Summary
כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.
Abstract
מיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מאוכלוסיות תאים נפרדות, כגון תאי סטרומה מזנכימליים, תאי אנדותל, תאי אוסטאו-שושלת ופיברובלסטים, המספקים תמיכה לתאי גזע המטופויטיים (HSC). בנוסף לתמיכה ב-HSC תקין, מיקרו-סביבה של מח העצם ממלאת גם תפקיד בהתפתחות הפרעות תאי גזע המטופויאטיות, כגון תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS) ולוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מוטציות הקשורות ל- MDS ב- HSCs מובילות לחסימה בהתמיינות ואי ספיקת מח עצם מתקדמת, במיוחד אצל קשישים. MDS יכול לעתים קרובות להתקדם AML עמיד לטיפול, מחלה המאופיינת על ידי הצטברות מהירה של פיצוצים מיאלואידים לא בוגרים. מיקרו-סביבה של מח העצם ידועה כמשתנה בחולים עם גידולים מיאלואידים אלה. כאן מתואר פרוטוקול מקיף לבידוד ואפיון פנוטיפי של תאים מיקרו-סביבתיים של מח עצם ממודלים מורינים של תסמונת מיאלודיספלסטית ולוקמיה מיאלואידית חריפה. בידוד ואפיון שינויים באוכלוסיית נישות מח העצם יכול לסייע בקביעת תפקידם בהתחלת המחלה והתקדמותה, ועשוי להוביל לפיתוח טיפולים חדשניים המתמקדים בשינויים מקדמי סרטן באוכלוסיית סטרומה מח העצם.
Introduction
המיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מתאים המטופויטיים, תאי סטרומה לא המטופויטיים והמטריצה החוץ תאית 1,2. מיקרו-סביבה זו יכולה לקדם התחדשות עצמית של תאי גזע המטופויטיים, לווסת התמיינות שושלת ולספק תמיכה מבנית ומכנית לרקמת העצם 1,2,3,4,5. נישת הסטרומה כוללת תאי אוסטאו-שושלת, פיברובלסטים, תאי עצב ותאי אנדותל6, בעוד שהנישה ההמטופויטית מורכבת מאוכלוסיות הלימפה והמיאלואידים 1,2,3. בנוסף לתמיכה ב-HSCs נורמליים, מיקרו-סביבה של מח העצם יכולה גם למלא תפקיד בהתפתחות של הפרעות תאי גזע המטופויטיים כגון MDS ו-AML 7,8,9,10,11. מוטציות בתאי אוסטאו-שושלת הוכחו כמקדמות התפתחות של MDS, AML וגידולים מיאלופרוליפרטיביים אחרים 10,12,13,14.
תסמונות מיאלודיספלסטיות הן קבוצה של הפרעות טרום לוקמיות הנובעות ממוטציות בתאי גזע המטופויטיים. MDS קשור לעתים קרובות עם בלוק בהתמיינות HSC וייצור של תאים דיספלסטיים, אשר לעתים קרובות יכול להוביל לאי ספיקת מח עצם. MDS הוא הניאופלזמה המיאלואידית המאובחנת הנפוצה ביותר בארצות הברית והוא קשור לשיעור הישרדות של 3 שנים של 35%-45%15. MDS קשור לעתים קרובות עם סיכון גבוה של טרנספורמציה לוקמיה מיאלואידית חריפה. זה יכול להיות סיבוך קטלני, שכן AML נגזר MDS עמיד לרוב הטיפולים וסביר להניח להישנות. AML המתעורר דה נובו עקב טרנסלוקציות או מוטציות בגזע hematopoietic ואבות הוא גם עמיד לעתים קרובות כימותרפיה סטנדרטית16,17. מכיוון ש- MDS ו- AML הן בעיקר מחלות של קשישים, כאשר רובם מאובחנים מעל גיל 60 שנה, רוב החולים אינם כשירים להשתלת מח עצם מרפאת. יש, אם כן, צורך משמעותי לזהות רגולטורים חדשים של התקדמות המחלה. מכיוון שהמיקרו-סביבה של מח העצם יכולה לספק תמיכה לתאים ממאירים14, הגדרת שינויים בנישת מח העצם עם התקדמות המחלה עשויה להוביל לזיהוי טיפולים חדשניים שמטרתם לעכב עיצוב מחדש של נישת הגידול. יש, אם כן, צורך משמעותי לזהות רגולטורים חדשים של התקדמות המחלה. לשם כך, קריטי לזהות ולאפיין שינויים באוכלוסיית תאי הסטרומה של מח העצם שעשויים לספק תמיכה לתאים הממאירים.
מספר מודלים של AML ו- MDS נוצרו וניתן להשתמש בהם כדי לחקור שינויים במיקרו-סביבה של מח העצם במהלך התחלת המחלה והתקדמותה 6,1,19,20,21,22. כאן, מתוארים פרוטוקולים לזיהוי שינויים באוכלוסיית תאי סטרומה של מח העצם באמצעות מודלים מורינים של AML 6,20 המושרה רטרו-ויראלית, כמו גם מודל Nup98-HoxD13 (NHD13) הזמין מסחרית של MDS בסיכון גבוה לשינוי AML19. עכברים שהושתלו בהם תאי AML דה נובו נכנעים למחלה תוך 20-30 יום6. עכברי NHD13 מפתחים ציטופניה ודיספלסיה של מח עצם בסביבות 15-20 שבועות, אשר בסופו של דבר הופכת ל-AML, וכמעט 75% מהעכברים נכנעים למחלה בסביבות 32 שבועות. כדי לנתח את אוכלוסיות המיקרו-סביבה של מח עצם מודל מורין, עצמות נקצרות, מח עצם וקוצים עצם מתעכלים באמצעות עיכול אנזימטי, ולאחר מכן התאים מועשרים עבור CD45-/Ter119- אוכלוסיות שאינן המטופויטיות על ידי מיון מגנטי. בעוד שניתוחים דומים תוארו בעבר 11,13,22,23,24,25, הם מתמקדים לעתים קרובות במח העצם או בעצם ואינם משלבים תאים משני המקורות בניתוחים שלהם. האפיון המשולב של האוכלוסיות האלה, בשילוב עם ניתוחי ביטוי גנים, יכול לספק הבנה מקיפה של האופן שבו המיקרו-סביבה ההמטופויטית התאית מספקת תמיכה להתחלת מחלות והתקדמותן (איור 1). בעוד שהפרוטוקול המתואר להלן מתמקד במודל AML המושרה רטרו-ויראלית ובמודל MDS גנטי, ניתן להתאים אסטרטגיות אלה בקלות לחקר שינויים בנישת מח העצם של כל מודל מורין מעניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה למשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. עכברים גודלו והוחזקו במתקני הטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר. כדי למדל MDS בסיכון גבוה, נעשה שימוש בדגם NHD13 murine19 הזמין מסחרית. במודל זה, תאי סטרומה של מח עצם מנותחים בנקבות עכברי NHD13 בגיל 8 שבועות, לפני הופעת המחלה. דה נובו AML נוצרכמתואר קודם 6,11,20. האונקוגנים המשמשים להשראת AML, כגון MLL-AF9 ו-NRas, מתויגים ב-GFP או YFP, ומאפשרים ניתוח של אוכלוסיות מח עצם GFP שאינן לוקמיות באמצעות ציטומטריית זרימה. בקצרה, נקבות עכברי C57BL/6J בנות 10 שבועות מושתלות עם תאי AML מורין GFP/YFP+, ומח העצם נקצר שבועיים לאחר ההשתלה. בעוד נקבות עכברים משמשות במחקר זה למטרות הדגמה, פרוטוקול זה יכול להתבצע עם עכברים זכרים או נקבות. זה יכול להתבצע גם באמצעות עצם הירך אחת או כל העצמות הארוכות.
1. קצירת מח עצם
הערה: לפרטים על פרוטוקול נתיחת בעלי חיים, עיין בתיקון ואח' 26.
- נקו את הטיט והמזיק באתנול 70%, שטפו אותם עם חיץ FACS צונן (טבלה 1), והניחו אותם על קרח לקירור לפני תחילת הקציר. כמו כן, מקם חיץ MACs (טבלה 1) על הספסל כדי לאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר.
- יש להרדים את בעל החיים בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
- על הספסל, ריססו היטב את העכבר באתנול 70% עד שפרוותו רטובה. בעזרת מלקחיים ומספריים מעוקלים, מרימים את העור על הבטן ומבצעים שני חתכים באורך של כ-0.5 מ"מ משני צידי העכבר, לרוחב מהבטן. לאחר מכן, לבצע חתך 0.5 מ"מ דיסטלי מן הבטן. משוך מטה כדי להסיר את העור והפרווה מרגלי העכבר.
- מניחים מספריים בניצב לאגן, לוחצים כלפי מטה תוך משיכה למעלה על עצם הירך עם מלקחיים. ראש עצם הירך צריך להתנתק מהאגן. להפריד את עצם הירך ואת השוקה במפרק patellofemoral. מניחים את העצמות בחיץ FACS בצלחת של 6 בארות על קרח.
- הסר רקמות מהעצמות באמצעות רקמה ברמת מעבדה והנח את העצמות המנוקות בצלחת חדשה בת 6 בארות עם חיץ FACS טרי על קרח.
- הכניסו את כל העצמות למכתש עם 2-5 מ"ל של חיץ FACS כך שכל העצמות יהיו שקועות במאגר (התאימו את נפח החיץ בהתאם למספר העצמות שאתם מעבדים). מרסקים וטוחנים את העצמות באמצעות המזיק בתנועה סיבובית עד שרקמת מח העצם משתחררת.
- באמצעות מזרק 3 מ"ל, הומוגניזציה של מח העצם על ידי משיכה למעלה ושטיפה למטה את הנוזל מן המליטה.
- באמצעות מזרק 3 מ"ל, למשוך את הנוזל מן המליטה ולסנן אותו דרך מסננת תאים 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל על קרח. שטפו את גושי העצם/רקמה מהמסנן בחזרה למכתש עם חיץ FACS וחזרו לשלב 1.7 כדי ליצור הומוגניות ולסנן פעם נוספת. זה מהווה את חלק מח העצם.
- שטפו את חתיכות העצם הנותרות (קוצים) בחזרה למכתש עם חיץ FACS ושטפו אותן לתוך צינור של 15 מ"ל באמצעות מאגר FACS כדי להבטיח תפוקת תאים מרבית. זהו שבר קוצי העצם.
2. עיכול מח עצם
- צנטריפוגה את מח העצם ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. דקאנט והשליך את הסופר-נטנט.
- השהה מחדש את מח העצם ב-2 מ"ל של תערובת עיכול מח העצם (טבלה 1) והעבר אותו לצינור של 15 מ"ל. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 45 דקות על מסובב.
- הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS כדי לעצור את העיכול האנזימטי. סנן את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל.
- מזלפים את התערובת ב 400 x גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- השהה מחדש את גלולת מח העצם ב 1 מ"ל של חיץ ליזה RBC (ראה טבלת חומרים). דוגרים במשך 4 דקות על קרח.
- הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS כדי לעצור את הליזיס. סנן את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל.
- מזלפים את התערובת ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 100 μL של חיץ FACS.
3. עיכול של קוצים עצם
- מערבלים את קוצי העצם משלב 1.9 ומאפשרים להם להתיישב. דקרו את הסופרנאטנט ושמרו על העצם בתחתית.
- השהה מחדש את קוצי העצם ב-1 מ"ל של תערובת העיכול המתובלת של העצם (טבלה 1).
- הניחו את הצינורות על מסובב צינור למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37°C.
- הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS כדי לעצור את העיכול האנזימטי. סננו את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל המכיל מח עצם מעוכל ומעוכל RBC.
4. צביעה
- מערבבים בעדינות את קוצי העצם ואת תרחיף תאי מח העצם.
- השתמש ב- 10 μL של תרחיף התא כדי לספור את מספר התא החי על המוציטומטר באמצעות צביעה על בסיס כחול טריפאן 0.4%, כמתואר בפרוטוקוליםשפורסמו 27. אסוף 50,000 תאים לבקרה לא מוכתמת מהשעיית התא.
- צנטריפוגה את התאים הנותרים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend אותם ב 100 μL של מאגר FACS.
הערה: נוגדנים יכולים להיות titrated כדי לקבוע את דילול אידיאלי. בחירת נוגדנים (אפיטופים ופלואורוכרומים) ניתנת להתאמה אישית. - לצביעה עם נוגדנים לדלדול מגנטי, הוסף בלוק FC (1 μL לכל 25 x 106 תאים), CD45-APC (10 μL לכל 25 x 106 תאים) ו- Ter119-APC (4 μL לכל 25 x 106 תאים) (ראה טבלת חומרים).
- דוגרים על קרח במשך 20 דקות. יש לשטוף עם מאגר FACS, להסיר 50,000 תאים (~ 50 μL) עבור הבקרה המוכתמת APC, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, והשהיה מחדש ב 100 μL של מאגר FACS.
- לצביעת תרחיף התא במיקרו-כדוריות לדלדול מגנטי, הוסף mIgG (8 μL לכל 25 x 106 תאים) ומיקרו-כדוריות נגד APC (20 μL לכל 25 x 106 תאים) (ראה טבלת חומרים).
- דוגרים על קרח במשך 20 דקות. יש לשטוף עם מאגר FACS של 10 מ"ל, צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
5. דלדול הדגימה על ידי מיון מגנטי
הערה: שלב זה מתבצע באמצעות מפריד מגנטי ידני הזמין מסחרית בהתאם להוראות היצרן. ניתן לבצע שלב זה גם באמצעות מפריד אוטומטי (ראה טבלת חומרים).
- הכן את עמודת LD על-ידי שטיפתה עם 2 מ"ל של מאגר MACs (טבלה 1). יש להשליך את הקולחים ולהחליף את צינור האיסוף.
- השהה מחדש עד 1 x 108 תאים במאגר MACs וסנן אותם דרך מבחנה של 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר.
- הניחו את עמוד ה-LD על מעמד המפריד המגנטי. מקם מבחנה של 5 מ"ל מתחת לעמודה כדי לאסוף את הפולט.
- הוסף את מתלה התא לעמודת LD המוכנה. אפשר לחלק השלילי לזרום דרך צינור האיסוף. לשטוף את העמודה פעמיים עם 1 מ"ל של מאגר MACs, איסוף eluate באותו צינור. זהו החלק השלילי המשמש בשלב 5.6 להלן.
- הסר את עמוד LD מהמעמד המפריד המגנטי והנח אותו על מבחנה חדשה של 5 מ"ל. השתמש פיפטה כדי לחלק 3 מ"ל של מאגר לתוך העמודה כדי לשטוף החוצה תאים שסומנו באופן חיובי, באמצעות בוכנה עמודה.
- צנטריפוגה את השברים השליליים והחיוביים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השהה אותם מחדש ב- 100 μL של מאגר FACS.
- ספירת 10 μL של השברים השליליים והחיוביים עם 0.4% כחול טריפאן. הנפחים עבור ניתוח אוסטאו-אנליזה/צביעת פאנל אנדותל להלן יתבססו על ספירת תאים זו.
- השתמש ב- 50,000 תאים חיים מהחלק החיובי עבור בקרות gating ציטומטריית זרימה.
6. ניתוח אוסטאו/כתם בלוח האנדותל
הערה: יש לבצע את הפיצוי בהתאם לפרוטוקולי ציטומטריית זרימה סטנדרטיים, כולל כל בקרות הצביעה והגטינג המתאימות.
- עבור צביעה של החלק השלילי CD45 / Ter119 (1 μL של כל נוגדן לכל 1 x 106 תאים), להוסיף CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE ו- CD140a-PE-Cy5 (ראה טבלת חומרים).
- דוגרים על קרח במשך 20 דקות. יש לשטוף עם 2 מ"ל של מאגר FACS, ולאחר מכן לצנטריפוגה במהירות 300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
- הוסף 1 מ"ל של חיץ FACS ודילול 1:1000 של PI עבור צביעה חיה/מתה, ולאחר מכן סנן את הדגימה דרך מבחנה של 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר.
- נתח את התאים בציטומטר זרימה מרובה צבעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לניתוח אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם, כגון תאי אנדותל ותאי סטרומה מזנכימליים, ממודלים של MDS ולוקמיה מורין (איור 1). איור 2 מתאר את אסטרטגיית ה-gating לזיהוי אוכלוסיות מעניינות, החל מבחירת התאים (P1) במקטע המעוכל והמדולדל CD45/Ter119 דרך פרופיל פיזור קדימה וצדדית. תאים לדוגמה בדגימת לוקמיה מוצגים ב-P1 (איור 2A). סינגלים נבחרים וכפילים אינם נכללים בניתוח הזה, P2 (איור 2B). איור 2C מראה שערים לבחירת תאים חיים שליליים לפרופידיום יוד, P3. כדי להתמקד באוכלוסיות סטרומה שאינן המטופויטיות, תאים שהם CD45-/Ter119-, P4 (APC, ציר Y) לעומת SSC-A נבחרים (איור 2D). אסטרטגיית gating ראשונית זו משותפת לכל הדגימות שיש לנתח.
מודל לוקמיה מורין משמש להמחשת gating עבור תאי אנדותל באיורים 2E-G. איור 2E מתאר CD31 חיובי (Pe-Cy7, ציר Y) לעומת תאי SSC-A בעכבר ביקורת שאינו סרטני וכן בעכבר לוקמי, מגודרים באמצעות P4. תאים המסומנים באופן חיובי עם CD31 הם תאי אנדותל, P5. באיור 2F, מגודר דרך P5, תאי אנדותל עורקיים מזוהים כ-CD45-Ter119-CD31+Sca1+, P6, ותאי אנדותל סינוסואידים מזוהים כ-CD45-Ter119-CD31+Sca1-, P7 (BV421, ציר Y) לעומת SSC-A.
למרות שניתוח זה מתמקד בתאים מיקרו-סביבתיים שאינם לוקמיים של מח עצם, הוא מועיל גם לקבוע את נטל הגידול. ניתן לעשות זאת עם חלק קטן של דגימה לא מעוכלת/לא מדולדלת לפני תחילת הניסוי. בבקרה הניסויית הזו (קווים מקווקוים) איור 2G, P8 מייצג את עומס הגידול בדגימה ו-P9 מייצג את התאים הלא סרטניים.
מודל MDS murine משמש להמחשת ניתוח של תאי סטרומה מזנכימליים באיור 2H-J. איור 2H מתאר CD31 שלילי (Pe-Cy7, ציר Y) לעומת תאי SSC-A, מגודרים דרך P4. אוכלוסיות תאי סטרומה מזנכימליים בעכבר ביקורת מסוג פרא ובעכבר MDS מוצגות באיור 2I. מגודרים באמצעות P10, תאי סטרומה מזנכימליים מזוהים כ- CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+, P113 (Pe, ציר Y; Pe-Cy5, ציר X). הבקרה הניסויית (קווים מקווקוים), איור 2J מראה דוגמאות לבקרות gating בצבע יחיד, כתם יחיד CD51 וכתם יחיד CD140a המשמש לשער עבור MSCs המוצגים בדגימות הניסוי באיור 2I.
נתונים אלה מצביעים על כך שתאי אנדותל עורקיים מתרחבים באופן משמעותי במיקרו-סביבה של AML, עם אובדן מקביל באוכלוסיות האנדותל הסינוסואידים (איור 2F), בהתאם למחקרים קודמים שהשתמשו בקסנוגרפטים שמקורם במטופלים בעכברים מדוכאי חיסון28. סביר להניח שההתרחבות הקטנה בתאי סטרומה מזנכימליים שנצפתה בעכברי NHD13 בגיל 8 שבועות (איור 2I) עשויה לגדול בגיל 16-20 שבועות, כאשר העכברים האלה מתחילים להציג מאפיינים של MDS25. למרות שרק מודל הלוקמיה משמש להמחשת אוכלוסיית תאי האנדותל, ומודל MDS murine משמש להמחשת אוכלוסיות תאי הסטרומה המזנכימליים, ניתן להשתמש באסטרטגיות צביעה וגטינג דומות כדי לנתח את האוכלוסיות המיקרו-סביבתיות השונות בכל אחד מהמודלים הללו, או למעשה, בכל מודל מורין מהונדס גנטית מעניין.
איור 1: בידוד של תאי סטרומה ממח עצם. סכמטי מראה את התהליך של בידוד תאי סטרומה מח עצם שאינם hematopoietic מעכברי בקרה ו leukemic. בקצרה, קוצים עצם מח עצם מתעכלים בנפרד ולאחר מכן אגרום. אוכלוסיית CD45-Ter119 מועשרת על ידי מיון מגנטי, ומוכתמת בלוחות נוגדנים כנגד אוכלוסיות מעניינות, כגון תאי סטרומה מזנכימליים ותאי אנדותל. התאים מנותחים לאחר מכן על ידי ציטומטריית זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אסטרטגיית Gating עבור מח עצם לא המטופויטי ותאי סטרומה. (A-D) אסטרטגיית גטינג ציטומטריה של זרימה המשמשת לבחירת אוכלוסיות מעוכלות, CD45-/Ter119-, לא המטופויטיות (P4) הן במודל לוקמיה והן במודל MDS murine. (E) תאי אנדותל של מח עצם לוקמיה (P5, CD31+) ניתנים לחלוקה כ-(F) Sca1+ arteriolar (P6) או Sca1- תאי אנדותל סינוסואידים (P7). (G) קליטת לוקמיה בדגימת AML כאשר P8 מייצג קליטה ואילו P9 מייצג תאים שאינם סרטניים. קווים מקווקוים מצביעים על כך שחלקה זו היא בקרה ניסיונית. (H) מגודר דרך P4, תאי מח עצם MDS CD31, P10 (I) תאי סטרומה מזנכימליים (CD51+/CD140a+, P11). (J) פקדי gating בצבע יחיד לדוגמה, CD51 (משמאל) ו- CD140a (מימין) המשמשים לקביעת השערים של תאי סטרומה מזנכימליים ב- (I). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| תמיסה | מגיב | ריכוז | סכום להוספה |
| מאגר FACS | HBSS | פי 10 | 100 מ"ל |
| EDTA | 0.5 מטר | 4 מ"ל | |
| סרום בקר עוברי | - | 50 מ"ל | |
| מים | - | 848 מ"ל | |
| תערובת לעיכול מח עצם | HBSS | 1x | 2 מ"ל |
| DNase 1 | 1 מיקרוגרם/מ"ל ב-DPBS אחד | 20 מיקרוליטר | |
| אבקת Dispase II | - | 4 מ"ג | |
| קולגנאז סוג IV | - | 2 מ"ג | |
| תערובת עיכול חריף עצם | DPBS | 1x | 320 מ"ל |
| קולגנאז סוג 1 | - | 1 גרם | |
| סרום בקר עוברי | - | 80 מ"ל | |
| מאגר MACs | BSA | 66 גרם/מול | 5 גרם |
| DPBS | פי 10 | 100 מ"ל | |
| EDTA | 0.5 מטר | 4 מ"ל | |
| מים | - | 896 ליטר |
טבלה 1: הרכב התמיסות והמאגרים ששימשו במחקר הנוכחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים של לוקמיה מורנית שימשו באופן נרחב לזיהוי אותות פנימיים ונישתיים של תאים המקדמים התקדמות לוקמיה מיאלואידית אגרסיבית 6,19,21. כאן מוצג פרוטוקול מקיף מבוסס ציטומטריית זרימה להגדרת ההרכב התאי של מיקרו-סביבה של מח העצם במודלים של MDS ו-AML.
לפני קבלת נתונים ציטומטריים של זרימה מדגימות ניסיוניות, חשוב לפצות בזהירות על חפיפה פלואורסצנטית. כמו כן, חיוני לכלול את כל בקרות הצביעה והצביעה המתאימות. צעדים אלה יאפשרו לנסיין לאשר כי צביעת נוגדנים חיובית או שלילית מייצגת ביטוי מדויק של סמני עניין בתאים ואינה תוצר של חפיפה ספקטרלית פלואורסצנטית או אוטופלואורסצנטיות. למרות שפרוטוקול זה מתאר סמנים נבחרים של פני התא, ניתן להרחיב את לוחות הנוגדנים בהתאם לצורך הניסויי. לדוגמה, CD144 (Ve-Cadherin) יכול להינתן in vivo לפני קצירת העכברים והוא יכול לשמש סמן ספציפי נוסף של תאי אנדותל 5,29. בעוד פלואורופורים ושיבוטים נוגדנים המצוינים כאן ניתן לשנות, טיטרציות צריך להתבצע כדי לקבוע דילול אידיאלי שלהם. כדי להגדיר באופן קטגורי את כל אוכלוסיות התאים בנישת מח העצם, ניתן להשתמש בריצוף RNA של תא בודד כדי לבסס את נוף נישת מח העצם במהלך אתחול והתקדמות MDS/AML 23,24,30.
חשוב להכין את הדגימה בקפידה בהתאם לשלבים המתוארים בפרוטוקול זה. בעת הומוגניזציה של העצמות, חיוני כי טיט ו pestle הם צוננים, וכל השלבים מתבצעים על קרח כדי למנוע מוות תאים כדי להבטיח התאוששות תאים גבוהה. חשוב מאוד להסיר את כל הרקמה סביב העצמות לפני הומוגניזציה כדי למנוע זיהום של סוגי תאים לא רצויים אחרים. במהלך הליזה והעיכול של RBC, חשוב לעצור את התגובה האנזימטית עם כמות מתאימה של FACS Buffer ולהשהות מחדש ביסודיות בחיץ טרי, אחרת התאים ימשיכו לעכל ובסופו של דבר ימותו.
הפרדת שברי מח העצם ומח העצם חיונית מכיוון שקוצי העצם דורשים תערובת שונה של אנזימים לחיץ העיכול וזקוקים לזמן ארוך יותר לעיכול. בעיכול עצמות, collagenase type 1 שימושי לעיכול סיבי collagenase אשר נמצאים בדרך כלל במטריצה חוץ-תאית וסיבי קולגן31. בנוסף, חלק מתאי מח העצם הממוקמים קרוב לאנדוסטאום יישארו מחוברים לעצם לאחר הומוגניזציה וישוחררו רק על ידי עיכול אנזימטי. בעת עיכול מח עצם, collagenase סוג IV משמש לעיכול קרום המרתף של תאי אפיתל ואנדותל בתוך מח העצם32, בעוד dispase בעיקר חותך פיברונקטין31. מח העצם דורש פחות זמן לעיכול מכיוון שהקשרים בין התאים למטריצה חלשים יותר. דגירה על מקטע מח העצם בתנאים דומים עלולה לפגוע באוכלוסיות המעניינות. שימוש בשני מאגרי עיכול שונים מגדיל באופן משמעותי את מספר אוכלוסיות הסטומליות שניתן לזהות, ובכך מספק מערך נתונים גדול יותר לניתוח.
רוב הפרוטוקולים הזמינים לניתוח אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם מורין משתמשים במזרק כדי לשטוף את מח העצם רק מהעצמות הארוכות 13,24. השיטה הנוכחית לריסוק עצמות מספקת את היכולת לקבל נתונים מעצמות אחרות כגון האגן, מקצרת משמעותית את זמן הכנת הדגימה, ומקלה על האפשרות לפציעות באמצעות מחטים חדות. בהתחשב בכך שהעצם מורכבת מאוסטאובלסטים בוגרים ומאוכלוסיות תאים אחרות שיכולות לספק תמיכה לתאים המטופויטיים נורמליים וממאירים, שיטה זו של הכללת תאים מקוצני העצם מאפשרת ייצוג מדויק יותר של מיקרו-סביבה של מח העצם בדגימה. בעוד שמחקר קודם אחד עיכל מח עצם וקוצים עצם בנפרד11, הוא לא הדגים צביעה של אוסטאו-שושלת ותאי אנדותל באותה דגימה. מחקר שני השתמש בתערובות אנזימים קנייניות זמינות מסחרית כדי לעכל מח עצם וקוציםעצם 23, וניתח את הנתונים באמצעות טכנולוגיית ריצוף RNA של תא בודד היקרה משמעותית. שיטה זו של העשרה עבור CD45-/Ter119- תאים בוחרת תאים מעניינים, ומקצרת באופן משמעותי את הזמן הדרוש כדי לקבל נתונים על ציטומטר הזרימה. לפיכך, בהשוואה לשיטות מתקדמות אחרות כגון ריצוף RNA חד-תאי, שיטה זו המבוססת על ציטומטריית זרימה נגישה יותר, חסכונית יותר ואינה דורשת ניתוח מתוחכם על ידי ביואינפורמטיקאים מיומנים 23,24,30.
חשוב לציין כי פרוטוקול זה יכול לשמש לאפיון מיקרו-סביבה של מח עצם לא רק של כל אחד מהמודלים הזמינים של MDS ו- AML אלא כל מודל עכבר גנטי. שיטות דומות יכולות להיות יעילות גם בניתוח השינויים בנישת מח העצם של המטופל במודלים של קסנוגרפט (PDX). שיטות אלה יכולות להיות שימושיות עבור מחקרים שמטרתם לקבוע את המנגנונים שבאמצעותם MDS / AML משפיעים על נישת מח העצם שלהם. בהתחשב באתגרים הטכניים הקשורים לדגימת כמויות גדולות של מח עצם מחולים אנושיים, ניתוחים אלה של מודלים מורינים הם כלי יעיל כדי לקדם את ההבנה של מיקרו-סביבה ממאירה של מח עצם ולהגדיר את תפקידה בהתקדמות המחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ל-URMC Flow Cytometry Core. עבודה זו נתמכה על ידי פרס האגודה האמריקאית להמטולוגיה, פרס הקרן לחקר לוקמיה ומענקים של NIH R01DK133131 ו-R01CA266617 שהוענקו לג'יי.בי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
- Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
- Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
- Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
- Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
- Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
- Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
- Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
- Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W.
- Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
- Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
- Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
- Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
- Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
- Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).
