Summary
Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.
Abstract
El microambiente de la médula ósea está formado por distintas poblaciones celulares, como las células estromales mesenquimales, las células endoteliales, las células del linaje osteológico y los fibroblastos, que proporcionan soporte a las células madre hematopoyéticas (CMH). Además de apoyar las HSC normales, el microambiente de la médula ósea también desempeña un papel en el desarrollo de trastornos de las células madre hematopoyéticas, como los síndromes mielodisplásicos (SMD) y la leucemia mieloide aguda (LMA). Las mutaciones asociadas a los SMD en las CMH conducen a un bloqueo en la diferenciación y a una insuficiencia progresiva de la médula ósea, especialmente en los ancianos. A menudo, los SMD pueden progresar a LMA resistente a la terapia, una enfermedad caracterizada por una rápida acumulación de blastocitos mieloides inmaduros. Se sabe que el microambiente de la médula ósea está alterado en pacientes con estas neoplasias mieloides. En este trabajo se describe un protocolo completo para aislar y caracterizar fenotípicamente células microambientales de la médula ósea a partir de modelos murinos de síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda. Aislar y caracterizar los cambios en las poblaciones del nicho de la médula ósea puede ayudar a determinar su papel en el inicio y la progresión de la enfermedad y puede conducir al desarrollo de nuevas terapias dirigidas a las alteraciones promotoras del cáncer en las poblaciones del estroma de la médula ósea.
Introduction
El microambiente de la médula ósea está formado por células hematopoyéticas, células estromales no hematopoyéticas y la matriz extracelular 1,2. Este microambiente puede promover la autorrenovación de las células madre hematopoyéticas, regular la diferenciación del linaje y proporcionar soporte estructural y mecánico al tejido óseo 1,2,3,4,5. El nicho estromal incluye células osteolinajes, fibroblastos, células nerviosas y células endoteliales6, mientras que el nicho hematopoyético está formado por las poblaciones linfoides y mieloides 1,2,3. Además de apoyar las CMH normales, el microambiente de la médula ósea también puede desempeñar un papel en el desarrollo de trastornos de las células madre hematopoyéticas, como los SMD y la LMA 7,8,9,10,11. Se ha demostrado que las mutaciones en las células del linaje osteológico promueven el desarrollo de SMD, LMA y otras neoplasias mieloproliferativas 10,12,13,14.
Los síndromes mielodisplásicos son un grupo de trastornos preleucémicos que surgen de mutaciones en las células madre hematopoyéticas. El SMD se asocia con frecuencia con un bloqueo en la diferenciación de las HSC y la producción de células displásicas, lo que a menudo puede conducir a insuficiencia de la médula ósea. El SMD es la neoplasia mieloide más comúnmente diagnosticada en los Estados Unidos y se asocia con una tasa de supervivencia a 3 años del 35% al 45%15. Los SMD a menudo se asocian con un alto riesgo de transformación a leucemia mieloide aguda. Esto puede ser una complicación mortal, ya que la LMA derivada de SMD es resistente a la mayoría de las terapias y es probable que recaiga. La LMA que surge de novo debido a translocaciones o mutaciones en el tallo hematopoyético y los progenitores también suele ser resistente a la quimioterapia estándar16,17. Dado que los SMD y la LMA son principalmente enfermedades de los ancianos, y la mayoría se diagnostican después de los 60 años, la mayoría de los pacientes no son elegibles para trasplantes curativos de médula ósea. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de identificar nuevos reguladores de la progresión de la enfermedad. Dado que el microambiente de la médula ósea puede proporcionar apoyo a las células malignas14, la definición de los cambios en el nicho de la médula ósea con la progresión de la enfermedad puede conducir a la identificación de nuevas terapias destinadas a inhibir la remodelación del nicho tumoral. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de identificar nuevos reguladores de la progresión de la enfermedad. Con este fin, es fundamental identificar y caracterizar los cambios en las poblaciones de células estromales de la médula ósea que pueden proporcionar apoyo a las células malignas.
Se han generado varios modelos murinos de LMA y SMD que pueden utilizarse para estudiar los cambios en el microambiente de la médula ósea durante el inicio y la progresión de la enfermedad 6,1,19,20,21,22. En este trabajo se describen los protocolos para identificar los cambios en las poblaciones de células estromales de la médula ósea utilizando modelos murinos de LMA inducida por retrovirales 6,20, así como el modelo Nup98-HoxD13 (NHD13) disponible comercialmente de transformación de SMD de alto riesgo a LMA19. Los ratones trasplantados con células de LMA de novo sucumben a la enfermedad en 20-30 días6. Los ratones NHD13 desarrollan citopenias y displasia de médula ósea alrededor de las 15-20 semanas, que finalmente se transforma en LMA, y casi el 75% de los ratones sucumben a la enfermedad alrededor de las 32 semanas. Para analizar las poblaciones de microambiente de médula ósea modelo murino, se recolectan huesos, se digieren médula ósea y espículas óseas mediante digestión enzimática, y luego se enriquecen las células para poblaciones no hematopoyéticas CD45-/Ter119- mediante clasificación magnética. Si bien se han descrito previamente análisis similares 11,13,22,23,24,25, a menudo se centran en la médula ósea o en el hueso y no incorporan células de ambas fuentes en sus análisis. La caracterización combinada de estas poblaciones, junto con los análisis de expresión génica, puede proporcionar una comprensión completa de cómo el microambiente hematopoyético celular proporciona apoyo para el inicio y la progresión de la enfermedad (Figura 1). Si bien el protocolo que se describe a continuación se centra en el modelo de LMA inducida por retrovirales y en un modelo genético de SMD, estas estrategias se pueden adaptar fácilmente para estudiar los cambios en el nicho de la médula ósea de cualquier modelo murino de interés.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Los ratones fueron criados y mantenidos en las instalaciones de cuidado de animales de la Universidad de Rochester. Para modelar los SMD de alto riesgo, se emplea el modelo murino NHD1319 disponible en el mercado. En este modelo, se analizan las células estromales de la médula ósea en ratones hembra NHD13 a las 8 semanas de edad, antes de la aparición de la enfermedad. De novo La LMA se genera como se ha descrito anteriormente 6,11,20. Los oncogenes utilizados para inducir LMA, como MLL-AF9 y NRas, se marcan con GFP o YFP, lo que permite el análisis de las poblaciones de médula ósea GFP no leucémicas mediante citometría de flujo. En resumen, los ratones hembra C57BL/6J de 10 semanas de edad se trasplantan con células murinas de LMA GFP/YFP+, y la médula ósea se extrae 2 semanas después del trasplante. Si bien en este estudio se utilizan ratones hembra con fines de demostración, este protocolo se puede realizar con ratones machos o hembras. También se puede llevar a cabo utilizando un fémur o todos los huesos largos.
1. Extracción de médula ósea
NOTA: Para obtener más información sobre el protocolo de disección animal, consulte Amend et al.26.
- Limpie el mortero con etanol al 70%, enjuáguelos con tampón FACS frío (Tabla 1) y colóquelos en hielo para que se enfríen antes de comenzar la cosecha. Además, coloque el tampón MAC (Tabla 1) en el banco para permitir que alcance la temperatura ambiente.
- Sacrificar al animal siguiendo las pautas y protocolos institucionales de cuidado y uso de animales.
- En la mesa de trabajo, rocíe bien el ratón con etanol al 70% hasta que su pelaje esté mojado. Con pinzas y tijeras curvas, levante la piel del abdomen y haga dos incisiones de aproximadamente 0,5 mm de longitud a ambos lados del ratón, laterales desde el abdomen. A continuación, realice una incisión de 0,5 mm distal desde el abdomen. Tira hacia abajo para quitar la piel y el pelaje de las patas del ratón.
- Coloque las tijeras perpendiculares a la pelvis, presione hacia abajo mientras tira hacia arriba del fémur con fórceps. La cabeza femoral debe separarse de la pelvis. Separe el fémur y la tibia en la articulación patelofemoral. Coloque los huesos en el tampón FACS en una placa de 6 pocillos sobre hielo.
- Extraiga el tejido de los huesos con tejido de laboratorio y coloque los huesos limpios en una nueva placa de 6 pocillos con tampón FACS fresco en hielo.
- Coloque todos los huesos en el mortero con 2-5 ml de tampón FACS para que todos los huesos queden sumergidos en el tampón (ajuste el volumen de tampón en función de la cantidad de huesos que esté procesando). Triture y muela los huesos con el mortero con movimientos circulares hasta que se libere el tejido de la médula ósea.
- Con una jeringa de 3 ml, homogeneice la médula ósea tirando hacia arriba y hacia abajo del líquido del mortero.
- Con una jeringa de 3 ml, extraiga el líquido del mortero y fíltrelo a través de un colador de células de 70 μm en un tubo de 50 ml con hielo. Enjuague los trozos de hueso/tejido del filtro nuevamente en el mortero con tampón FACS y regrese al paso 1.7 para homogeneizar y colar por segunda vez. Esto constituye la fracción de la médula ósea.
- Enjuague las piezas óseas restantes (espículas) nuevamente en el mortero con tampón FACS y enjuáguelas en un tubo de 15 ml con tampón FACS para garantizar el máximo rendimiento celular. Esta es la fracción de las espículas óseas.
2. Digestión de la médula ósea
- Centrifugar la médula ósea a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender la médula ósea en 2 mL de la mezcla de digestión de médula ósea (Tabla 1) y transferirla a un tubo de 15 mL. Incubar a 37 °C durante 45 min en un rotador.
- Agregue 10 ml de tampón FACS para detener la digestión enzimática. Filtre la mezcla a través de un colador de células de 70 μm en un tubo nuevo de 50 ml.
- Diluir la mezcla a 400 x g durante 7 min a 4 °C.
- Vuelva a suspender el gránulo de médula ósea en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (ver Tabla de materiales). Incubar durante 4 minutos en hielo.
- Agregue 10 ml de tampón FACS para detener la lisis. Filtre la mezcla a través de un colador de células de 70 μm en un tubo nuevo de 50 ml.
- Diluir la mezcla a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 100 μL de tampón FACS.
3. Digestión de las espículas óseas
- Agita las espículas óseas del paso 1.9 y deja que se asienten. Decantar el sobrenadante y conservar el hueso en la parte inferior.
- Resuspender las espículas óseas en 1 mL de la mezcla de digestión de la espícula ósea (Tabla 1).
- Coloque los tubos en un rotador de tubos durante 60 minutos a 37 °C.
- Agregue 10 ml de tampón FACS para detener la digestión enzimática. Filtrar la mezcla a través de un colador de células de 70 μm en el tubo de 50 ml que contiene médula ósea lisada y digerida por glóbulos rojos.
4. Tinción
- Mezcle suavemente las espículas óseas y la suspensión de células de la médula ósea.
- Utilizar 10 μL de la suspensión celular para contar el número de células vivas en un hemocitómetro utilizando tinción basada en azul de tripano al 0,4%, como se describe en los protocolos publicados27. Recoja 50.000 células para un control sin tinción de la suspensión celular.
- Centrifugar las células restantes a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspenderlo en 100 μL de tampón FACS.
NOTA: Los anticuerpos se pueden ajustar para determinar la dilución ideal. La selección de anticuerpos (epítopos y fluorocromos) se puede personalizar. - Para la tinción con anticuerpos para la depleción magnética, agregue FC Block (1 μL por 25 x 106 células), CD45-APC (10 μL por 25 x 106 células) y Ter119-APC (4 μL por 25 x 106 células) (consulte la Tabla de materiales).
- Incubar en hielo durante 20 min. Lavar con tampón FACS, extraer 50.000 células (~50 μL) para el control teñido con APC, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C y volver a suspender en 100 μL de tampón FACS.
- Para la tinción de la suspensión celular con microperlas para el agotamiento magnético, agregue mIgG (8 μL por 25 x 106 células) y microperlas anti-APC (20 μL por 25 x 106 células) (ver Tabla de materiales).
- Incubar en hielo durante 20 min. Lavar con 10 ml de tampón FACS, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Agotamiento de la muestra por clasificación magnética
NOTA: Este paso se lleva a cabo utilizando un separador magnético manual disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este paso también se puede realizar con un separador automatizado (ver Tabla de materiales).
- Prepare la columna LD lavándola con 2 mL de tampón MACs (Tabla 1). Deseche el efluente y cambie el tubo de recolección.
- Resuspenda hasta 1 x 108 células en tampón MAC y fíltrelas a través de un tubo de ensayo de 5 ml con una tapa de filtro de células de 35 μm.
- Coloque la columna LD en el soporte del separador magnético. Coloque un tubo de ensayo de 5 ml debajo de la columna para recoger el eluido.
- Agregue la suspensión de celda a la columna LD preparada. Deje que la fracción negativa fluya hacia el tubo de recolección. Lavar la columna dos veces con 1 mL de tampón MACs, recogiendo el eluido en el mismo tubo. Esta es la fracción negativa utilizada en el paso 5.6 a continuación.
- Retire la columna LD del soporte del separador magnético y colóquela en un nuevo tubo de ensayo de 5 ml. Utilice una pipeta para dispensar 3 ml de tampón en la columna para eliminar las células que han sido marcadas positivamente, utilizando el émbolo de columna.
- Centrifugar las fracciones negativa y positiva a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspenderlos en 100 μL de tampón FACS.
- Contar 10 μL de las fracciones negativa y positiva con azul de tripano al 0,4%. Los volúmenes para el osteoanálisis/tinción del panel endotelial a continuación se basarán en este recuento de células.
- Utilice 50.000 células vivas de la fracción positiva para los controles de compuerta de citometría de flujo.
6. Osteoanálisis/tinción del panel endotelial
NOTA: La compensación debe realizarse siguiendo los protocolos estándar de citometría de flujo, incluidos todos los controles apropiados de tinción y compuerta.
- Para la tinción de la fracción negativa CD45/Ter119 (1 μl de cada anticuerpo por 1 x 106 células), agregue CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE y CD140a-PE-Cy5 (consulte la tabla de materiales).
- Incubar en hielo durante 20 min. Lavar con 2 ml de tampón FACS, luego centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
- Agregue 1 ml de tampón FACS y una dilución 1:1000 de PI para tinción viva/muerta, luego filtre la muestra a través de un tubo de ensayo de 5 ml con una tapa de filtro celular de 35 μm.
- Analice las celdas en un citómetro de flujo multicolor.
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Representative Results
En este artículo se describe un método basado en citometría de flujo para analizar poblaciones microambientales de médula ósea, como las células endoteliales y mesenquimales, a partir de modelos murinos de SMD y leucemia (Figura 1). La Figura 2 muestra la estrategia de compuerta para la detección de poblaciones de interés, comenzando con la selección de células (P1) en la fracción digerida y agotada en CD45/Ter119 a través del perfil de dispersión frontal y lateral. En P1 (Figura 2A) se muestra un ejemplo de activación de células en una muestra de leucemia. Se seleccionan singletes y se excluyen de este análisis, P2 (Figura 2B). La Figura 2C muestra las puertas para seleccionar células vivas con yodo propidio negativo, P3. Para centrarse en las poblaciones estromales no hematopoyéticas, las células que son CD45-/Ter119-, P4 (APC, eje Y) frente a Se seleccionan los SSC-A (Figura 2D). Esta estrategia de compuerta inicial es común para todas las muestras que se van a analizar.
El modelo murino de leucemia se utiliza para ilustrar la activación de las células endoteliales en las Figuras 2E-G. La Figura 2E muestra CD31 positivo (Pe-Cy7, eje Y) vs. Células SSC-A en un ratón de control no canceroso, así como en un ratón leucémico, activado a través de P4. Las células marcadas positivamente con CD31 son células endoteliales, P5. En la Figura 2F, compuertas a P5, las células endoteliales arteriolares se identifican como CD45-Ter119-CD31+Sca1+, P6, y las células endoteliales sinusoidales se identifican como CD45-Ter119-CD31+Sca1-, P7 (BV421, eje Y) vs. SSC-A.
Aunque este análisis se centra en las células microambientales de la médula ósea no leucémicas, también es útil para determinar la carga tumoral. Esto se puede hacer con una pequeña fracción de muestra no digerida o no agotada antes de iniciar el experimento. En este control experimental (líneas discontinuas) Figura 2G, P8 representa la carga tumoral en la muestra y P9 representa las células no cancerosas.
El modelo murino MDS se utiliza para ilustrar el análisis de las células estromales mesenquimales en la Figura 2H-J. La Figura 2H muestra CD31 negativo (Pe-Cy7, eje Y) vs. Celdas SSC-A, cerradas a través de P4. En la Figura 2I se muestran las poblaciones de células estromales mesenquimales en un ratón control de tipo salvaje y en un ratón MDS. Activados a través de P10, las células estromales mesenquimales se identifican como CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+, P113 (Pe, eje Y; Pe-Cy5, eje X). El control experimental (líneas discontinuas), la Figura 2J muestra ejemplos de controles de compuerta de un solo color, tinción única CD51 y tinción única CD140a utilizados para controlar las MSC que se muestran en las muestras experimentales de la Figura 2I.
Estos datos indican que las células endoteliales arteriolares se expanden significativamente en el microambiente de la LMA, con una pérdida concomitante en las poblaciones endoteliales sinusoidales (Figura 2F), lo que es consistente con estudios previos que utilizaron xenoinjertos derivados de pacientes en ratones inmunodeficientes28. Es probable que la pequeña expansión de las células estromales mesenquimales observada en los ratones NHD13 a las 8 semanas de edad (Figura 2I) pueda aumentar a las 16-20 semanas, cuando estos ratones comienzan a mostrar características de MDS25. Aunque solo se utiliza el modelo de leucemia para ilustrar la población de células endoteliales y el modelo murino de SMD se utiliza para ilustrar las poblaciones de células estromales mesenquimales, se pueden utilizar estrategias similares de tinción y activación para analizar las diferentes poblaciones microambientales en cualquiera de estos modelos, o de hecho, en cualquier modelo murino de interés modificado genéticamente.
Figura 1: Aislamiento de células estromales de médula ósea. El esquema muestra el proceso de aislamiento de células estromales de médula ósea no hematopoyéticas de ratones control y leucémicos. Brevemente, las espículas óseas y la médula ósea se digieren por separado y luego se agrupan. La población CD45-Ter119- se enriquece mediante clasificación magnética y se tiñe con paneles de anticuerpos contra poblaciones de interés, como las células estromales mesenquimales y las células endoteliales. A continuación, las células se analizan mediante citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategia de activación para células estromales y de médula ósea no hematopoyéticas. (A-D) Estrategia de activación por citometría de flujo utilizada para seleccionar poblaciones no hematopoyéticas (P4) digeridas, CD45-/Ter119-, tanto en el modelo murino de leucemia como en el de SMD. (E) Las células endoteliales de la médula ósea de la leucemia (P5, CD31+) se pueden subdividir como (F) células arteriolares Sca1+ (P6) o células endoteliales sinusoidales Sca1- (P7). (G) Injerto de leucemia en una muestra de LMA donde P8 representa el injerto mientras que P9 representa células no cancerosas. Las líneas punteadas indican que esta parcela es un control experimental. (H) Células CD31- de médula ósea de MDS compuertas a P4, P10 (I) Células estromales mesenquimales (CD51+/CD140a+, P11). (J) Ejemplo de controles de compuerta de un solo color, CD51 (izquierda) y CD140a (derecha) utilizados para determinar las puertas de las células estromales mesenquimales en (I). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Reactivo | Concentración | Cantidad a añadir |
| Búfer FACS | HBSS | 10 veces | 100 ml |
| EDTA | 0,5 m | 4 mL | |
| Suero fetal bovino | - | 50 mL | |
| Agua | - | 848 mL | |
| Mezcla para la digestión de la médula ósea | HBSS | 1 vez | 2 ml |
| DNasa 1 | 1 μg/mL en 1x DPBS | 20 μL | |
| Dispasa II en polvo | - | 4 mg | |
| Colagenasa tipo IV | - | 2 mg | |
| Mezcla para la digestión de la espícula ósea | DPBS | 1 vez | 320 mL |
| Colagenasa tipo 1 | - | 1 g | |
| Suero fetal bovino | - | 80 mL | |
| Búfer de MACs | BSA | 66 g/mol | 5 g |
| DPBS | 10 veces | 100 ml | |
| EDTA | 0,5 m | 4 mL | |
| Agua | - | 896 L |
Tabla 1: Composición de las soluciones y tampones utilizados en el presente estudio.
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Discussion
Los modelos de leucemia murina se han utilizado ampliamente para identificar señales intrínsecas y de nicho celular que promueven la progresión agresiva de la leucemia mieloide 6,19,21. Aquí, se presenta un protocolo integral basado en citometría de flujo para definir la composición celular del microambiente de la médula ósea en modelos murinos de SMD y LMA.
Antes de adquirir datos de citometría de flujo de muestras experimentales, es importante compensar cuidadosamente la superposición de fluorescencia. También es esencial incluir todos los controles apropiados de tinción y compuertas. Estos pasos permitirán al experimentador confirmar que la tinción de anticuerpos positivos o negativos representa una expresión precisa de marcadores celulares de interés y no es un artefacto de fluorescencia, superposición espectral o autofluorescencia. Aunque este protocolo describe marcadores de superficie celular seleccionados, los paneles de anticuerpos pueden ampliarse en función de las necesidades experimentales. Por ejemplo, CD144 (Ve-Cadherin) puede administrarse in vivo antes de la recolección de los ratones y puede servir como un marcador específico adicional de las células endoteliales 5,29. Si bien los fluoróforos y los clones de anticuerpos indicados aquí se pueden cambiar, se deben realizar valoraciones para determinar su dilución ideal. Para definir categóricamente todas las poblaciones celulares en el nicho de la médula ósea, se puede utilizar la secuenciación de ARN de una sola célula para establecer el panorama del nicho de la médula ósea durante el inicio y la progresión de los SMD/LMA 23,24,30.
Es fundamental preparar la muestra cuidadosamente según los pasos descritos en este protocolo. Al homogeneizar los huesos, es crucial que el mortero se enfríe y que todos los pasos se lleven a cabo en hielo para evitar la muerte celular y garantizar una alta recuperación celular. Es muy importante eliminar todo el tejido que rodea los huesos antes de homogeneizarlos para evitar la contaminación de otros tipos de células no deseadas. Durante la lisis y la digestión de los glóbulos rojos, es importante detener la reacción enzimática con una cantidad adecuada de tampón FACS y resuspenderlo completamente en un tampón fresco, o las células continuarán digeriéndose y eventualmente morirán.
Separar las fracciones óseas y de médula ósea es esencial, ya que las espículas óseas requieren una mezcla diferente de enzimas para el tampón de digestión y necesitan más tiempo para digerirse. En las digestiones óseas, la colagenasa tipo 1 es útil para digerir las fibrillas de colagenasa que se encuentran comúnmente en la matriz extracelular y en las fibras de colágeno31. Además, algunas células de la médula ósea ubicadas cerca del endostio permanecerán adheridas al hueso después de la homogeneización y solo se liberan por digestión enzimática. Al digerir la médula ósea, la colagenasa tipo IV se utiliza para digerir la membrana basal de las células epiteliales y endoteliales dentro de la médula ósea32, mientras que la dispasa escinde principalmente la fibronectina31. La médula ósea requiere menos tiempo para digerirse, ya que las asociaciones entre las células y la matriz son más débiles. La incubación de la fracción de médula ósea en condiciones similares puede dañar las poblaciones de interés. El uso de dos tampones de digestión diferentes aumenta significativamente el número de poblaciones estomales que se pueden detectar y, por lo tanto, proporciona un conjunto de datos más grande para analizar.
La mayoría de los protocolos disponibles para analizar las poblaciones microambientales de médula ósea murina utilizan una jeringa para limpiar la médula ósea solo de los huesos largos13,24. El método actual de trituración de huesos proporciona la capacidad de adquirir datos de otros huesos, como la pelvis, reduce significativamente el tiempo de preparación de la muestra y mitiga la posibilidad de lesiones con agujas afiladas. Dado que el hueso está formado por osteoblastos maduros y otras poblaciones celulares que pueden proporcionar soporte a las células hematopoyéticas normales y malignas, este método de inclusión de células de las espículas óseas permite una representación más precisa del microambiente de la médula ósea en la muestra. Si bien un estudio previo digirió la médula ósea y las espículas óseas por separado11, no demostró tinción de células osteolinales y endoteliales en la misma muestra. Un segundo estudio utilizó mezclas de enzimas patentadas disponibles comercialmente para digerir la médula ósea y las espículas óseas23, y analizó los datos utilizando la tecnología de secuenciación de ARN de una sola célula, significativamente más costosa. Este método de enriquecimiento para células CD45-/Ter119- selecciona las células de interés y reduce significativamente el tiempo necesario para adquirir datos en el citómetro de flujo. Por lo tanto, en comparación con otros métodos de última generación, como la secuenciación de ARN de una sola célula, este método basado en citometría de flujo es más accesible, rentable y no requiere un análisis sofisticado por parte de bioinformáticos capacitados 23,24,30.
Es importante tener en cuenta que este protocolo se puede utilizar para caracterizar el microambiente de la médula ósea no solo de cualquiera de los modelos murinos disponibles de SMD y LMA, sino de cualquier modelo genético de ratón. Métodos similares también pueden ser eficaces para analizar los cambios en el nicho de la médula ósea murina de los modelos de xenoinjertos derivados de pacientes (PDX). Estos métodos pueden ser útiles para estudios dirigidos a determinar los mecanismos por los cuales los SMD/LMA afectan su nicho de médula ósea. Dados los desafíos técnicos asociados con el muestreo de grandes cantidades de médula ósea de pacientes humanos, estos análisis de modelos murinos son una herramienta eficaz para avanzar en la comprensión del microambiente maligno de la médula ósea y definir su papel en la progresión de la enfermedad.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al Núcleo de Citometría de Flujo del URMC. Este trabajo fue apoyado por el Premio Académico de la Sociedad Americana de Hematología, el Premio de la Fundación para la Investigación de la Leucemia y las subvenciones de los NIH R01DK133131 y R01CA266617 otorgadas a J.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
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