Summary
ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境集団を分離および特徴付けるための詳細なプロトコルが提示されます。この技術は、疾患の進行に伴う内皮細胞や間葉系間質細胞を含む非造血骨髄ニッチの変化を特定します。
Abstract
骨髄微小環境は、間葉系間質細胞、内皮細胞、骨系細胞、線維芽細胞などの異なる細胞集団で構成されており、造血幹細胞(HSC)を支えています。骨髄微小環境は、正常な造血幹細胞をサポートするだけでなく、骨髄異形成症候群(MDS)や急性骨髄性白血病(AML)などの造血幹細胞障害の発症にも関与しています。造血幹細胞におけるMDS関連変異は、特に高齢者において、分化不全および進行性骨髄不全を引き起こす。MDSは、未熟な骨髄芽球の急速な蓄積を特徴とする疾患である治療抵抗性AMLに進行することがよくあります。骨髄微小環境は、これらの骨髄性腫瘍の患者で変化することが知られています。ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境細胞を単離し、表現型的に特徴付けるための包括的なプロトコルが説明されています。骨髄ニッチ集団における変化を単離し、特徴づけることは、疾患の開始と進行におけるそれらの役割を決定するのに役立ち、骨髄間質集団における癌を促進する変化を標的とする新しい治療法の開発につながる可能性があります。
Introduction
骨髄微小環境は、造血細胞、非造血間質細胞、および細胞外マトリックスからなる1,2。この微小環境は、造血幹細胞の自己複製を促進し、系統分化を調節し、骨組織に構造的および機械的支持を提供することができる1,2,3,4,5。間質ニッチには、骨系細胞、線維芽細胞、神経細胞、および内皮細胞6が含まれ、造血ニッチは、リンパ系および骨髄系集団1,2,3からなる。骨髄微小環境は、正常な造血幹細胞をサポートするだけでなく、MDSやAML 7,8,9,10,11などの造血幹細胞疾患の発症にも役割を果たす可能性があります。骨系細胞の変異は、MDS、AML、およびその他の骨髄増殖性腫瘍の発症を促進することが示されています10,12,13,14。
骨髄異形成症候群は、造血幹細胞の突然変異から生じる前白血病疾患のグループです。MDSは、造血幹細胞の分化や異形成細胞の産生のブロックと関連していることが多く、骨髄不全につながることがよくあります。MDSは、米国で最も一般的に診断される骨髄性腫瘍であり、35%〜45%の3年生存率と関連しています15。MDSは、急性骨髄性白血病への形質転換のリスクが高いことと関連していることが多い。MDS由来のAMLはほとんどの治療法に耐性があり、再発する可能性が高いため、これは致命的な合併症になる可能性があります。造血幹および前駆細胞の転座または変異によりde novoで発生するAMLも、標準的な化学療法に耐性を示すことが多い16,17。MDSとAMLは主に高齢者の疾患であり、大多数が60歳以上と診断されているため、ほとんどの患者は根治的骨髄移植に不適格です。したがって、疾患進行の新たな調節因子を同定する必要性は極めて大きい。骨髄微小環境は悪性細胞14を支持することができるので、疾患の進行に伴う骨髄ニッチの変化を定義することは、腫瘍ニッチのリモデリングを阻害することを目的とした新規治療薬の同定につながり得る。したがって、疾患進行の新たな調節因子を同定する必要性は極めて高い。この目的のためには、悪性細胞を支持する可能性のある骨髄間質細胞集団の変化を特定し、特徴付けることが重要です。
AMLおよびMDSのいくつかのマウスモデルが生成されており、疾患の開始および進行中の骨髄微小環境の変化を研究するために使用できます6,1,19,20,21,22。ここでは、レトロウイルス誘発性AML 6,20のマウスモデル、ならびに高リスクMDSからAMLへの形質転換19の市販のNup98-HoxD13(NHD13)モデルを用いて、骨髄間質細胞集団の変化を同定するプロトコルが記載されている。de novoAML細胞を移植したマウスは、20〜30日でこの病気に屈します6。NHD13マウスは、15〜20週頃に血球減少症と骨髄異形成を発症し、最終的にAMLに変化し、マウスの約75%が32週頃にこの病気に屈します。マウスモデルの骨髄微小環境集団を解析するために、骨を採取し、骨髄と骨棘を酵素消化を用いて消化し、次に磁気選別によって細胞をCD45-/Ter119-非造血集団のために濃縮します。同様の分析は以前にも報告されていますが11,13,22,23,24,25、それらはしばしば骨髄または骨のいずれかに焦点を当てており、両方のソースからの細胞を分析に組み込んでいません。これらの集団の特性評価と遺伝子発現解析を組み合わせることで、細胞造血微小環境が疾患の開始と進行をどのようにサポートするかを包括的に理解することができます(図1)。以下に説明するプロトコルは、レトロウイルス誘発性AMLモデルと遺伝的MDSモデルに焦点を当てていますが、これらの戦略は、関心のあるマウスモデルの骨髄ニッチの変化を研究するために簡単に適応させることができます。
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Protocol
すべての動物実験は、ロチェスター大学動物資源委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。マウスはロチェスター大学の動物飼育施設で飼育され、飼育されました。高リスクMDSをモデル化するために、市販のNHD13マウスモデル19が採用されています。このモデルでは、発症前の8週齢の雌のNHD13マウスで骨髄間質細胞を解析します。De novo(デ・ノボ)AMLは、前述のように生成されます6,11,20。MLL-AF9やNRasなどのAMLを誘発するがん遺伝子にはGFPまたはYFPのタグが付けられており、フローサイトメトリーを用いた非白血病GFP-骨髄集団の解析が可能です。簡単に説明すると、10週齢の雌のC57BL/6JマウスにマウスGFP/YFP+ AML細胞を移植し、移植後2週間で骨髄を採取します。この研究ではデモンストレーション目的で雌マウスを使用していますが、このプロトコルは雄または雌のマウスで実施できます。また、1つの大腿骨またはすべての長骨を使用して行うこともできます。
1. 骨髄採取
注:動物の解剖プロトコルの詳細については、Amend et al.26を参照してください。
- 乳鉢と乳棒を70%エタノールで洗浄し、冷やしたFACS緩衝液(表1)ですすぎ、収穫を開始する前に氷の上に置いて冷まします。また、MACsバッファー(表1)をベンチに置き、室温に達するようにします。
- 施設の動物ケアと使用のガイドラインとプロトコルに従って動物を安楽死させます。
- ベンチトップで、マウスの毛皮が濡れるまで70%エタノールを徹底的にスプレーします。鉗子と湾曲したハサミを使用して、腹部の皮膚を持ち上げ、マウスの腹部から外側に長さ約0.5mmの長さの2つの切開を行います。次に、腹部から遠位に0.5mmの切開を行います。引き下げて、マウスの足から皮膚と毛皮を取り除きます。
- はさみを骨盤に対して垂直に置き、鉗子で大腿骨を引き上げながら押し下げます。大腿骨頭は骨盤から切り離す必要があります。膝蓋大腿関節で大腿骨と脛骨を分離します。骨を氷上の6ウェルプレートのFACSバッファーに入れます。
- ラボグレードの組織を使用して骨から組織を除去し、洗浄した骨を氷上の新鮮なFACSバッファーを含む新しい6ウェルプレートに入れます。
- すべての骨がバッファーに浸されるように、すべての骨を2〜5 mLのFACSバッファーを含む乳鉢に入れます(処理する骨の数に基づいてバッファーの量を調整します)。骨髄組織が放出されるまで、乳棒を使用して円を描くように骨を押しつぶして粉砕します。
- 3 mLのシリンジを使用して、乳鉢から液体を引き上げたり洗い流したりして、骨髄を均質化します。
- 3 mLのシリンジを使用して、モルタルから液体を引き上げ、70 μmのセルストレーナーで濾過し、氷上で50 mLのチューブに入れます。骨/組織の塊をフィルターからFACSバッファーでモルタルに戻し、ステップ1.7に戻って均質化して2回目の濾しを行います。これが骨髄画分を構成する。
- 残りの骨片(スピキュール)をFACS緩衝液で乳鉢に洗い流し、FACS緩衝液を使用して15 mLチューブに洗い流し、細胞収量を最大にします。これが骨棘画分です。
2.骨髄の消化
- 骨髄を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄みをデカントして廃棄します。
- 骨髄を2 mLの骨髄消化混合物(表1)に再懸濁し、15 mLチューブに移します。ローテーター上で37°Cで45分間インキュベートします。
- 10 mLのFACSバッファーを添加して、酵素消化を停止します。混合物を70 μmのセルストレーナーで濾過し、新しい50 mLチューブに入れます。
- 混合物を400 x g で4°Cで7分間ペレット化します。
- 骨髄ペレットを1 mLのRBC溶解バッファーに再懸濁します( 材料表を参照)。氷上で4分間インキュベートします。
- 10 mLのFACSバッファーを添加して溶解を停止します。混合物を70 μmのセルストレーナーで濾過し、新しい50 mLチューブに入れます。
- 混合物を300 x g で4°Cで5分間ペレット化します。 上清を除去し、ペレットを100 μLのFACS緩衝液に再懸濁します。
3.骨棘の消化
- ステップ1.9の骨の棘をボルテックスし、落ち着かせます。上澄み液をデカントし、骨を底に保持します。
- 骨棘を1 mLの骨棘消化混合物に再懸濁します(表1)。
- チューブをチューブローテーターの上に置き、37°Cで60分間加熱します。
- 10 mLのFACSバッファーを添加して、酵素消化を停止します。混合物を70 μmの細胞ストレーナーでろ過し、赤血球で溶解および消化した骨髄を含む50 mLチューブに入れます。
4. 染色
- 骨棘と骨髄細胞懸濁液を静かに混ぜます。
- 10 μL の細胞懸濁液を使用して、0.4% トリパンブルーベースの染色を用いて血球計算盤で生細胞数をカウントします(公開プロトコル27 に記載されています)。細胞懸濁液から50,000個の細胞を採取し、未染色コントロールを行います。
- 残りの細胞を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を除去し、100 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
注:抗体を滴定して、理想的な希釈率を決定することができます。抗体の選択(エピトープおよび蛍光色素)はカスタマイズできます。 - 磁気枯渇抗体による染色には、FCブロック(25 x 106 細胞あたり1 μL)、CD45-APC(25 x 106 細胞あたり10 μL)、およびTer119-APC(25 x 106 細胞あたり4 μL)を追加します( 材料表を参照)。
- 氷上で20分間インキュベートします。FACS緩衝液で洗浄し、50,000個の細胞(~50 μL)を除去してAPC染色コントロールとし、300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、100 μLのFACS緩衝液に再懸濁します。
- 細胞懸濁液をマイクロビーズで染色して磁気を枯渇させるには、mIgG(25 x 106 細胞あたり8 μL)および抗APCマイクロビーズ(25 x 106 細胞あたり20 μL)を添加します( 材料表を参照)。
- 氷上で20分間インキュベートします。10 mL FACSバッファーで洗浄し、300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
5. 磁気選別による試料の枯渇
注意: この手順は、製造元の指示に従って、市販の手動磁気分離器を使用して実行されます。このステップは、自動セパレーターを使用して実行することもできます( 材料表を参照)。
- LD カラムを 2 mL の MAC バッファーで洗浄して調製します(表 1)。廃液を廃棄し、収集チューブを交換します。
- 最大 1 x 108 細胞を MAC 緩衝液に再懸濁し、35 μm セルストレーナーキャップ付きの 5 mL 試験管でろ過します。
- LDカラムを磁気セパレータースタンドに置きます。5 mL の試験管をカラムの下に置き、溶出液を回収します。
- 調製したLDカラムに細胞懸濁液を添加します。負の画分をコレクションチューブに流します。カラムを 1 mL の MACs バッファーで 2 回洗浄し、溶出液を同じチューブに回収します。これは、以下の手順5.6で使用される負の分数です。
- LDカラムを磁気分離器スタンドから取り外し、新しい5 mL試験管に置きます。ピペットを使用してカラムに 3 mL のバッファーを分注し、カラムプランジャーを使用してポジティブ標識された細胞を洗い流します。
- ネガティブフラクションとポジティブ画分を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 それらを100 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
- 10 μL の陰性画分と陽性画分を 0.4% トリパンブルーでカウントします。以下の骨分析/内皮パネル染色の量は、この細胞数に基づいています。
- 陽性画分から50,000個の生細胞をフローサイトメトリーゲーティングコントロールに使用します。
6.骨分析/内皮パネル染色
注:補正は、すべての適切な染色およびゲーティングコントロールを含む、標準的なフローサイトメトリープロトコルに従って実行する必要があります。
- CD45/Ter119陰性画分(1 x 106 細胞あたり各抗体1 μL)の染色には、CD31-PE-Cy7、Sca-1-BV421、CD51-PE、およびCD140a-PE-Cy5を添加します( 材料表を参照)。
- 氷上で20分間インキュベートします。2 mLのFACSバッファーで洗浄し、300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 生染色用に 1 mL の FACS バッファーと 1:1000 に希釈した PI を加え、35 μm セルストレーナーキャップ付きの 5 mL 試験管でサンプルをろ過します。
- マルチカラーフローサイトメーターで細胞を解析します。
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Representative Results
本稿では、MDSおよび白血病マウスモデルから、内皮細胞や間葉系間質細胞などの骨髄微小環境集団を解析するためのフローサイトメトリーベースの手法について説明します(図1)。 図2 は、前方散乱および側方散乱プロファイルによる消化およびCD45/Ter119枯渇画分の細胞(P1)の選択から始まる、目的の集団を検出するためのゲーティング戦略を示しています。白血病サンプル中の細胞のゲーティングの例をP1に示します(図2A)。シングレットが選択され、ダブレットはこの分析から除外されます(P2)(図2B)。 図2C は、プロピジウムヨウ素陰性の生細胞P3を選択するためのゲートを示しています。非造血間質集団に着目するため、CD45-/Ter119-、P4(APC、Y軸) 対SSC-Aが選択されています(図2D)。この初期ゲーティング戦略は、分析するすべてのサンプルに共通です。
白血病マウスモデルは、 図2E〜Gの内皮細胞のゲーティングを説明するために使用されています。 図2E は、CD31陽性(Pe-Cy7、Y軸) と非癌対照マウスおよび白血病マウスのSSC-A細胞をP4を介してゲーティングしました。CD31で陽性標識された細胞は、内皮細胞P5です。 図2Fでは、P5を介してゲートされ、細動脈内皮細胞はCD45-Ter119-CD31+Sca1+、P6として識別され、正弦波内皮細胞はCD45-Ter119-CD31+Sca1-、P7(BV421、Y軸) として識別されます。SSC-Aです。
この解析は非白血病の骨髄微小環境細胞に焦点を当てていますが、腫瘍量を決定するのにも役立ちます。これは、実験を開始する前に、未消化/枯渇していないサンプルのごく一部で行うことができます。この実験対照(破線)図 2Gでは、P8はサンプル中の腫瘍量を表し、P9は非癌性細胞を表します。
MDSマウスモデルは、図2H-Jの間葉系間質細胞の解析を説明するために使用されています。図2Hは、CD31陰性(Pe-Cy7、Y軸)とP4を介してゲーティングされたSSC-A細胞。野生型コントロールマウスおよびMDSマウスにおける間葉系間質細胞集団を図2Iに示します。P10を介してゲートされた間葉系間質細胞は、CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+、P113(Pe、Y軸;Pe-Cy5、X軸)。実験対照(破線)は、図2Jに単色ゲーティングコントロールの例を示しており、図2Iの実験サンプルに示したMSCのゲートに使用したCD51単染色およびCD140a単染色。
このデータは、細動脈内皮細胞がAML微小環境で有意に拡大し、それに伴い洞型内皮集団が喪失することを示しており(図2F)、免疫不全マウスにおける患者由来の異種移植片を用いた以前の研究と一致している28。NHD13マウスの8週齢(図2I)に見られる間葉系間質細胞の小さな拡大は、これらのマウスがMDS25の特徴を示し始める16〜20週で増加する可能性があります。内皮細胞集団を説明するために白血病モデルのみが使用され、間葉系間質細胞集団を説明するためにMDSマウスモデルが使用されますが、同様の染色およびゲーティング戦略を使用して、これらのモデルのいずれかで、または実際に、関心のある遺伝子操作マウスモデルで異なる微小環境集団を分析できます。
図1:骨髄間質細胞の単離。 模式図は、非造血骨骨髄間質細胞を対照マウスおよび白血病マウスから単離する過程を示す。簡単に言えば、骨棘と骨髄は別々に消化され、次にプールされます。CD45-Ter119-集団は磁気選別によって濃縮され、間葉系間質細胞や内皮細胞などの目的の集団に対する抗体パネルで染色されます。その後、細胞をフローサイトメトリーで分析します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:非造血骨髄細胞および間質細胞のゲーティング戦略。 (A-D)白血病とMDSマウスモデルの両方で消化されたCD45-/Ter119-非造血集団(P4)を選択するために使用されるフローサイトメトリーゲーティング戦略。(E)白血病の骨髄内皮細胞(P5、CD31+)は、(F)Sca1+細動脈(P6)またはSca1-洞状内皮細胞(P7)に細分化できます。(G)AMLサンプルにおける白血病の生着(P8は生着、P9は非がん細胞を表す)。点線は、このプロットが実験的コントロールであることを示します。(H)P4、MDS骨髄CD31-細胞、P10(I)間葉系間質細胞(CD51+/CD140a+、P11)を介してゲーティング。(J)単色ゲーティングコントロールの例、(I)の間葉系間質細胞のゲートを決定するために使用されたCD51(左)およびCD140a(右)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 解決 | 試薬 | 濃度 | 追加する金額 |
| FACSバッファ | HBSSの | 10倍速 | 100 mLの |
| EDTAの | 0.5メートル | 4 mLの | |
| ウシ胎児血清 | - | 50 mLの | |
| 水 | - | 848 mLの | |
| 骨髄消化混合液 | HBSSの | 1倍速 | 2 mLの |
| DNase 1 (英語) | 1x DPBS 中 1 μg/mL | 20 μL | |
| ディスパーゼIIパウダー | - | 4ミリグラム | |
| IV型コラゲナーゼ | - | 2ミリグラム | |
| 骨棘消化混合物 | DPBSの | 1倍速 | 320 mLの |
| コラゲナーゼ1型 | - | 1グラム | |
| ウシ胎児血清 | - | 80 mLの | |
| MAC バッファ | BSAの | 66 g/mol | 5グラム |
| DPBSの | 10倍速 | 100 mLの | |
| EDTAの | 0.5メートル | 4 mLの | |
| 水 | - | 896のL |
表1:本研究で使用した溶液と緩衝液の組成。
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Discussion
マウス白血病モデルは、侵攻性骨髄性白血病の進行を促進する細胞内因性およびニッチ主導のシグナルを特定するために広く使用されています6,19,21。ここでは、MDSおよびAMLのマウスモデルにおける骨髄微小環境の細胞組成を定義するための包括的なフローサイトメトリーベースのプロトコルが提示されます。
実験サンプルからフローサイトメトリーデータを取得する前に、蛍光のオーバーラップを慎重に補正することが重要です。また、適切な染色およびゲーティングコントロールをすべて含めることも不可欠です。これらのステップにより、実験者は、陽性または陰性の抗体染色が目的の細胞マーカーの正確な発現を表し、蛍光スペクトルの重複または自家蛍光のアーチファクトではないことを確認できます。このプロトコルは指定セル表面のマーカーを記述するが、抗体のパネルは実験必要性に基づいて拡張することができる。例えば、CD144(Ve-Cadherin)は、マウスを採取する前にin vivoで投与することができ、内皮細胞の追加の特異的マーカーとして役立つことができる5,29。ここに示した蛍光色素および抗体クローンは変更可能ですが、滴定を実施して理想的な希釈率を決定する必要があります。骨髄ニッチのすべての細胞集団を断定的に定義するために、単一細胞RNAシーケンシングを使用して、MDS / AMLの開始および進行中に骨髄ニッチのランドスケープを確立することができます23,24,30。
このプロトコルに記載されている手順に従って、サンプルを慎重に調製することが重要です。骨を均質化する際には、乳鉢と乳棒を冷やし、細胞死を防ぎ、高い細胞回収率を確保するために、すべてのステップを氷上で行うことが重要です。他の望ましくない細胞タイプの汚染を防ぐために、ホモジナイズする前に骨を取り巻くすべての組織を除去することが非常に重要です。赤血球の溶解および消化中は、適切な量のFACSバッファーで酵素反応を停止し、新鮮なバッファーに完全に再懸濁することが重要です。
骨棘は消化バッファーに異なる酵素の混合物を必要とし、消化に長い時間を必要とするため、骨と骨髄画分を分離することが不可欠です。骨消化において、コラゲナーゼ1型は、細胞外マトリックスおよびコラーゲン線維に一般的に見られるコラゲナーゼ線維の消化に有用である31。さらに、骨内膜の近くにある一部の骨髄細胞は、均質化後も骨に付着したままになり、酵素消化によってのみ放出されます。骨髄を消化する場合、IV型コラゲナーゼは骨髄内の上皮細胞および内皮細胞の基底膜を消化するために使用され32、ディスパーゼは主にフィブロネクチン31を切断する。骨髄は、細胞とマトリックスの間の結合が弱いため、消化に要する時間が短くなります。同様の条件で骨髄画分をインキュベートすると、目的の集団に損傷を与える可能性があります。2つの異なる消化バッファーを使用すると、検出できるストーマ集団の数が大幅に増加し、分析するデータセットが大きくなります。
マウスの骨髄微小環境集団を分析するために利用可能なほとんどのプロトコルは、シリンジを使用して長骨のみから骨髄を洗い流します13,24。現在の骨破砕法は、骨盤など他の骨からデータを取得できるため、サンプル調製時間を大幅に短縮し、鋭利な針による怪我の可能性を軽減します。骨は成熟した骨芽細胞と、正常および悪性の造血細胞を支持できる他の細胞集団で構成されていることを考えると、骨棘からの細胞を含めるこの方法は、サンプル中の骨髄微小環境をより正確に表現することを可能にします。以前の研究では、骨髄と骨棘を別々に消化しましたが11、同じサンプルの骨線細胞と内皮細胞の染色は示されませんでした。2番目の研究では、骨髄と骨棘を消化するために市販の独自の酵素混合物を使用し23、非常に高価なシングルセルRNAシーケンシング技術を使用してデータを分析しました。CD45-/Ter119-細胞を濃縮するこの方法は、目的の細胞を選択し、フローサイトメーターでデータを取得するのに必要な時間を大幅に短縮します。したがって、シングルセルRNAシーケンシングなどの他の最先端の方法と比較して、このフローサイトメトリーベースの方法は、よりアクセスしやすく、費用対効果が高く、訓練を受けたバイオインフォマティシャンによる高度な分析を必要としません23,24,30。
このプロトコルがMDSおよびAMLの利用できるマウス モデルの何れかの骨髄の微小環境を特徴付けるのにだけでなく、あらゆる遺伝マウス モデルに使用することができることに注意することは重要である。同様の方法は、患者由来異種移植片(PDX)モデルのマウス骨髄ニッチの変化を分析するのにも効果的です。これらの方法は、MDS/AMLが骨髄ニッチに影響を与えるメカニズムを決定することを目的とした研究に有用です。ヒト患者から大量の骨髄をサンプリングすることに関連する技術的な課題を考えると、マウスモデルのこれらの分析は、悪性骨髄微小環境の理解を深め、疾患の進行におけるその役割を定義するための効果的なツールです。
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Disclosures
利益相反の申告はありません。
Acknowledgments
URMCフローサイトメトリーコアに感謝します。この研究は、米国血液学会奨学生賞、白血病研究財団賞、およびJ.B.に授与されたNIH助成金R01DK133131およびR01CA266617の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
- Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
- Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
- Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
- Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
- Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
- Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
- Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
- Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W.
- Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
- Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
- Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
- Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
- Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
- Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).
