Summary
Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.
Abstract
O microambiente da medula óssea consiste em populações celulares distintas, como células estromais mesenquimais, células endoteliais, células osteolinhagens e fibroblastos, que fornecem suporte para células-tronco hematopoéticas (CTHs). Além de suportar as CTHs normais, o microambiente da medula óssea também desempenha um papel no desenvolvimento de doenças de células-tronco hematopoéticas, como síndromes mielodisplásicas (SMD) e leucemia mieloide aguda (LMA). Mutações associadas à SMD em HSCs levam a um bloqueio na diferenciação e falência progressiva da medula óssea, especialmente em idosos. A SMD pode frequentemente evoluir para LMA resistente à terapia, uma doença caracterizada por um rápido acúmulo de blastos mieloides imaturos. Sabe-se que o microambiente da medula óssea está alterado em pacientes com essas neoplasias mieloides. Aqui, um protocolo abrangente para isolar e caracterizar fenotipicamente células microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndrome mielodisplásica e leucemia mieloide aguda é descrito. Isolar e caracterizar as alterações nas populações de nicho da medula óssea pode ajudar a determinar seu papel na iniciação e progressão da doença e pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas direcionadas a alterações promotoras de câncer nas populações estromais da medula óssea.
Introduction
O microambiente da medula óssea é constituído por células hematopoéticas, células estromais não hematopoéticas e matrizextracelular1,2. Esse microambiente pode promover a auto-renovação das células-tronco hematopoéticas, regular a diferenciação de linhagens e fornecer suporte estrutural e mecânico ao tecido ósseo1,2,3,4,5. O nicho estromal inclui células de osteolinhagens, fibroblastos, células nervosas e células endoteliais6, enquanto o nicho hematopoiético é constituídopelas populações linfoide e mielóide1,2,3. Além de suportar CTHs normais, o microambiente da medula óssea também pode desempenhar um papel no desenvolvimento de desordens de células-tronco hematopoéticas, como SMD e LMA7,8,9,10,11. Demonstrou-se que mutações em células de osteolinhagens promovem o desenvolvimento de SMD, LMA e outras neoplasias mieloproliferativas 10,12,13,14.
As síndromes mielodisplásicas são um grupo de doenças pré-leucêmicas que surgem a partir de mutações em células-tronco hematopoéticas. A SMD está frequentemente associada a um bloqueio na diferenciação das CTH e à produção de células displásicas, o que muitas vezes pode levar à falência da medula óssea. A SMD é a neoplasia mieloide mais comumente diagnosticada nos Estados Unidos e está associada a uma taxa de sobrevida de 3 anos de 35%-45%15. A SMD está frequentemente associada a um alto risco de transformação para leucemia mieloide aguda. Isso pode ser uma complicação fatal, já que a LMA derivada da SMD é resistente à maioria das terapias e tem probabilidade de recidiva. A LMA que surge de novo devido a translocações ou mutações no tronco hematopoético e progenitores também é frequentemente resistente à quimioterapia padrão16,17. Como a SMD e a LMA são principalmente doenças de idosos, sendo a maioria diagnosticada acima de 60 anos, a maioria dos pacientes não é elegível para transplante curativo de medula óssea. Há, portanto, uma necessidade significativa de identificar novos reguladores da progressão da doença. Uma vez que o microambiente da medula óssea pode fornecer suporte para célulasmalignas14, a definição de alterações no nicho medular com a progressão da doença pode levar à identificação de novas terapêuticas que visem inibir o remodelamento do nicho tumoral. Há, portanto, uma necessidade significativa de identificar novos reguladores da progressão da doença. Para tanto, é fundamental identificar e caracterizar alterações nas populações de células estromais da medula óssea que possam dar suporte às células malignas.
Vários modelos murinos de LMA e SMD foram gerados e podem ser usados para estudar alterações no microambiente da medula óssea durante o início e progressão da doença 6,1,19,20,21,22. Neste estudo, são descritos protocolos para identificar alterações nas populações de células estromais da medula óssea utilizando modelos murinos deLMA induzida retroviricamente6,20, bem como o modelo Nup98-HoxD13 (NHD13) comercialmente disponível de MDS de alto risco para transformação de LMA19. Camundongos transplantados com células de novo da LMA sucumbem à doença em 20-30 dias6. Os camundongos NHD13 desenvolvem citopenias e displasia da medula óssea em torno de 15-20 semanas, que eventualmente se transforma em LMA, e quase 75% dos camundongos sucumbem à doença em torno de 32 semanas. Para analisar as populações do microambiente da medula óssea modelo murino, os ossos são colhidos, a medula óssea e as espículas ósseas são digeridas usando digestão enzimática, e as células são então enriquecidas para populações não-hematopoiéticas CD45-/Ter119- por classificação magnética. Embora análises semelhantes tenham sido descritas anteriormente 11,13,22,23,24,25, elas frequentemente se concentram na medula óssea ou no osso e não incorporam células de ambas as fontes em suas análises. A caracterização combinada dessas populações, em conjunto com análises de expressão gênica, pode fornecer uma compreensão abrangente de como o microambiente hematopoético celular fornece suporte para o início e progressão da doença (Figura 1). Embora o protocolo descrito abaixo se concentre no modelo de LMA induzida retroviricamente e em um modelo genético de SMD, essas estratégias podem ser facilmente adaptadas para estudar alterações no nicho da medula óssea de qualquer modelo murino de interesse.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos foram criados e mantidos nas instalações de cuidados com animais da Universidade de Rochester. Para modelar a SMD de alto risco, o modelo murino NHD13 comercialmente disponível19 é empregado. Neste modelo, as células estromais da medula óssea são analisadas em camundongos NHD13 fêmeas com 8 semanas de idade, antes do início da doença. De novo A LMA é gerada conforme previamente descrito 6,11,20. Os oncogenes usados para induzir LMA, como MLL-AF9 e NRas, são marcados com GFP ou YFP, permitindo a análise das populações não leucêmicas de GFP- medula óssea usando citometria de fluxo. Em resumo, camundongos fêmeas C57BL/6J de 10 semanas de idade são transplantados com células murinas GFP/YFP+ AML, e a medula óssea é colhida 2 semanas após o transplante. Enquanto camundongos fêmeas são usados neste estudo para fins de demonstração, este protocolo pode ser conduzido com camundongos machos ou fêmeas. Também pode ser realizado usando um fêmur ou todos os ossos longos.
1. Colheita de medula óssea
NOTA: Para detalhes sobre o protocolo de dissecção dos animais, consulte Amend et al.26.
- Limpar a argamassa e o pilão com etanol 70%, enxaguar com tampão FACS resfriado (Tabela 1) e colocá-los no gelo para esfriar antes de iniciar a colheita. Além disso, coloque o tampão MACs (Tabela 1) na bancada para permitir que ela atinja a temperatura ambiente.
- Eutanasiar o animal seguindo as orientações e protocolos institucionais de cuidados e uso dos animais.
- Na bancada, borrife bem o rato com etanol a 70% até molhar o pelo. Usando pinça e tesoura curva, levante a pele sobre o abdômen e faça duas incisões de aproximadamente 0,5 mm de comprimento em ambos os lados do mouse, lateralmente do abdômen. Em seguida, faça uma incisão de 0,5 mm distal ao abdome. Puxe para baixo para remover a pele e o pelo das pernas do rato.
- Coloque uma tesoura perpendicular à pelve, pressione para baixo enquanto puxa o fêmur com pinças. A cabeça femoral deve se desprender da pelve. Separe o fêmur e a tíbia na articulação patelofemoral. Coloque os ossos em tampão FACS em uma placa de 6 poços sobre gelo.
- Remova o tecido dos ossos usando tecido de nível laboratorial e coloque os ossos limpos em uma nova placa de 6 poços com tampão FACS fresco no gelo.
- Coloque todos os ossos na argamassa com 2-5 mL de tampão FACS para que todos os ossos fiquem imersos no tampão (ajuste o volume do tampão com base em quantos ossos você está processando). Esmague e triture os ossos usando o pilão em movimento circular até que o tecido da medula óssea seja liberado.
- Com uma seringa de 3 mL, homogeneizar a medula óssea puxando para cima e lavando o líquido da argamassa.
- Usando uma seringa de 3 mL, puxe o líquido da argamassa e filtre-o através de um filtro de células de 70 μm em um tubo de 50 mL sobre gelo. Enxaguar os pedaços de osso/tecido do filtro de volta para a argamassa com tampão FACS e retornar ao passo 1.7 para homogeneizar e coar uma segunda vez. Esta constitui a fração da medula óssea.
- Enxaguar os pedaços ósseos restantes (espículas) de volta na argamassa com tampão FACS e lavá-los em um tubo de 15 mL usando tampão FACS para garantir o máximo rendimento celular. Esta é a fração das espículas ósseas.
2. Digestão da medula óssea
- Centrifugar a medula óssea a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender a medula óssea em 2 mL da mistura de digestão da medula óssea (Tabela 1) e transferi-la para um tubo de 15 mL. Incubar a 37 °C durante 45 min num rotador.
- Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a digestão enzimática. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para um novo tubo de 50 ml.
- Pellet a mistura a 400 x g durante 7 min a 4 °C.
- Ressuspender a pastilha de medula óssea em 1 mL de tampão de lise eritrocitária (ver Tabela de Materiais). Incubar por 4 min no gelo.
- Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a lise. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para um novo tubo de 50 ml.
- Pellet a mistura a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão FACS.
3. Digestão das espículas ósseas
- Vórtice as espículas ósseas a partir do passo 1.9 e deixe-as assentar. Decantar o sobrenadante e reter o osso na parte inferior.
- Ressuspender as espículas ósseas em 1 mL da mistura de digestão da espícula óssea (Tabela 1).
- Colocar os tubos num rotador de tubo durante 60 minutos a 37 °C.
- Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a digestão enzimática. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para o tubo de 50 mL contendo medula óssea lisada e digerida por hemácias.
4. Coloração
- Misture suavemente as espículas ósseas e a suspensão de células da medula óssea.
- Utilizar 10 μL da suspensão celular para contar o número de células vivas em um hemocitômetro utilizando coloração à base de azul de Tripano 0,4%, conforme descrito em protocolos publicados27. Coletar 50.000 células para um controle sem manchas da suspensão celular.
- Centrifugar as células restantes a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e ressuspenda-o em 100 μL de tampão FACS.
NOTA: Os anticorpos podem ser titulados para determinar a diluição ideal. A seleção de anticorpos (epítopos e fluorocromos) pode ser personalizada. - Para coloração com anticorpos para depleção magnética, adicionar FC Block (1 μL por 25 x 106 células), CD45-APC (10 μL por 25 x 106 células) e Ter119-APC (4 μL por 25 x 106 células) (ver Tabela de Materiais).
- Incubar no gelo por 20 min. Lavar com tampão FACS, remover 50.000 células (~50 μL) para o controle corado com APC, centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C e ressuspender em 100 μL de tampão FACS.
- Para coloração da suspensão celular com microesferas para depleção magnética, adicionar mIgG (8 μL por 25 x 106 células) e microesferas Anti-APC (20 μL por 25 x 106 células) (ver Tabela de Materiais).
- Incubar no gelo por 20 min. Lavar com 10 ml de tampão FACS, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Depleção da amostra por triagem magnética
NOTA: Esta etapa é realizada usando um separador magnético manual disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. Esta etapa também pode ser executada com um separador automatizado (consulte a Tabela de Materiais).
- Preparar a coluna DL lavando-a com 2 mL de tampão MACs (Tabela 1). Descarte o efluente e troque o tubo coletor.
- Ressuspenda até 1 x 108 células em tampão MACs e filtre-as através de um tubo de ensaio de 5 mL com uma tampa de filtro de células de 35 μm.
- Coloque a coluna LD no suporte do separador magnético. Posicionar um tubo de ensaio de 5 ml abaixo da coluna para recolher o eluato.
- Adicione a suspensão da célula à coluna LD preparada. Permitir que a fração negativa flua para o tubo de coleta. Lavar a coluna duas vezes com 1 mL de tampão MACs, coletando o eluato no mesmo tubo. Esta é a fração negativa usada na etapa 5.6 abaixo.
- Retire a coluna LD do suporte do separador magnético e coloque-a num novo tubo de ensaio de 5 ml. Use uma pipeta para distribuir 3 mL de tampão na coluna para liberar as células que foram marcadas positivamente, usando o êmbolo de coluna.
- Centrifugar as fracções negativa e positiva a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspendê-los em 100 μL de tampão FACS.
- Contar 10 μL das frações negativa e positiva com 0,4% de azul de Tripano. Os volumes para a coloração do painel endotelial abaixo serão baseados nesta contagem celular.
- Use 50.000 células vivas da fração positiva para controles de contagem de citometria de fluxo.
6. Osteoanálise/coloração do painel endotelial
NOTA: A compensação deve ser realizada seguindo os protocolos padrão de citometria de fluxo, incluindo todos os controles apropriados de coloração e limitação.
- Para coloração da fração negativa CD45/Ter119 (1 μL de cada anticorpo por 1 x 106 células), adicionar CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE e CD140a-PE-Cy5 (ver Tabela de Materiais).
- Incubar no gelo por 20 min. Lavar com 2 ml de tampão FACS e, em seguida, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C.
- Adicionar 1 ml de tampão FACS e uma diluição de 1:1000 de IP para coloração viva/morta e, em seguida, filtrar a amostra através de um tubo de ensaio de 5 ml com uma tampa de filtro de células de 35 μm.
- Analise as células em um citômetro de fluxo multicolorido.
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Representative Results
Este artigo descreve um método baseado em citometria de fluxo para análise de populações microambientais da medula óssea, como células do estroma endotelial e mesenquimal, a partir de modelos murinos de SMD e leucemia (Figura 1). A Figura 2 ilustra a estratégia de gating para detecção das populações de interesse, iniciando-se com a seleção de células (P1) na fração digerida e CD45/Ter119 depletada através do perfil de dispersão anterior e lateral. Exemplos de agrupamento de células em uma amostra de leucemia são mostrados em P1 (Figura 2A). Singlets são selecionados e duplos são excluídos desta análise, P2 (Figura 2B). A Figura 2C mostra portas para selecionar células vivas negativas para iodo de propídio, P3. Para focar em populações estromais não hematopoéticas, células CD45-/Ter119-, P4 (APC, eixo Y) vs. Os CSC-A são selecionados (Figura 2D). Essa estratégia inicial de gating é comum a todas as amostras a serem analisadas.
O modelo murino de leucemia é utilizado para ilustrar o gating para células endoteliais nas Figuras 2E-G. A Figura 2E mostra CD31 positivo (Pe-Cy7, eixo Y) vs. Células SSC-A em um camundongo controle não cancerígeno, bem como em um camundongo leucêmico, fechado através de P4. As células marcadas positivamente com CD31 são células endoteliais, P5. Na Figura 2F, fechada até P5, as células endoteliais arteriolares são identificadas como CD45-Ter119-CD31+Sca1+, P6, e as células endoteliais sinusoidais são identificadas como CD45-Ter119-CD31+Sca1-, P7 (BV421, eixo Y) vs. CSC-A.
Embora esta análise se concentre em células microambientais não leucêmicas da medula óssea, ela também é útil para determinar a carga tumoral. Isso pode ser feito com uma pequena fração de amostra não digerida/não esgotada antes de iniciar o experimento. Neste controle experimental (linhas tracejadas) Figura 2G, P8 representa a carga tumoral na amostra e P9 representa as células não cancerosas.
O modelo murino MDS é usado para ilustrar a análise das células estromais mesenquimais na Figura 2H-J. A Figura 2H mostra CD31 negativo (Pe-Cy7, eixo Y) vs. Células SSC-A, fechadas através de P4. As populações de células estromais mesenquimais em um camundongo controle selvagem e um camundongo MDS são mostradas na Figura 2I. Gated através de P10, as células estromais mesenquimais são identificadas como CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+, P113 (Pe, eixo Y; Pe-Cy5, eixo X). O controle experimental (linhas tracejadas), Figura 2J mostra exemplos de controles de gating unicolor, coloração simples CD51 e coloração única CD140a usada para portar as CTMs mostradas nas amostras experimentais na Figura 2I.
Esses dados indicam que as células endoteliais arteriolares expandem-se significativamente no microambiente da LMA, com perda concomitante nas populações endoteliais sinusoidais (Figura 2F), consistente com estudos anteriores utilizando xenoenxertos derivados de pacientes em camundongos imunodeficientes28. É provável que a pequena expansão nas células estromais mesenquimais observada nos camundongos NHD13 com 8 semanas de idade (Figura 2I) possa aumentar em 16-20 semanas, quando esses camundongos começam a apresentar características de MDS25. Embora apenas o modelo de leucemia seja usado para ilustrar a população de células endoteliais e o modelo murino MDS seja usado para ilustrar as populações de células estromais mesenquimais, estratégias semelhantes de coloração e gating podem ser usadas para analisar as diferentes populações microambientais em qualquer um desses modelos, ou de fato, em qualquer modelo murino geneticamente modificado de interesse.
Figura 1: Isolamento das células estromais da medula óssea. Esquemático mostra o processo de isolamento de células estromais não hematopoéticas da medula óssea de camundongos controle e leucêmicos. Resumidamente, as espículas ósseas e a medula óssea são digeridas separadamente e, em seguida, agrupadas. A população CD45-Ter119- é enriquecida por classificação magnética e corada com painéis de anticorpos contra populações de interesse, como células estromais mesenquimais e células endoteliais. As células são então analisadas por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estratégia de gating para células não hematopoéticas da medula óssea e do estromal. (A-D) Estratégia de acoplamento por citometria de fluxo usada para selecionar populações não hematopoiéticas (P4) digeridas, CD45-/Ter119-, tanto no modelo murino de leucemia quanto no MDS. (E) As células endoteliais da medula óssea leucêmicas (P5, CD31+) podem ser subdivididas em (F) células endoteliais arteriolares (F) Sca1+ (P6) ou células endoteliais sinusoidais Sca1 (P7). (G) Enxerto de leucemia em uma amostra de LMA onde P8 representa enxerto enquanto P9 representa células não cancerosas. Linhas pontilhadas indicam que esta parcela é um controle experimental. (H) Gated através de P4, MDS células CD31- da medula óssea, P10 (I) células estromais mesenquimais (CD51+/CD140a+, P11). (J) Exemplo de controles de gating de cor única, CD51 (esquerda) e CD140a (direita) usados para determinar as comportas para células estromais mesenquimais em (I). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Reagente | Concentração | Valor a ser adicionado |
| Buffer FACS | HBSS | 10x | 100 mL |
| EDTA | 0.5 milh | 4 mL | |
| Soro Fetal Bovino | - | 50 mL | |
| Água | - | 848 mL | |
| Mistura de digestão de medula óssea | HBSS | 1x | 2 mL |
| DNase 1 | 1 μg/mL em 1x DPBS | 20 μL | |
| Dispase II Pó | - | magnésio 4 | |
| Colagenase Tipo IV | - | magnésio 2 | |
| Mistura de digestão de espículas ósseas | DPBS | 1x | 320 mL |
| Colagenase Tipo 1 | - | 1 gr | |
| Soro Fetal Bovino | - | 80 mL | |
| Buffer de MACs | BSA | 66 g/mol | 5 gr |
| DPBS | 10x | 100 mL | |
| EDTA | 0.5 milh | 4 mL | |
| Água | - | 896 litros |
Tabela 1: Composição das soluções e tampões utilizados no presente estudo.
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Discussion
Modelos de leucemia murina têm sido extensivamente utilizados para identificar sinais intrínsecos e de nicho celular que promovem progressão agressiva da leucemia mieloide 6,19,21. Aqui, um protocolo abrangente baseado em citometria de fluxo para definir a composição celular do microambiente da medula óssea em modelos murinos de SMD e LMA é apresentado.
Antes de adquirir dados de citometria de fluxo de amostras experimentais, é importante compensar cuidadosamente a sobreposição de fluorescência. Também é essencial incluir todos os controles apropriados de coloração e vedação. Essas etapas permitirão ao experimentador confirmar que a coloração positiva ou negativa de anticorpos representa a expressão precisa de marcadores celulares de interesse e não é um artefato de sobreposição espectral de fluorescência ou autofluorescência. Embora este protocolo descreva marcadores selecionados da superfície celular, os painéis de anticorpos podem ser expandidos com base na necessidade experimental. Por exemplo, CD144 (Ve-Caderina) pode ser administrado in vivo antes da colheita dos camundongos e pode servir como um marcador específico adicional de células endoteliais 5,29. Enquanto os fluoróforos e clones de anticorpos aqui indicados podem ser alterados, titulações devem ser realizadas para determinar sua diluição ideal. Para definir categoricamente todas as populações celulares no nicho da medula óssea, o sequenciamento de RNA de célula única pode ser usado para estabelecer a paisagem do nicho da medula óssea durante o início e progressão da SMD/LMA23,24,30.
É fundamental preparar a amostra cuidadosamente de acordo com as etapas descritas neste protocolo. Ao homogeneizar os ossos, é crucial que a argamassa e o pilão sejam resfriados, e todas as etapas são realizadas no gelo para evitar a morte celular e garantir alta recuperação celular. É muito importante remover todo o tecido ao redor dos ossos antes de homogeneizar para evitar a contaminação de outros tipos celulares indesejados. Durante a lise e digestão das hemácias, é importante parar a reação enzimática com uma quantidade apropriada de tampão FACS e ressuspender completamente em tampão fresco, ou as células continuarão a digerir e, eventualmente, morrerão.
A separação das frações óssea e medular é essencial, uma vez que as espículas ósseas requerem uma mistura diferente de enzimas para o tampão de digestão e precisam de mais tempo para digerir. Na digestão óssea, a colagenase tipo 1 é útil para digerir fibrilas colagenases comumente encontradas na matriz extracelular e fibras colágenas31. Além disso, algumas células da medula óssea localizadas próximas ao endósteo permanecerão aderidas ao osso após a homogeneização e só são liberadas por digestão enzimática. Na digestão da medula óssea, a colagenase tipo IV é utilizada para digerir a membrana basal das células epiteliais e endoteliais da medula óssea32, enquanto a dispase cliva principalmente a fibronectina31. A medula óssea requer menos tempo para digerir, pois as associações entre células e matriz são mais fracas. A incubação da fração medular óssea em condições semelhantes pode prejudicar as populações de interesse. O uso de dois tampões de digestão diferentes aumenta significativamente o número de populações de estomas que podem ser detectadas e, portanto, fornece um conjunto de dados maior para análise.
A maioria dos protocolos disponíveis para analisar populações microambientais de medula óssea murina utiliza uma seringa para liberar a medula óssea apenas dos ossos longos13,24. O método atual de esmagamento de ossos fornece a capacidade de adquirir dados de outros ossos, como a pelve, reduz significativamente o tempo de preparação da amostra e mitiga a possibilidade de lesões com agulhas cortantes. Dado que o osso é constituído por osteoblastos maduros e outras populações celulares que podem fornecer suporte a células hematopoiéticas normais e malignas, este método de inclusão de células das espículas ósseas permite uma representação mais precisa do microambiente da medula óssea na amostra. Embora um estudo anterior tenha digerido medula óssea e espículas ósseas separadamente11, ele não demonstrou coloração de osteolinhagem e células endoteliais na mesma amostra. Um segundo estudo usou misturas enzimáticas proprietárias comercialmente disponíveis para digerir a medula óssea e as espículas ósseas23, e analisou os dados usando a tecnologia significativamente mais cara de sequenciamento de RNA de célula única. Este método de enriquecimento para células CD45-/Ter119- seleciona células de interesse e reduz significativamente o tempo necessário para adquirir dados no citômetro de fluxo. Assim, comparado a outros métodos de última geração, como o sequenciamento de RNA de célula única, esse método baseado em citometria de fluxo é mais acessível, custo-efetivo e não requer análises sofisticadas por bioinformatas treinados 23,24,30.
É importante notar que este protocolo pode ser usado para caracterizar o microambiente da medula óssea não apenas de qualquer um dos modelos murinos disponíveis de SMD e LMA, mas de qualquer modelo genético de camundongo. Métodos semelhantes também podem ser eficazes na análise das alterações no nicho murino da medula óssea de modelos de xenoenxerto derivado de pacientes (PDX). Esses métodos podem ser úteis para estudos que visem determinar os mecanismos pelos quais a SMD/LMA afeta seu nicho medular. Diante dos desafios técnicos associados à amostragem de grandes quantidades de medula óssea de pacientes humanos, essas análises de modelos murinos são uma ferramenta eficaz para aprofundar a compreensão do microambiente maligno da medula óssea e definir seu papel na progressão da doença.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos ao Núcleo de Citometria de Fluxo da URMC. Este trabalho foi apoiado pela American Society of Hematology Scholar Award, Leukemia Research Foundation award e NIH grants R01DK133131 and R01CA266617 concedido a J.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
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