Summary
Här presenteras ett detaljerat protokoll för att isolera och karakterisera benmärgsmikromiljöpopulationer från murina modeller av myelodysplastiska syndrom och akut myeloisk leukemi. Denna teknik identifierar förändringar i den icke-hematopoetiska benmärgsnischen, inklusive endotel- och mesenkymala stromaceller, med sjukdomsprogression.
Abstract
Benmärgens mikromiljö består av distinkta cellpopulationer, såsom mesenkymala stromaceller, endotelceller, osteolineageceller och fibroblaster, som ger stöd till hematopoetiska stamceller (HSC). Förutom att stödja normala HSCs spelar benmärgens mikromiljö också en roll i utvecklingen av hematopoetiska stamcellssjukdomar, såsom myelodysplastiska syndrom (MDS) och akut myeloisk leukemi (AML). MDS-associerade mutationer i HSC leder till en blockering av differentiering och progressiv benmärgssvikt, särskilt hos äldre. MDS kan ofta utvecklas till behandlingsresistent AML, en sjukdom som kännetecknas av en snabb ackumulering av omogna myeloida blaster. Det är känt att benmärgens mikromiljö är förändrad hos patienter med dessa myeloida tumörer. Här beskrivs ett omfattande protokoll för att isolera och fenotypiskt karakterisera benmärgens mikromiljöceller från murina modeller av myelodysplastiskt syndrom och akut myeloisk leukemi. Att isolera och karakterisera förändringar i benmärgsnischpopulationerna kan hjälpa till att bestämma deras roll i sjukdomsinitiering och progression och kan leda till utveckling av nya terapier som riktar sig mot cancerfrämjande förändringar i benmärgens stromapopulationer.
Introduction
Benmärgens mikromiljö består av hematopoetiska celler, icke-hematopoetiska stromaceller och den extracellulära matrixen 1,2. Denna mikromiljö kan främja hematopoetisk självförnyelse av stamceller, reglera härstamningsdifferentiering och ge strukturellt och mekaniskt stöd till benvävnaden 1,2,3,4,5. Den stromala nischen inkluderar osteolineageceller, fibroblaster, nervceller och endotelceller6, medan den hematopoetiska nischen består av de lymfoida och myeloida populationerna 1,2,3. Förutom att stödja normala HSC kan benmärgens mikromiljö också spela en roll i utvecklingen av hematopoetiska stamcellssjukdomar som MDS och AML 7,8,9,10,11. Mutationer i osteolineageceller har visat sig främja utvecklingen av MDS, AML och andra myeloproliferativa tumörer 10,12,13,14.
Myelodysplastiska syndrom är en grupp pre-leukemiska sjukdomar som uppstår på grund av mutationer i hematopoetiska stamceller. MDS är ofta förknippat med en blockering av HSC-differentiering och produktion av dysplastiska celler, vilket ofta kan leda till benmärgssvikt. MDS är den vanligaste diagnostiserade myeloida tumören i USA och är förknippad med en 3-årsöverlevnad på 35%-45%15. MDS är ofta förknippat med en hög risk för omvandling till akut myeloisk leukemi. Detta kan vara en dödlig komplikation, eftersom MDS-härledd AML är resistent mot de flesta behandlingar och sannolikt kommer att återfalla. AML som uppstår de novo på grund av translokationer eller mutationer i hematopoetisk stam och progenitorer är också ofta resistent mot standardkemoterapi16,17. Eftersom MDS och AML främst är sjukdomar hos äldre, med majoriteten diagnostiserade över 60 års ålder, är de flesta patienter inte lämpliga för botande benmärgstransplantationer. Det finns därför ett stort behov av att identifiera nya regulatorer för sjukdomsprogression. Eftersom benmärgens mikromiljö kan ge stöd till maligna celler14, kan bestämning av förändringar i benmärgsnischen med sjukdomsprogression leda till identifiering av nya terapier som syftar till att hämma ombyggnad av tumörnischen. Det finns därför ett stort behov av att identifiera nya regulatorer för sjukdomsprogression. För detta ändamål är det viktigt att identifiera och karakterisera förändringar i benmärgens stromacellspopulationer som kan ge stöd till de maligna cellerna.
Flera murina modeller av AML och MDS har genererats och kan användas för att studera förändringar i benmärgens mikromiljö under sjukdomsinitiering och progression 6,1,19,20,21,22. Här beskrivs protokoll för att identifiera förändringar i benmärgens stromacellspopulationer med hjälp av murina modeller av retroviralt inducerad AML 6,20, samt den kommersiellt tillgängliga Nup98-HoxD13 (NHD13) modellen av högrisk MDS till AML-transformation19. Möss som transplanterats med de novo AML-celler dukar under för sjukdomen inom 20-30 dagar6. NHD13-mössen utvecklar cytopenier och benmärgsdysplasi runt 15-20 veckor, vilket så småningom omvandlas till AML, och nästan 75 % av mössen dukar under för sjukdomen runt 32 veckor. För att analysera musmodellens benmärgsmikromiljöpopulationer skördas ben, benmärg och benspikler smälts med hjälp av enzymatisk nedbrytning, och cellerna anrikas sedan för CD45-/Ter119- icke-hematopoetiska populationer genom magnetisk sortering. Liknande analyser har tidigare beskrivits 11,13,22,23,24,25, men de fokuserar ofta på antingen benmärgen eller benet och tar inte med celler från båda källorna i sina analyser. Den kombinerade karakteriseringen av dessa populationer, i kombination med genuttrycksanalyser, kan ge en omfattande förståelse för hur den cellulära hematopoetiska mikromiljön ger stöd för sjukdomsinitiering och progression (Figur 1). Även om protokollet som beskrivs nedan fokuserar på retroviralt inducerad AML-modell och en genetisk MDS-modell, kan dessa strategier enkelt anpassas för att studera förändringar i benmärgsnischen hos alla musmodeller av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av University of Rochester University Committee on Animal Resources. Möss föddes upp och hölls i djurvårdsanläggningarna vid University of Rochester. För att modellera högrisk-MDS används den kommersiellt tillgängliga NHD13 murin modell19. I denna modell analyseras benmärgsstromaceller i honmöss med NHD13 vid 8 veckors ålder, före sjukdomsdebut. De novo AML genereras som tidigare beskrivits 6,11,20. De onkogener som används för att inducera AML, såsom MLL-AF9 och NRas, är märkta med GFP eller YFP, vilket möjliggör analys av icke-leukemiska GFP-benmärgspopulationer med hjälp av flödescytometri. I korthet transplanteras 10 veckor gamla C57BL/6J-möss med murina GFP/YFP+ AML-celler, och benmärgen skördas 2 veckor efter transplantationen. Medan honmöss används i denna studie i demonstrationssyfte, kan detta protokoll utföras med antingen han- eller honmöss. Det kan också utföras med antingen ett lårben eller alla långa ben.
1. Skörd av benmärg
OBS: För detaljer om protokollet för dissektion av djur, se Modify et al.26.
- Rengör morteln och mortelstöten med 70 % etanol, skölj dem med kyld FACS-buffert (tabell 1) och lägg dem på is för att svalna innan skörden påbörjas. Placera också MAC-bufferten (tabell 1) på bänken så att den når rumstemperatur.
- Avliva djuret enligt institutionens riktlinjer och protokoll för djurvård och användning.
- Spraya musen noggrant med 70 % etanol på bänkskivan tills pälsen är våt. Använd en pincett och böjd sax, lyft huden på buken och gör två snitt som är cirka 0,5 mm långa på båda sidor av musen, lateralt från buken. Gör sedan ett 0,5 mm snitt distalt från buken. Dra nedåt för att ta bort skinn och päls från musens ben.
- Placera saxen vinkelrätt mot bäckenet, tryck nedåt samtidigt som du drar upp lårbenet med en pincett. Lårbenshuvudet ska lossna från bäckenet. Separera lårbenet och skenbenet vid patellofemoralleden. Placera benen i FACS-buffert i en 6-hålsplatta på is.
- Ta bort vävnad från benen med hjälp av vävnad av laboratoriekvalitet och placera de rengjorda benen i en ny 6-hålsplatta med färsk FACS-buffert på is.
- Placera alla ben i morteln med 2-5 ml FACS-buffert så att alla ben är nedsänkta i bufferten (justera buffertvolymen baserat på hur många ben du bearbetar). Krossa och mal benen med mortelstöten i en cirkulär rörelse tills benmärgsvävnaden frigörs.
- Använd en 3 ml spruta för att homogenisera benmärgen genom att dra upp och spola ner vätskan från morteln.
- Använd en 3 ml spruta, dra upp vätskan från morteln och filtrera den genom en 70 μm cellsil till ett 50 ml rör på is. Skölj ben-/vävnadsbitarna från filtret tillbaka i murbruket med FACS-buffert och återgå till steg 1.7 för att homogenisera och sila en andra gång. Detta utgör benmärgsfraktionen.
- Skölj tillbaka de återstående benbitarna (spikler) i morteln med FACS-buffert och spola dem i ett 15 ml rör med FACS-buffert för att säkerställa maximalt cellutbyte. Detta är fraktionen av benspikler.
2. Matsmältning av benmärg
- Centrifugera benmärgen vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Dekantera och kassera supernatanten.
- Återsuspendera benmärgen i 2 ml av benmärgsblandningen (tabell 1) och överför den till en 15 ml slang. Inkubera vid 37 °C i 45 min på en rotator.
- Tillsätt 10 ml FACS-buffert för att stoppa den enzymatiska nedbrytningen. Filtrera blandningen genom en 70 μm cellsil till ett nytt 50 ml rör.
- Pelletera blandningen i 400 x g i 7 minuter vid 4 °C.
- Återsuspendera benmärgspelleten i 1 ml RBC-lysbuffert (se materialförteckning). Inkubera i 4 min på is.
- Tillsätt 10 ml FACS-buffert för att stoppa lyseringen. Filtrera blandningen genom en 70 μm cellsil till ett nytt 50 ml rör.
- Pelletera blandningen i 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 μl FACS-buffert.
3. Matsmältning av benspikler
- Virvla benspikulerna från steg 1.9 och låt dem sätta sig. Dekantera supernatanten och behåll benet i botten.
- Återsuspendera benbalkarna i 1 ml av digestionsblandningen för benspikler (tabell 1).
- Placera rören på en rörrotator i 60 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 10 ml FACS-buffert för att stoppa den enzymatiska nedbrytningen. Filtrera blandningen genom en 70 μm cellsil till 50 ml röret som innehåller RBC-lyserad och nedbruten benmärg.
4. Färgning
- Blanda försiktigt benbalkarna och benmärgscellssuspensionen.
- Använd 10 μl av cellsuspensionen för att räkna antalet levande celler på en hemocytometer med 0,4 % trypanblåbaserad färgning, enligt beskrivningen i publicerade protokoll27. Samla 50 000 celler för en ofärgad kontroll från cellsuspensionen.
- Centrifugera de återstående cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och suspendera dem på nytt i 100 μl FACS-buffert.
OBS: Antikroppar kan titreras för att bestämma den ideala utspädningen. Val av antikroppar (epitoper och fluorokromer) kan anpassas. - För färgning med antikroppar för magnetisk utarmning, tillsätt FC Block (1 μL per 25 x 106 celler), CD45-APC (10 μL per 25 x 106 celler) och Ter119-APC (4 μL per 25 x 106 celler) (se Materialförteckning).
- Inkubera på is i 20 min. Tvätta med FACS-buffert, ta bort 50 000 celler (~50 μL) för den APC-färgade kontrollen, centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C och återsuspendera i 100 μL FACS-buffert.
- För färgning av cellsuspensionen med mikrokulor för magnetisk utarmning, tillsätt mIgG (8 μL per 25 x 106 celler) och Anti-APC-mikrokulor (20 μL per 25 x 106 celler) (se Materialförteckning).
- Inkubera på is i 20 min. Tvätta med 10 ml FACS-buffert, centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C.
5. Utarmning av provet genom magnetisk sortering
OBS: Detta steg utförs med hjälp av en kommersiellt tillgänglig manuell magnetisk separator enligt tillverkarens instruktioner. Detta steg kan också utföras med en automatiserad separator (se Materialförteckning).
- Förbered LD-kolonnen genom att tvätta den med 2 ml MAC-buffert (tabell 1). Kassera avloppsvattnet och byt uppsamlingsröret.
- Återsuspendera upp till 1 x 108 celler i MACs buffert och filtrera dem genom ett 5 ml provrör med ett 35 μm cellsillock.
- Placera LD-kolonnen på det magnetiska separatorstativet. Placera ett 5 ml provrör under kolonnen för att samla upp eluatet.
- Tillsätt cellsuspensionen till den beredda LD-kolonnen. Låt den negativa fraktionen rinna igenom in i uppsamlingsröret. Tvätta kolonnen två gånger med 1 ml MAC-buffert och samla upp eluatet i samma rör. Detta är det negativa bråket som används i steg 5.6 nedan.
- Ta bort LD-kolonnen från det magnetiska separatorstativet och placera den på ett nytt 5 ml provrör. Använd en pipett för att dosera 3 ml buffert i kolonnen för att spola ut celler som har märkts positivt med hjälp av kolonnkolven.
- Centrifugera de negativa och positiva fraktionerna vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. Återsuspendera dem i 100 μL FACS-buffert.
- Räkna 10 μL av de negativa och positiva fraktionerna med 0,4 % Trypan blue. Volymerna för osteoanalys/endotelpanelfärgning nedan kommer att baseras på detta cellantal.
- Använd 50 000 levande celler från den positiva fraktionen för flödescytometristyrningskontroller.
6. Osteoanalys/endotelpanelfärgning
OBS: Kompensation bör utföras enligt standardflödescytometriprotokoll, inklusive alla lämpliga färgnings- och gatingkontroller.
- För färgning av den negativa fraktionen av CD45/Ter119 (1 μL av varje antikropp per 1 x 106 celler), tillsätt CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE och CD140a-PE-Cy5 (se materialförteckning).
- Inkubera på is i 20 min. Tvätta med 2 ml FACS-buffert och centrifugera sedan vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Tillsätt 1 ml FACS-buffert och en 1:1000 utspädning av PI för levande/död färgning, filtrera sedan provet genom ett 5 ml provrör med ett 35 μm cellsillock.
- Analysera cellerna på en flerfärgad flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den här artikeln beskriver en flödescytometribaserad metod för att analysera benmärgens mikromiljöpopulationer, såsom endotel- och mesenkymala stromaceller, från MDS- och leukemimusmodeller (Figur 1). Figur 2 visar gating-strategin för detektion av populationer av intresse, som börjar med urvalet av celler (P1) i den smälta och CD45/Ter119-utarmade fraktionen genom framåt- och sidospridningsprofilen. Exempel på reglering av celler i ett leukemiprov visas i P1 (figur 2A). Singlets väljs och dubbletter utesluts från denna analys, P2 (Figur 2B). Figur 2C visar grindar för att välja propidiumjodnegativa levande celler, P3. För att fokusera på icke-hematopoetiska stromapopulationer, celler som är CD45-/Ter119-, P4 (APC, Y-axel) vs. SSC-A är valda (Figur 2D). Den här inledande grindstrategin är gemensam för alla prover som ska analyseras.
Den leukemimusa modellen används för att illustrera gating för endotelceller i figurerna 2E-G. Figur 2E visar CD31 positiv (Pe-Cy7, Y-axel) vs. SSC-A-celler i en icke-cancerkontrollmus samt en leukemimus, gated genom P4. Celler som är positivt märkta med CD31 är endotelceller, P5. I figur 2F, gated till P5, identifieras arteriolära endotelceller som CD45-Ter119-CD31+Sca1+, P6, och sinusformade endotelceller identifieras som CD45-Ter119-CD31+Sca1-, P7 (BV421, Y-axel) vs. SSC-A.
Även om denna analys fokuserar på icke-leukemiska mikromiljöceller i benmärgen, är det också till hjälp att bestämma tumörbördan. Detta kan göras med en liten del av osmält/icke-utarmat prov innan experimentet inleds. I denna experimentella kontroll (streckade linjer) Figur 2G representerar P8 tumörbördan i provet och P9 representerar de icke-cancerösa cellerna.
MDS-musmodellen används för att illustrera analys av mesenkymala stromaceller i figur 2H-J. Figur 2H visar CD31-negativ (Pe-Cy7, Y-axel) vs. SSC-A-celler, inhägnade till och med P4. Mesenkymala stromacellspopulationer i en kontrollmus av vildtyp och MDS-mus visas i figur 2I. Mesenkymala stromaceller identifieras som CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+, P113 (Pe, Y-axel; Pe-Cy5, X-axel). Den experimentella kontrollen (streckade linjer), figur 2J visar exempel på enfärgade gatingkontroller, CD51 enkel fläck och CD140a enkel fläck som används för att grinda för MSC som visas i de experimentella proverna i figur 2I.
Dessa data indikerar att arteriolära endotelceller expanderar signifikant i AML-mikromiljön, med en samtidig förlust i de sinusformade endotelpopulationerna (Figur 2F), vilket överensstämmer med tidigare studier med patienthärledda xenografter i möss med immunbrist28. Det är troligt att den lilla expansionen i de mesenkymala stromaceller som ses hos NHD13-möss vid 8 veckors ålder (Figur 2I) kan öka vid 16-20 veckor, när dessa möss börjar uppvisa egenskaper av MDS25. Även om endast leukemimodellen används för att illustrera endotelcellpopulationen och MDS-musmodellen används för att illustrera de mesenkymala stromacellspopulationerna, kan liknande färgnings- och gatingstrategier användas för att analysera de olika mikromiljöpopulationerna i någon av dessa modeller, eller faktiskt i någon genetiskt modifierad musmodell av intresse.
Figur 1: Isolering av stromaceller i benmärgen. Schematisk visar processen att isolera icke-hematopoetiska stromaceller i benmärgen från kontroll- och leukemimöss. Kortfattat smälts benspikler och benmärg separat och poolas sedan. CD45-Ter119-populationen berikas genom magnetisk sortering och färgas med antikroppspaneler mot populationer av intresse, såsom mesenkymala stromaceller och endotelceller. Cellerna analyseras sedan med flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Regleringsstrategi för icke-hematopoetiska benmärgs- och stromaceller. (A-D) Flödescytometri gating-strategi som används för att välja smälta, CD45-/Ter119-, icke-hematopoetiska populationer (P4) i både leukemi- och MDS-musmodellen. (E) Leukemi benmärg endotelceller (P5, CD31+) kan delas in som (F) Sca1+ arteriolar (P6) eller Sca1- sinusformade endotelceller (P7). (G) Leukemi engraftment i ett AML-prov där P8 representerar engraftment medan P9 representerar icke-cancerceller. Streckade linjer indikerar att detta diagram är en experimentell kontroll. (H) Gated genom P4, MDS benmärg CD31-celler, P10 (I) Mesenkymala stromaceller (CD51+/CD140a+, P11). (J) Exempel på enfärgade gatingkontroller, CD51 (vänster) och CD140a (höger) som används för att bestämma grindarna för mesenkymala stromaceller i (I). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Lösning | Reagens | Koncentration | Belopp att lägga till |
| FACS-buffert | HBSS | 10 ggr | 100 ml |
| EDTA | 0,5 m | 4 ml | |
| Serum hos foster hos nötkreatur | - | 50 ml | |
| Vatten | - | 848 ml | |
| Blandning av benmärgsuppslutning | HBSS | 1x | 2 ml |
| DNas 1 | 1 μg/ml i 1x DPBS | 20 μL | |
| Dispase II-pulver | - | 4 mg filmdragerade tabletter | |
| Kollagenas typ IV | - | 2 mg filmdragerade tabletter | |
| Digestionsblandning av benspikler | DPBS | 1x | 320 ml |
| Kollagenas typ 1 | - | 1 g | |
| Serum hos foster hos nötkreatur | - | 80 ml | |
| MACs-buffert | BSA | 66 g/mol | 5 g |
| DPBS | 10 ggr | 100 ml | |
| EDTA | 0,5 m | 4 ml | |
| Vatten | - | 896 L |
Tabell 1: Sammansättning av lösningar och buffertar som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modeller för musleukemi har använts i stor utsträckning för att identifiera cellinneboende och nischdrivna signaler som främjar progression av aggressiv myeloisk leukemi 6,19,21. Här presenteras ett omfattande flödescytometribaserat protokoll för att definiera den cellulära sammansättningen av benmärgens mikromiljö i murina modeller av MDS och AML.
Innan flödescytometriska data samlas in från experimentella prover är det viktigt att noggrant kompensera för fluorescensöverlappning. Det är också viktigt att inkludera alla lämpliga färgnings- och grindkontroller. Dessa steg kommer att göra det möjligt för experimentatorn att bekräfta att positiv eller negativ antikroppsfärgning representerar ett korrekt uttryck av cellmarkörer av intresse och inte är en artefakt av fluorescensspektral överlappning eller autofluorescens. Även om detta protokoll beskriver utvalda cellytemarkörer, kan antikroppspanelerna utökas baserat på experimentellt behov. Till exempel kan CD144 (Ve-Cadherin) administreras in vivo innan mössen skördas och kan fungera som en ytterligare specifik markör för endotelceller 5,29. Även om de fluoroforer och antikroppskloner som anges här kan ändras, bör titreringar utföras för att bestämma deras ideala utspädning. För att kategoriskt definiera alla cellpopulationer i benmärgsnischen kan encells-RNA-sekvensering användas för att etablera benmärgsnischlandskapet under MDS/AML-initiering och progression 23,24,30.
Det är viktigt att förbereda sample noggrant enligt stegen som beskrivs i detta protokoll. Vid homogenisering av benen är det viktigt att morteln och mortelstöten kyls, och alla steg utförs på is för att förhindra celldöd och för att säkerställa hög cellåterhämtning. Det är mycket viktigt att ta bort all vävnad som omger benen innan homogenisering för att förhindra kontaminering av andra oönskade celltyper. Under RBC-lys och matsmältning är det viktigt att stoppa den enzymatiska reaktionen med en lämplig mängd FACS-buffert och återsuspendera ordentligt i färsk buffert, annars fortsätter cellerna att smälta och så småningom dö.
Att separera ben- och benmärgsfraktionerna är viktigt eftersom benspikulerna kräver en annan blandning av enzymer för matsmältningsbuffert och behöver längre tid att smälta. I bennedbrytning är kollagenas typ 1 användbart för att smälta kollagenafibriller som vanligtvis finns i extracellulär matris och kollagenfibrer31. Dessutom kommer vissa benmärgsceller som ligger nära endosteum att förbli fästa vid benet efter homogenisering och frigörs endast genom enzymatisk matsmältning. Vid nedbrytning av benmärg används kollagenas typ IV för att smälta basalmembranet hos epitel- och endotelceller i benmärgen32, medan dispase huvudsakligen klyver fibronektin31. Benmärgen kräver mindre tid att smälta eftersom associationerna mellan celler och matris är svagare. Inkubation av benmärgsfraktionen under liknande förhållanden kan skada populationerna av intresse. Att använda två olika matsmältningsbuffertar ökar avsevärt antalet stomipopulationer som kan detekteras, och ger därmed en större datamängd att analysera.
De flesta tillgängliga protokoll för att analysera mikromiljöpopulationer av benmärg hos murina använder en spruta för att spola benmärgen från endast de långa benen13,24. Den nuvarande metoden för att krossa ben ger möjlighet att samla in data från andra ben som bäckenet, minskar provberedningstiden avsevärt och minskar risken för skador med vassa nålar. Med tanke på att benet består av mogna osteoblaster och andra cellpopulationer som kan ge stöd till normala och maligna hematopoetiska celler, möjliggör denna metod att inkludera celler från benspikulerna en mer exakt representation av benmärgens mikromiljö i provet. Medan en tidigare studie smälte benmärg och benspikler separat11, visade den inte färgning av osteolineage och endotelceller i samma prov. I en andra studie användes kommersiellt tillgängliga proprietära enzymblandningar för att smälta benmärg och benspikler23, och analyserade data med hjälp av den betydligt dyrare encells-RNA-sekvenseringstekniken. Denna metod för anrikning av CD45-/Ter119-celler selekterar för celler av intresse och minskar avsevärt den tid som behövs för att samla in data på flödescytometern. Således, jämfört med andra toppmoderna metoder som encells-RNA-sekvensering, är denna flödescytometribaserade metod mer tillgänglig, kostnadseffektiv och kräver inte sofistikerad analys av utbildade bioinformatiker 23,24,30.
Det är viktigt att notera att detta protokoll kan användas för att karakterisera benmärgens mikromiljö för inte bara någon av de tillgängliga murina modellerna av MDS och AML utan alla genetiska musmodeller. Liknande metoder kan också vara effektiva för att analysera förändringar i den murina benmärgsnischen hos PDX-modeller (Patient Derived Xenograft). Dessa metoder kan vara användbara för studier som syftar till att bestämma de mekanismer genom vilka MDS/AML påverkar deras benmärgsnisch. Med tanke på de tekniska utmaningar som är förknippade med provtagning av stora mängder benmärg från mänskliga patienter, är dessa analyser av murina modeller ett effektivt verktyg för att öka förståelsen för den maligna benmärgens mikromiljö och definiera dess roll i sjukdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter har deklarerats.
Acknowledgments
Vi vill tacka URMC Flow Cytometry Core. Detta arbete stöddes av American Society of Hematology Scholar Award, Leukemia Research Foundation Award och NIH-anslag R01DK133131 och R01CA266617 som tilldelats J.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
- Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
- Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
- Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
- Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
- Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
- Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
- Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
- Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W.
- Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
- Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
- Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
- Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
- Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
- Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).
