celler, noe som ofte kan føre til benmargssvikt. MDS er den mest diagnostiserte myeloide neoplasma i USA og er forbundet med en 3-års overlevelse på 35% -45%15. MDS er ofte forbundet med høy risiko for transformasjon til akutt myelogen leukemi. Dette kan være en dødelig komplikasjon, da MDS-avledet AML er motstandsdyktig mot de fleste terapier og sannsynligvis vil komme tilbake. AML som oppstår de novo på grunn av translokasjoner eller mutasjoner i hematopoietisk stamme og forfedre er også ofte resistent mot standard kjemoterapi16,17. Siden MDS og AML primært er sykdommer hos eldre, med flertallet diagnostisert over 60 år, er de fleste pasienter ikke kvalifisert for kurative benmargstransplantasjoner. Det er derfor et betydelig behov for å identifisere nye regulatorer av sykdomsprogresjon. Siden benmargens mikromiljø kan gi støtte til ondartede celler14, kan definering av endringer i benmargsnisjen med sykdomsprogresjon føre til identifisering av nye terapier som tar sikte på å hemme tumornisjeremodellering. Det er derfor et betydelig behov for å identifisere nye regulatorer av sykdomsprogresjon. For dette formål er det avgjørende å identifisere og karakterisere endringer i benmargsstromale cellepopulasjoner som kan gi støtte til de ondartede cellene.
Flere murine modeller av AML og MDS har blitt generert og kan brukes til å studere endringer i benmargens mikromiljø under sykdomsstart og progresjon 6,1,19,20,21,22. Her beskrives protokoller for å identifisere endringer i benmargsstromale cellepopulasjoner ved bruk av murine modeller av retroviralt indusert AML 6,20, samt den kommersielt tilgjengelige Nup98-HoxD13 (NHD13) modellen av høyrisiko MDS til AML transformasjon19. Mus transplantert med de novo AML-celler bukker under for sykdommen i 20-30 dager6. NHD13-musene utvikler cytopenier og benmargsdysplasi rundt 15-20 uker, som til slutt forvandles til AML, og nesten 75% av musene bukker under for sykdommen rundt 32 uker. For å analysere murine modellen benmarg mikromiljø populasjoner, blir bein høstet, benmarg og bein spicules fordøyes ved hjelp av enzymatisk fordøyelse, og cellene blir deretter beriket for CD45-/Ter119- ikke-hematopoietiske populasjoner ved magnetisk sortering. Mens lignende analyser tidligere er beskrevet 11,13,22,23,24,25, fokuserer de ofte på enten benmargen eller beinet og inkluderer ikke celler fra begge kilder i sine analyser. Den kombinerte karakteriseringen av disse populasjonene, sammen med genuttrykksanalyser, kan gi en helhetlig forståelse av hvordan det cellulære hematopoietiske mikromiljøet gir støtte til sykdomsinitiering og progresjon (figur 1). Mens protokollen beskrevet nedenfor fokuserer på retroviralt indusert AML-modell og en genetisk MDS-modell, kan disse strategiene lett tilpasses for å studere endringer i beinmargnisjen til enhver murine modell av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med protokoller godkjent av University of Rochester University Committee on Animal Resources. Mus ble avlet og vedlikeholdt i dyrepleiefasilitetene ved University of Rochester. For å modellere høyrisiko MDS brukes den kommersielt tilgjengelige NHD13 murine modell19. I denne modellen analyseres benmargsstromale celler hos kvinnelige NHD13-mus ved 8 ukers alder, før sykdomsutbrudd. De novo AML genereres som tidligere beskrevet 6,11,20. Onkogenene som brukes til å indusere AML, som MLL-AF9 og NRas, er merket med GFP eller YFP, noe som muliggjør analyse av de ikke-leukemiske GFP-benmargpopulasjonene ved bruk av flowcytometri. Kort fortalt transplanteres 10 uker gamle kvinnelige C57BL/6J-mus med murin GFP/YFP+ AML-celler, og benmargen høstes 2 uker etter transplantasjonen. Mens kvinnelige mus brukes i denne studien for demonstrasjonsformål, kan denne protokollen utføres med enten mannlige eller kvinnelige mus. Det kan også utføres ved hjelp av enten ett lårben eller alle lange bein.
1. Benmarg høsting
MERK: For detaljer om dyredisseksjonsprotokollen, se Amend et al.26.
- Rengjør mørtelen og støt med 70% etanol, skyll dem med kjølt FACS-buffer (tabell 1), og legg dem på is for å avkjøles før du starter høsten. Plasser også MACs buffer (tabell 1) på benken for å la den nå romtemperatur.
- Avlive dyret etter institusjonens dyrepleie og bruk retningslinjer og protokoller.
- Spray musen grundig med 70% etanol på benken til pelsen er våt. Bruk tang og buet saks, løft huden på magen og lag to snitt ca. 0,5 mm i lengde på begge sider av musen, lateralt fra magen. Deretter gjør du et 0,5 mm snitt distalt fra magen. Trekk ned for å fjerne hud og pels fra musens ben.
- Plasser saks vinkelrett på bekkenet, trykk ned mens du trekker opp på lårbenet med tang. Lårhodet skal løsne fra bekkenet. Separat lårben og tibia ved patellofemoral ledd. Plasser beinene i FACS-buffer i en 6-brønns plate på is.
- Fjern vev fra beinene ved hjelp av laboratoriekvalitetsvev og legg de rensede beinene i en ny 6-brønnsplate med fersk FACS-buffer på is.
- Plasser alle bein i mørtelen med 2-5 ml FACS-buffer slik at alle bein er nedsenket i bufferen (juster volumet av buffer basert på hvor mange bein du behandler). Knus og slip beinene ved hjelp av stammen i en sirkulær bevegelse til beinmargvevet slippes ut.
- Bruk en 3 ml sprøyte, homogeniser benmargen ved å trekke opp og skylle ned væsken fra mørtelen.
- Bruk en 3 ml sprøyte til å trekke opp væsken fra mørtelen og filtrer den gjennom en 70 μm cellesil til et 50 ml rør på is. Skyll ben-/vevsbitene fra filteret tilbake i mørtelen med FACS-buffer og gå tilbake til trinn 1.7 for å homogenisere og sile en gang til. Dette utgjør benmargsfraksjonen.
- Skyll de resterende beinbitene (spicules) tilbake i mørtelen med FACS-buffer og skyll dem inn i et 15 ml rør ved hjelp av FACS-buffer for å sikre maksimal celleutbytte. Dette er beinspiculesfraksjonen.
2. Fordøyelse av benmarg
- Sentrifuger benmargen ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Dekanter og kast supernatanten.
- Benmargen blandes godt i 2 ml av benmargsfordøyelsesblandingen (tabell 1) og overfør den til en 15 ml slange. Inkuber ved 37 °C i 45 minutter på en rotator.
- Tilsett 10 ml FACS-buffer for å stoppe den enzymatiske fordøyelsen. Filtrer blandingen gjennom en 70 μm cellesil til et nytt 50 ml rør.
- Pellet blandingen ved 400 x g i 7 minutter ved 4 °C.
- Resuspender benmargspelleten i 1 ml RBC lysisbuffer (se materialtabell). Inkuber i 4 min på is.
- Legg til 10 ml FACS-buffer for å stoppe lyseringen. Filtrer blandingen gjennom en 70 μm cellesil til et nytt 50 ml rør.
- Pellet blandingen ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 100 mikrol FACS-buffer.
3. Fordøyelse av bein spicules
- Virv beinspicules fra trinn 1.9 og la dem sette seg. Dekanter supernatanten og behold benet nederst.
- Resuspender benspicules i 1 ml av benspicule fordøyelsesblandingen (tabell 1).
- Plasser slangene på en rørrotator i 60 minutter ved 37 °C.
- Tilsett 10 ml FACS-buffer for å stoppe den enzymatiske fordøyelsen. Filtrer blandingen gjennom en 70 μm cellesil inn i 50 ml røret som inneholder RBC-lysert og fordøyd benmarg.
4. Farging
- Bland forsiktig benspicules og benmargcellesuspensjon.
- Bruk 10 μL av cellesuspensjonen til å telle det levende celletallet på et hemocytometer ved bruk av 0,4% Trypan blåbasert farging, som beskrevet i publiserte protokoller27. Samle 50 000 celler for en ufarget kontroll fra cellesuspensjonen.
- Sentrifuger de resterende cellene ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og resuspender dem i 100 μL FACS-buffer.
MERK: Antistoffer kan titreres for å bestemme den ideelle fortynningen. Antistoffvalg (epitoper og fluorokrom) kan tilpasses. - For farging med antistoffer for magnetisk uttømming, tilsett FC-blokk (1 μL per 25 x 106 celler), CD45-APC (10 μL per 25 x 106 celler) og Ter119-APC (4 μL per 25 x 106 celler) (se materialfortegnelse).
- Inkuber på is i 20 min. Vask med FACS-buffer, fjern 50 000 celler (~50 μL) for APC-farget kontroll, sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, og resuspender i 100 μL FACS-buffer.
- For farging av cellesuspensjonen med mikroperler for magnetisk uttømming, tilsett mIgG (8 μL per 25 x 106 celler) og Anti-APC mikroperler (20 μL per 25 x 106 celler) (se materialfortegnelse).
- Inkuber på is i 20 min. Vask med 10 ml FACS-buffer, sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
5. Uttømming av prøve ved magnetisk sortering
MERK: Dette trinnet utføres ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig manuell magnetisk separator i henhold til produsentens instruksjoner. Dette trinnet kan også utføres med en automatisert separator (se Materialfortegnelse).
- Forbered LD-kolonnen ved å vaske den med 2 ml MAC-buffer (tabell 1). Kast avløpsvannet og bytt oppsamlingsrør.
- Resuspender opptil 1 x 108 celler i MAC-buffer og filtrer dem gjennom et 5 ml reagensrør med en 35 μm cellesilhette.
- Plasser LD-kolonnen på det magnetiske separatorstativet. Plasser et 5 ml reagensrør under kolonnen for å samle opp eluatet.
- Legg cellesuspensjonen til den forberedte LD-kolonnen. La den negative fraksjonen strømme gjennom i oppsamlingsrøret. Vask kolonnen to ganger med 1 ml MAC-buffer, og samle eluatet i samme rør. Dette er den negative brøken som ble brukt i trinn 5.6 nedenfor.
- Fjern LD-kolonnen fra magnetseparatorstativet og plasser den på et nytt 5 ml reagensrør. Bruk en pipette til å dispensere 3 ml buffer i kolonnen for å skylle ut celler som er positivt merket, ved hjelp av kolonnestempelet.
- Sentrifuger de negative og positive fraksjonene ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Gjenta dem i 100 μL FACS-buffer.
- Telle 10 μL av de negative og positive fraksjonene med 0,4% Trypan blå. Volumene for osteo-analyse/endotelpanelfarging nedenfor vil være basert på dette celletallet.
- Bruk 50 000 levende celler fra den positive fraksjonen for gatingkontroller for flowcytometri.
6. Osteo-analyse/endotelpanelflekk
MERK: Kompensasjon skal utføres i henhold til standard flowcytometriprotokoller, inkludert alle egnede farge- og gatingkontroller.
- For farging av CD45/Ter119 negativ fraksjon (1 μL av hvert antistoff per 1 x 106 celler), tilsett CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE og CD140a-PE-Cy5 (se Materialfortegnelse).
- Inkuber på is i 20 min. Vask med 2 ml FACS-buffer, sentrifuger deretter ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Tilsett 1 ml FACS-buffer og en 1:1000 fortynning av PI for levende/død farging, og filtrer deretter prøven gjennom et 5 ml reagensrør med en 35 μm cellesilhette.
- Analyser cellene på et flerfarget flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikkelen beskriver en flowcytometribasert metode for analyse av benmargsmikromiljøpopulasjoner, som endotel- og mesenkymale stromale celler, fra MDS- og leukemimurinmodeller (figur 1). Figur 2 viser gatingstrategien for påvisning av populasjoner av interesse, som begynner med seleksjon av celler (P1) i fordøyd og CD45/Ter119 utarmet fraksjon gjennom spredningsprofil forover og på siden. Eksempel på gating av celler i en leukemiprøve er vist i P1 (figur 2A). Singletter er selektert og dubletter er ekskludert fra denne analysen, P2 (figur 2B). Figur 2C viser porter for å velge propidiumjod negative levende celler, P3. Å fokusere på ikke-hematopoietiske stromale populasjoner, celler som er CD45-/Ter119-, P4 (APC, Y-akse) vs. SSC-A er valgt (figur 2D). Denne innledende gating-strategien er vanlig for alle prøver som skal analyseres.
Leukemimurinmodellen brukes til å illustrere gating for endotelceller i figur 2E-G. Figur 2E viser CD31 positiv (Pe-Cy7, Y-aksen) vs. SSC-A-celler i en ikke-kreftkontrollmus samt en leukemisk mus, inngjerdet gjennom P4. Celler positivt merket med CD31 er endotelceller, P5. I figur 2F, inngjerdet gjennom P5, identifiseres arteriolære endotelceller som CD45-Ter119-CD31+Sca1+, P6, og sinusformede endotelceller identifiseres som CD45-Ter119-CD31+Sca1-, P7 (BV421, Y-akse) vs. SSC-A.
Selv om denne analysen fokuserer på ikke-leukemiske benmarg mikromiljøceller, er det også nyttig å bestemme tumorbelastning. Dette kan gjøres med en liten brøkdel av ufordøyd / ikke-utarmet prøve før eksperimentet starter. I denne eksperimentelle kontrollen (stiplede linjer) Figur 2G, representerer P8 tumorbelastning i prøven og P9 representerer de ikke-kreftceller.
MDS-murinmodellen er brukt for å illustrere analyse av mesenkymale stromale celler i figur 2H-J. Figur 2H viser CD31-negativ (Pe-Cy7, Y-akse) vs. SSC-A-celler, inngjerdet gjennom P4. Mesenkymale stromale cellepopulasjoner i villtype kontrollmus og MDS-mus er vist i figur 2I. Styrt gjennom P10 identifiseres mesenkymale stromale celler som CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+, P113 (Pe, Y-akse; Pe-Cy5, X-akse). Den eksperimentelle kontrollen (stiplede linjer), figur 2J viser eksempler på ensfargede gatingkontroller, CD51 enkeltflekk og CD140a enkeltflekk brukt til å gate for MSC-ene vist i eksperimentelle prøver i figur 2I.
Disse dataene indikerer at arteriolære endotelceller ekspanderer signifikant i AML-mikromiljøet, med et samtidig tap i sinusformede endotelpopulasjoner (figur 2F), i samsvar med tidligere studier med pasientavledede xenotransplantater i immundefekte mus28. Det er sannsynlig at den lille ekspansjonen i de mesenkymale stromale cellene sett i NHD13-musene ved 8 ukers alder (figur 2I) kan øke ved 16-20 uker, når disse musene begynner å vise egenskaper ved MDS25. Selv om bare leukemimodellen brukes til å illustrere endotelcellepopulasjonen og MDS-murinmodellen brukes til å illustrere mesenkymale stromale cellepopulasjoner, kan lignende farge- og gatingstrategier brukes til å analysere de forskjellige mikromiljøpopulasjonene i en av disse modellene, eller faktisk i en hvilken som helst genetisk konstruert murinmodell av interesse.
Figur 1 Isolering av stromale celler i beinmargen. Skjematisk viser prosessen med å isolere ikke-hematopoietiske benmargsstromale celler fra kontroll og leukemiske mus. Kort fortalt fordøyes benspicules og benmarg separat og slås deretter sammen. CD45-Ter119- populasjonen er beriket ved magnetisk sortering, og farget med antistoffpaneler mot populasjoner av interesse, for eksempel mesenkymale stromale celler og endotelceller. Cellene analyseres deretter ved hjelp av flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Gating strategi for ikke-hematopoietiske benmargs- og stromale celler. (A-D) Flowcytometri gating strategi brukt til å velge fordøyd, CD45-/Ter119-, ikke-hematopoietiske populasjoner (P4) i både leukemi og MDS murine modell. (E) Leukemi benmarg endotelceller (P5, CD31+) kan deles inn som (F) Sca1+ arteriolære (P6) eller Sca1- sinusformede endotelceller (P7). (G) Leukemi engraftment i en AML prøve hvor P8 representerer engraftment mens P9 representerer ikke-kreftceller. Stiplede linjer indikerer at dette plottet er en eksperimentell kontroll. (H) Gated gjennom P4, MDS benmarg CD31- celler, P10 (I) Mesenkymale stromale celler (CD51 + / CD140a +, P11). (J) Eksempel på enkeltfargegatingkontroller, CD51 (venstre) og CD140a (høyre) som brukes til å bestemme portene for mesenkymale stromale celler i (I). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning | Reagent | Konsentrasjon | Beløp å legge til |
| FACS-buffer | HBSS | 10x | 100 ml |
| EDTA | 0,5 m | 4 ml | |
| Foster Bovine Serum | - | 50 ml | |
| Vann | - | 848 ml | |
| Benmarg fordøyelse blanding | HBSS | 1x | 2 ml |
| DNase 1 | 1 μg/ml i 1x DPBS | 20 μL | |
| Dispase II pulver | - | 4 mg | |
| Kollagenase type IV | - | 2 mg | |
| Bone spicule fordøyelse blanding | DPBS | 1x | 320 ml |
| Kollagenase type 1 | - | 1 g | |
| Foster Bovine Serum | - | 80 ml | |
| MAC-buffer | BSA | 66 g/mol | 5 g |
| DPBS | 10x | 100 ml | |
| EDTA | 0,5 m | 4 ml | |
| Vann | - | 896 L |
Tabell 1: Sammensetning av løsninger og buffere brukt i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Murine leukemi modeller har blitt mye brukt til å identifisere celle inneboende og nisje-drevet signaler som fremmer aggressiv myelogen leukemi progresjon 6,19,21. Her presenteres en omfattende flowcytometribasert protokoll for å definere den cellulære sammensetningen av benmargens mikromiljø i murine modeller av MDS og AML.
Før innhenting av flowcytometriske data fra eksperimentelle prøver er det viktig å kompensere nøye for fluorescensoverlapping. Det er også viktig å inkludere alle passende flekk- og gatingkontroller. Disse trinnene vil tillate eksperimentøren å bekrefte at positiv eller negativ antistofffarging representerer nøyaktig uttrykk for cellemarkører av interesse og ikke er en artefakt av fluorescensspektral overlapping eller autofluorescens. Selv om denne protokollen beskriver utvalgte celleoverflatemarkører, kan antistoffpanelene utvides basert på eksperimentelt behov. For eksempel kan CD144 (Ve-Cadherin) administreres in vivo før høsting av musene og kan tjene som en ekstra spesifikk markør for endotelceller 5,29. Selv om fluoroforene og antistoffklonene som er angitt her, kan endres, bør titreringer utføres for å bestemme deres ideelle fortynning. For kategorisk å definere alle cellepopulasjoner i beinmargsnisjen, kan encellet RNA-sekvensering brukes til å etablere beinmargens nisjelandskap under MDS/AML-initiering og progresjon 23,24,30.
Det er viktig å forberede prøven nøye i henhold til trinnene beskrevet i denne protokollen. Ved homogenisering av beinene er det avgjørende at mørtel og pistol blir avkjølt, og alle trinn utføres på is for å forhindre celledød og for å sikre høy celleutvinning. Det er svært viktig å fjerne alt vev som omgir beinene før homogenisering for å forhindre forurensning av andre uønskede celletyper. Under RBC-lyse og fordøyelser er det viktig å stoppe den enzymatiske reaksjonen med en passende mengde FACS-buffer og resuspendere grundig i frisk buffer, ellers vil cellene fortsette å fordøye og til slutt dø.
Separering av bein- og benmargsfraksjonene er viktig siden beinspicules krever en annen blanding av enzymer for fordøyelsesbuffer og trenger lengre tid å fordøye. I beinfordøyelser er kollagenase type 1 nyttig for å fordøye kollagenasefbriller som ofte finnes i ekstracellulær matrise og kollagenfibre31. I tillegg vil noen benmargceller som ligger nær endosteum forbli festet til beinet etter homogenisering og frigjøres bare ved enzymatisk fordøyelse. Ved fordøyelse av benmarg brukes kollagenase type IV til å fordøye kjellermembranen til epitel- og endotelceller i benmarg32, mens dispase hovedsakelig spalter fibronektin31. Benmargen krever mindre tid å fordøye da assosiasjonene mellom celler og matrise er svakere. Inkubering av benmargsfraksjonen under lignende forhold kan skade populasjonene av interesse. Ved å bruke to forskjellige fordøyelsesbuffere øker antallet stomipopulasjoner som kan detekteres betydelig, og gir dermed et større datasett å analysere.
De fleste tilgjengelige protokoller for å analysere murine benmarg mikromiljøpopulasjoner bruker en sprøyte for å skylle benmargen fra bare de lange beinene13,24. Den nåværende metoden for å knuse bein gir muligheten til å skaffe data fra andre bein som bekkenet, reduserer prøveprepareringstiden betydelig og reduserer muligheten for skader med skarpe nåler. Gitt at beinet består av modne osteoblaster og andre cellepopulasjoner som kan gi støtte til normale og ondartede hematopoietiske celler, muliggjør denne metoden for å inkludere celler fra beinspicules en mer nøyaktig representasjon av beinmargens mikromiljø i prøven. Mens en tidligere studie fordøyde benmarg og bein spicules separat11, viste det ikke farging av osteolineage og endotelceller i samme prøve. En annen studie brukte kommersielt tilgjengelige proprietære enzymblandinger for å fordøye benmarg og beinspicules23, og analyserte dataene ved hjelp av den betydelig dyrere enkeltcelle RNA-sekvenseringsteknologien. Denne metoden for berikelse for CD45-/Ter119- celler selekterer for celler av interesse, og reduserer signifikant tiden det tar å skaffe data på flowcytometeret. Således, sammenlignet med andre toppmoderne metoder som enkeltcelle RNA-sekvensering, er denne flowcytometribaserte metoden mer tilgjengelig, kostnadseffektiv og krever ikke sofistikert analyse av trente bioinformatikere 23,24,30.
Det er viktig å merke seg at denne protokollen kan brukes til å karakterisere benmargens mikromiljø av ikke bare noen av de tilgjengelige murinmodellene av MDS og AML, men enhver genetisk musemodell. Lignende metoder kan også være effektive for å analysere endringene i murine benmargsnisje av pasientavledet xenograft (PDX) modeller. Disse metodene kan være nyttige for studier som tar sikte på å bestemme mekanismene som MDS / AML påvirker deres benmargnisje. Gitt de tekniske utfordringene forbundet med prøvetaking av store mengder benmarg fra humane pasienter, er disse analysene av murine modeller et effektivt verktøy for å fremme forståelsen av det ondartede benmargsmikromiljøet og definere dets rolle i sykdomsprogresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter oppgitt.
Acknowledgments
Vi takker URMC Flow Cytometry Core. Dette arbeidet ble støttet av American Society of Hematology Scholar Award, Leukemia Research Foundation award og NIH tilskudd R01DK133131 og R01CA266617 tildelt JB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
- Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
- Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
- Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
- Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
- Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
- Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
- Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
- Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W.
- Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
- Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
- Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
- Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
- Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
- Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).
