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Immunology and Infection

क्रायोप्रिजर्वेशन और मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का बायोएनेरजेटिक मूल्यांकन

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65730
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Center, Institute of Nutritional Sciences, Justus-Liebig-University of Giessen

Summary

पृथक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का उपयोग प्रतिरक्षा कार्यों और विकारों, चयापचय रोगों या माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। इस काम में, हम पूरे रक्त से पीबीएमसी की तैयारी और बाद के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक मानकीकृत विधि का वर्णन करते हैं। क्रायोप्रिजर्वेशन इस समय और स्थान को स्वतंत्र बनाता है।

Abstract

यूकेरियोटिक कोशिकाओं के शारीरिक कार्य मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा प्रदान की जाने वाली ऊर्जा पर निर्भर करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन चयापचय रोगों और उम्र बढ़ने से जुड़ा हुआ है। ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण एक निर्णायक भूमिका निभाता है, क्योंकि यह ऊर्जावान होमियोस्टेसिस के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। पीबीएमसी को माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए न्यूनतम इनवेसिव नमूने के रूप में पहचाना गया है और रोग की स्थिति को प्रतिबिंबित करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनेरजेटिक फ़ंक्शन का माप मानव नमूनों में कई कारकों द्वारा सीमित किया जा सकता है। सीमाएं लिए गए नमूनों की मात्रा, नमूना समय है, जो अक्सर कई दिनों और स्थानों में फैली हुई है। एकत्र किए गए नमूनों का क्रायोप्रिजर्वेशन नमूनों के लगातार संग्रह और माप को सुनिश्चित कर सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि मापा गया पैरामीटर क्रायोप्रेज़र्व्ड और हौसले से तैयार कोशिकाओं के बीच तुलनीय है। यहां, हम इन कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया के बायोएनेरजेटिक फ़ंक्शन का विश्लेषण करने के लिए मानव रक्त के नमूनों से पीबीएमसी को अलग करने और क्रायोप्रेज़र्विंग करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार पीबीएमसी क्रायोप्रिजर्व सेल नंबर और व्यवहार्यता, एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट के स्तर में केवल मामूली अंतर दिखाते हैं, और ताजा कटाई कोशिकाओं की तुलना में श्वसन श्रृंखला गतिविधि को मापा जाता है। वर्णित तैयारियों के लिए केवल 8-24 एमएल मानव रक्त की आवश्यकता होती है, जिससे नैदानिक अध्ययन के दौरान नमूने बहुकेंद्रीकृत रूप से एकत्र करना और साइट पर उनके बायोएनेरगेटिक्स का निर्धारण करना संभव हो जाता है।

Introduction

मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) प्रतिरक्षाविज्ञानी और bioenergetic मुद्दों, इस तरह के उम्र बढ़ने की प्रक्रियाओं या अपक्षयी रोगों 1,2 से संबंधित उन लोगों के अध्ययन सहित, कई वैज्ञानिक क्षेत्रों में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है. पीबीएमसी संरचना में विषम हैं और इसमें लिम्फोसाइट्स (बी कोशिकाएं, टी कोशिकाएं और एनके कोशिकाएं), मोनोसाइट्स और डेंड्राइटिक कोशिकाएं शामिल हैं। कोशिकाएं कभी-कभी किसी विषय के भीतर महान व्यक्तिगत अंतर और विविधताएं दिखाती हैं, इसलिए इन कोशिकाओं को संभालने के लिए मानकीकृत प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। व्यवहार्यता और अलगाव की शुद्धता जैसे महत्वपूर्ण पैरामीटर इसके हैंडलिंग के लिए बुनियादी आवश्यकताएं हैं और इसके अतिरिक्त पर्यावरणीय कारकों से प्रभावित होते हैं जैसे कि संग्रह का समय, मेलाटोनिन स्तर, चाहे विषय उपवास कर रहा हो, और अन्य 3,4।

पीबीएमसी के बायोएनेरगेटिक्स पर अध्ययन के आधार पर, हम यहां पीबीएमसी के अलगाव, क्रायोप्रिजर्वेशन और खेती के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं जो अन्य तरीकों के लिए भी उपयुक्त है। जबकि मांसपेशियों की बायोप्सी को माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय5 के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है, रक्त कोशिकाओं की परीक्षा एक तेजी से, न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया है। इसके अलावा, अधिक से अधिक अध्ययनों से पता चलता है कि उम्र बढ़ने और अल्जाइमर रोग (एडी) में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में परिवर्तन न केवल मस्तिष्क में बल्कि परिधि 6,7,8,9,10 में भी होते हैं। विधि भी मधुमेह मेलेटस और मोटापा 11,12,13 सहित अन्य स्थितियों और रोगों की जांच की अनुमति देता है. एकाधिक काठिन्य रोगियों में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण किया जा सकता है, या प्रतिरक्षा समारोह और सामान्य14,15,16 में उस पर प्रभाव.

पीबीएमसी आमतौर पर एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी)17,18उत्पन्न करने के लिए ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (ओएक्सएफओएस) पर भरोसा करते हैं। इसलिए, पीबीएमसी सरोगेट्स के रूप में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर करते हैं। पिछली रिपोर्टों में, पीबीएमसी के ऊर्जा चयापचय का उपयोग अंग की शिथिलता को संबोधित करने के लिए किया गया है, जैसे कि प्रारंभिक दिल की विफलता19, सेप्टिक शॉक20 या माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में सेक्स से जुड़े अंतर4। क्रायोप्रिजर्वेशन, पृथक्करण और पीबीएमसी की खेती के लिए एक सामान्यीकृत विधि से विभिन्न संस्थानों में प्राप्त परिणामों की तुलनात्मकता में लाभ होगा। प्रत्येक चरण21,22 के लिए प्रोटोकॉल में भिन्नता का एक बड़ा सौदा है, इस पद्धति का लक्ष्य PBMC में bioenergetic माप के लिए एक दिशानिर्देश प्रदान करना है.

इस लेख में हम PBMC में बायोएनेरजेटिक मापदंडों को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। हम मानव रक्त से पीबीएमसी के बायोएनेरगेटिक्स को अलग करने, क्रायोप्रेज़र्विंग और मापने के तरीकों की व्याख्या करते हैं। इस पद्धति का उपयोग रोगियों में बायोएनेरजेटिक मापदंडों को निर्धारित करने और नैदानिक संदर्भ में उनका मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। इन मापों को लागू करने के लिए, शोधकर्ताओं को एक रोगी आबादी तक पहुंच की आवश्यकता होती है जिसमें से ताजा रक्त के नमूने प्राप्त किए जा सकते हैं।

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Protocol

रक्त संग्रह, अलगाव और विश्लेषण के लिए इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई है और जर्मनी के गिएसेन विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है। अध्ययन में अपने नमूने शामिल करने के लिए रोगियों की सहमति प्राप्त की गई थी। अलगाव और सेल संस्कृति के लिए सभी कदम एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत किए जाते हैं।

1. वेनिपंक्चर

  1. कीटाणुशोधन स्प्रे, बाँझ झाड़ू, 80 मिमी ट्यूब और बहु-एडाप्टर, टूर्निकेट / ब्लड प्रेशर कफ, मोनोवेट 9 एमएल लिथियम-हेपरिन के साथ रक्त संग्रह प्रवेशनी सहित रक्त संग्रह के लिए आवश्यक सभी उपकरण तैयार करें।
    नोट: थक्कारोधी के रूप में EDTA भी प्रभावी है।
  2. सबसे उपयुक्त हाथ शिरा से रक्त ले लीजिए, आमतौर पर वेना मेडिना क्यूबिटी या वेना सेफलिका।
  3. हल्के दबाव के साथ एक टूर्निकेट/ब्लड प्रेशर कफ लगाएं, लगभग 80 मिमी/एचजी।
  4. शराब युक्त कीटाणुनाशक स्प्रे के साथ दस्ताने और पंचर साइट कीटाणुरहित। कीटाणुरहित पंचर साइट को हवा में सूखने दें।
  5. दबाव कफ के दबाव के कारण नसें फैल जाती हैं। आघात से बचने और जांच को कम करने का प्रयास करने वाली नस के 15 ° -20 ° कोण पर सुई (प्रवेशनी व्यास (बाहरी) 21G / 0.8 मिमी, लंबाई 19 मिमी) डालें।
  6. उपयुक्त प्रणाली के साथ रक्त लें, 9 एमएल रक्त युक्त 4 ट्यूब (एक प्रयोगकर्ता के लिए ठीक से अलग करने के लिए 7-8 ट्यूब से अधिक समस्याग्रस्त हैं)।
  7. रक्त संग्रह के बाद, एक समान एंटीकोआग्यूलेशन सुनिश्चित करने के लिए संग्रह ट्यूबों को 5 मिनट के लिए अंधेरे में रखें।

2. पीबीएमसी अलगाव

  1. नीचे वर्णित अनुसार सभी आवश्यक समाधान तैयार करें।
  2. Dulbecco के संतुलित नमक समाधान (DPBS; एकाग्रता 1x) और लिम्फोसाइट अलगाव माध्यम (1.077 g/mL) को कमरे के तापमान (20-25 °C) में लाएं।
  3. कमरे के तापमान पर भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) तैयार करें और बर्फ पर एफबीएस के साथ एक बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब रखें। प्रत्येक रक्त के नमूने के लिए, एफबीएस के 2 एमएल की आवश्यकता होती है।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंड कंटेनर और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रीकोल क्रायोट्यूब स्टोर करें।
  5. गर्म सेल संस्कृति मध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस, माध्यम में आरपीएमआई 1640 में 50 एमएल एफबीएस और पेनिसिलिन 50 यू / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 50 यू / एमएल होते हैं। इस समाधान अप करने के लिए 2 महीने के लिए 3 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  6. बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में डीपीबीएस के 8 एमएल जोड़ें। बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में लिम्फोसाइट अलगाव माध्यम के 15 एमएल जोड़ें (माध्यम प्रकाश संवेदनशील है, अलगाव शुरू करने से पहले इसे जोड़ें)।
  7. डीपीबीएस के 8 एमएल में 8 एमएल रक्त जोड़ें, और ध्यान से 3 एमएल प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ मिलाएं।
  8. लिम्फोसाइट अलगाव माध्यम के शीर्ष पर एक 3 एमएल प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ धीरे से मिश्रण रक्त / पहली परत को माध्यम में लागू करने के लिए, ट्यूब को 20 ° -30 ° झुकाएं, जिसके परिणामस्वरूप मध्यम परत में रक्त-पीबीएस मिश्रण का कम प्रवेश होगा।
  9. लिम्फोसाइट अलगाव माध्यम पर ट्यूब की साइड की दीवार पर रक्त-पीबीएस मिश्रण को सावधानी से परत करें। रक्त प्रवाह को स्थिर रखने के लिए एक स्थिर गति का प्रयोग करें।
  10. अगले चरण में, ट्यूब को धीरे-धीरे एक ईमानदार स्थिति में लाएं, शेष रक्त को रक्त परत पर ट्यूब की साइड की दीवार पर सावधानीपूर्वक स्तरित किया जाता है।
  11. ब्रेक बंद के साथ एक झूलते बाल्टी रोटर के साथ एक अपकेंद्रित्र में कमरे के तापमान पर 1000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। अपकेंद्रित्र के बाद, रक्त/पीबीएमसी मिश्रण को चार परतों में विभाजित किया जाता है। शीर्ष परत में प्लाज्मा और प्लेटलेट्स होते हैं, दूसरी परत पीबीएमसी परत होती है, इसके बाद एक लिम्फोसाइट अलगाव मध्यम परत होती है, और अंत में, नीचे की परत में एरिथ्रोसाइट्स और ग्रैनुलोसाइट्स। विभिन्न परतों चित्रा 1 में प्रदर्शित कर रहे हैं.
  12. एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ प्लाज्मा परत के 2/3आरडी निकालें.
  13. एक 1 एमएल विंदुक का प्रयोग, लिम्फोसाइट अलगाव मध्यम परत पर PBMC इकट्ठा, ध्यान रखना नमूना में किसी भी माध्यम प्राप्त नहीं करने के लिए.
  14. टिप 1 मिमी PBMC परत के ऊपर रखें. पीबीएमसी परत को पंचर नहीं किया जाना चाहिए, अन्यथा माध्यम कोशिकाओं पर प्रवाहित होगा। पिपेट का चूषण पीबीएमसी को इस बिंदु तक खींचता है ताकि उन्हें इस बिंदु पर कई बार एकत्र किया जा सके।
    नोट: एकत्र पीबीएमसी की संख्या को अधिकतम करने के लिए, प्रक्रिया के अंत में सतह पर बाकी के लिए खोज करें और वहां कोशिकाओं को इकट्ठा करने का प्रयास करें। प्रक्रिया को स्थिर करने के लिए, ट्यूब को सतह पर रखा जा सकता है।
  15. पीबीएमसी को कदम से कदम एक नई 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जब तक कि परत पूरी तरह से काटा न जाए। डीपीबीएस को 25 एमएल के निशान तक जोड़ें, लिम्फोसाइट अलगाव माध्यम और अन्य अवशेषों को धो लें।
  16. ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर 100 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। एक वैक्यूम पंप या इसी तरह के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें, ध्यान रखें कि सेल गोली को नुकसान न पहुंचे।
  17. डीपीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और डीपीबीएस को 25 एमएल के निशान में जोड़ें। एक बार फिर से धोने को दोहराएं और फिर अगले चरणों के लिए उपयुक्त माध्यम में फिर से निलंबित करें।

Figure 1
चित्रा 1: विभिन्न परतों को चित्रित करने के लिए घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. क्रायोप्रिजर्वेशन

  1. एक फ्रीजिंग कंटेनर को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, बर्फ पर एफबीएस ठंडा करें।
  2. 1 एमएल विंदुक के साथ एफबीएस के 1 एमएल में पीबीएमसी गोली को फिर से निलंबित करें, एफबीएस कमरे के तापमान पर होना चाहिए।
  3. बर्फ 1: 5 पर प्री-कूल्ड एफबीएस के साथ डीएमएसओ मिलाएं, अंतिम एकाग्रता 20% डीएमएसओ फिर एफबीएस: डीएमएसओ मिश्रण को बर्फ पर वापस रखें। घोल हमेशा ताजा तैयार करें।
  4. FBS में PBMC सेल निलंबन को अच्छी तरह से लेबल किए गए 2 एमएल क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें। संग्रह ट्यूब प्रति एक क्रायोट्यूब का प्रयोग करें. 1 x 107 और 5 x 107 प्रति mL के बीच कोशिकाओं की संख्या समायोजित करें। सेल काउंट और व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें।
  5. एफबीएस के 1 एमएल जोड़ें: डीएमएसओ मिश्रण ड्रॉपवाइज 1 एमएल पिपेट के साथ, ट्यूब में लगभग 1-2 बूंदें। ड्रॉपवाइज जोड़ निरंतर और लगातार मिश्रण की ओर जाता है।
  6. ट्यूबों को प्रीकूल्ड फ्रीजिंग कंटेनर में रखें। 24 घंटे के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ठंड कंटेनर रखें. ठंड कंटेनर प्रति मिनट -1 डिग्री सेल्सियस की नियंत्रित शीतलन प्रदान करता है।
  7. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ट्यूबों निकालें. फ्रीजर से हटाने के बाद, ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन के गैस चरण में स्टोर करें। प्रत्येक नमूने के स्थान का दस्तावेजीकरण करें।

4. विगलन

  1. सभी आवश्यक समाधान तैयार करें: सेल कल्चर मध्यम आरपीएमआई 1640 एफबीएस के 50 एमएल और पेनिसिलिन 50 यू / एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन 50 यू / एमएल के साथ। इस समाधान को 2 महीने तक 3 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. पूर्व गर्म सेल संस्कृति मध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस. बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में पूर्व गर्म सेल संस्कृति माध्यम के 3 एमएल जोड़ें.
  3. तरल नाइट्रोजन टैंक से नमूना निकालें। लगभग 3.5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में नमूने पिघलाएं, जैसे ही अंतिम बर्फ पिघल रही है, पानी के स्नान से हटा दें। बर्फ का एक पिनहेड आकार का टुकड़ा अभी भी ट्यूब में दिखाई देना चाहिए।
    नोट: डीएमएसओ पीबीएमसी के काम के लिए हानिकारक है जितनी जल्दी हो सके।
  4. सेल निकालें: एफबीएस: डीएमएसओ क्रायोट्यूब से 1 एमएल पिपेट के साथ मिलाएं। तैयार 50 एमएल ट्यूबों में सेल संस्कृति माध्यम के साथ पीबीएमसी नमूनों को मिलाएं। 2 एमएल, 2 एमएल, और 1 एमएल के तीन चरणों में संस्कृति माध्यम के 5 एमएल के साथ ट्यूबों को धो लें।
  5. माध्यम को ट्यूबों में स्थानांतरित करें। यह संभव सेल अवशेषों को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। कमरे के तापमान पर 100 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और नियोजित उपयोग के लिए उपयुक्त माध्यम के 1 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को बाद के प्रयोगों के लिए तैयार कर रहे हैं.
    नोट: हालांकि, ताजा या जमे हुए कोशिकाओं पर कार्यात्मक परीक्षणों के साथ, एक इनक्यूबेटर (आमतौर पर रात भर) में आराम की अवधि अक्सर लिम्फोसाइट अलगाव मध्यम आधारित अलगाव या सेल विगलन के बाद सिफारिश की है।

5. सेल संस्कृति

  1. अलगाव या विगलन संस्कृति कोशिकाओं के बाद 5% सीओ2/95% हवा में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात।
  2. आरपीएमआई माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को 10% एफबीएस, पेनिसिलिन 50 यू / एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन 50 यू / एमएल के साथ पूरक करें। आगे उपयोग के लिए कई संभावनाएं हैं, परख के लिए आवश्यकतानुसार कोशिकाओं का इलाज करें।
  3. सामान्य भंडारण के लिए बाँझ 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों और फसल की अवधि के बाद कोशिकाओं का उपयोग करें. एक अच्छी तरह से में एक 1 एमएल विंदुक के साथ सेल निलंबन के 1 एमएल स्थानांतरण और सेल संस्कृति माध्यम के 4 एमएल जोड़ें.
    नोट: पृथक पीबीएमसी की मात्रा व्यक्तियों के बीच बहुत भिन्न होती है, सेल संस्कृति माध्यम के 5 एमएल के साथ एक अच्छी तरह से रक्त के प्रत्येक 8 एमएल के लिए पर्याप्त है। हालांकि, जब पीबीएमसी को बफी कोट से अलग किया जाता है, तो पीबीएमसी की मात्रा पूरे रक्त के नमूनों की तुलना में काफी अधिक होती है और इसलिए कोशिकाओं को कई कुओं में विभाजित किया जाना चाहिए।
  4. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ पूरक आर्द्र वातावरण में 24 घंटे आराम करने दें। यह इनक्यूबेशन ताजा पृथक कोशिकाओं के साथ-साथ क्रायोप्रेज़र्ड कोशिकाओं के लिए किया जाता है।

6. एटीपी परख

  1. 10% एफबीएस, पेनिसिलिन 50 यू/एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन 50 यू/एमएल के साथ पूरक आरपीएमआई माध्यम के 1 एमएल में पिघले हुए पीबीएमसी को फिर से निलंबित करें।
  2. एक नमूना लें और सेल काउंट निर्धारित करें, फिर ट्रिपैन ब्लू के साथ लाइव-डेड भेदभाव करें। resuspended कोशिकाओं से 10 माइक्रोन ले लो और 90 μL सेल संस्कृति माध्यम के साथ मिश्रण. फिर 10 माइक्रोन लें और ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन के साथ मिलाएं। कोशिकाओं को या तो एक सेल गिनती कक्ष या एक स्वचालित सेल काउंटर में रखें और जीवित / मृत कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें।
  3. 96-अच्छी तरह से सफेद पॉलीस्टायर्न प्लेट में 1 x 105 कोशिकाओं/100 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से घनत्व पर कोशिकाओं की प्लेट 100 माइक्रोन।
  4. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ पूरक आर्द्र वातावरण में 24 घंटे के लिए आराम करने दें।
  5. एक एटीपी परख के साथ एटीपी सांद्रता का निर्धारण.
    1. प्रकाश उत्सर्जन का उपयोग करें जो तब होता है जब एटीपी को लूसिफ़ेरिन के साथ जोड़ा जाता है। उत्सर्जित प्रकाश का मूल्यांकन प्लेट रीडर के साथ किया जा सकता है। इनक्यूबेटर के लिए प्लेटें निकालें 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए. कोशिकाओं Lyse और 5 मिनट के लिए उन्हें छोड़ दें. फिर कोशिकाओं पर निगरानी अभिकर्मक लागू करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार मापें। एटीपी स्तर निर्धारित करने के लिए एक आंतरिक मानक का उपयोग किया जाता है।

7. उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री

  1. उच्च संकल्प oxygraph पर मुड़ें और यह 30 मिनट के लिए गर्म करते हैं.
  2. चित्रा 1 में वर्णित एक प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं का इलाज. तालिका 1 में आवश्यक सभी स्टॉक तैयार करें।
  3. दोनों उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑक्सीग्राफ कक्षों में श्वसन बफर (तालिका 1) के पिपेट 2.1 एमएल और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कक्षों (750 आरपीएम) में मौजूद चुंबकीय सरगर्मी बार का उपयोग करके लगातार बफर को हिलाएं जब तक कि पोलेरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर का एक स्थिर ऑक्सीजन फ्लक्स सिग्नल प्राप्त न हो।
    नोट: ऑक्सीग्राफ के कक्षों में, वास्तविक समय (प्रवाह) में ऑक्सीजन की खपत और कक्ष की ऑक्सीजन संतृप्ति को पोलोग्राफिक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड की सहायता से मापा जाता है। पृष्ठभूमि शोर से बचने और विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए पृष्ठभूमि अंशांकन किया जाना चाहिए।
  4. निर्माता के प्रोटोकॉल23 के अनुसार पोलेरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर का वायु अंशांकन करें।
  5. माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माध्यम के 1 एमएल में पृथक पीबीएमसी को फिर से निलंबित करें (एमआईआर 05 संरचना तालिका 1 में दिखाई गई है) और 8 x 106 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें।
  6. वायु अंशांकन के बाद, ऑक्सीग्राफ कक्ष से श्वसन माध्यम को महाप्राण करें और श्वसन के प्रत्येक ऊंट में सेल निलंबन के 2.1 एमएल जोड़ें। यदि माप के दौरान आवश्यक हो तो कक्षों को पुन: ऑक्सीजनित करें ( चित्र 2 में बिंदु एच पर खोलें), कक्षों की ऑक्सीजन संतृप्ति 100 माइक्रोन से नीचे नहीं गिरनी चाहिए।
  7. स्टॉपर्स डालकर कक्षों को बंद करें, कक्षों को 2.0 एमएल वॉल्यूम रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है। उभरते सेल निलंबन महाप्राण।
  8. लगातार कक्ष में स्थित एक चुंबकीय उत्तेजक (750 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन मिश्रण. के बारे में 20 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक एक स्थिर संकेत प्राप्त किया है. अंतर्जात श्वसन ((ए) चित्रा 2 में निर्धारित करें।
  9. श्वसन श्रृंखला की विभिन्न जटिल गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए, स्टॉपर्स के टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाहों के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के लिए सब्सट्रेट और अवरोधकों को इंजेक्ट करें। कक्ष में निम्नलिखित अंतिम एकाग्रता का प्रयोग करें.
  10. कोशिका झिल्ली को बाधित करने के लिए, चैम्बर स्टॉपर के टाइटेनियम इंजेक्शन पोर्ट के माध्यम से 8.1 मिमी डिजिटोनिन के 5 माइक्रोन जोड़ें, जबकि माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली बरकरार रहते हुए भोले सब्सट्रेट (बी) को हटाने के लिए।
  11. चैम्बर स्टॉपर के इंजेक्शन पोर्ट के माध्यम से सब्सट्रेट 2 एम ग्लूटामेट और 800 मिमी मैलेट जोड़ें और एक स्थिर संकेत प्राप्त होने तक श्वसन रिकॉर्ड करें। संकेत 2-4 मिनट के बाद स्थिर हो जाता है।
    नोट: पाइरूवेट जैसे अतिरिक्त सब्सट्रेट का उपयोग करना भी संभव है।
  12. चैम्बर स्टॉपर के इंजेक्शन पोर्ट के माध्यम से 500 एमएम एडेनोसिन डिपोस्फेट (एडीपी) के 8 माइक्रोन जोड़ें और एक स्थिर संकेत प्राप्त होने तक श्वसन रिकॉर्ड करें। संकेत चित्रा 2 में 2-4 मिनट (घ) के बाद स्थिर हो जाता है.
  13. चैम्बर स्टॉपर के इंजेक्शन पोर्ट के माध्यम से 1 एम succinate के 20 माइक्रोन जोड़ें और एक स्थिर संकेत प्राप्त होने तक श्वसन रिकॉर्ड करें। संकेत चित्रा 2 में 2-4 मिनट (ई) के बाद स्थिर हो जाता है.
  14. 1 एम कार्बोनिल साइनाइड पी-ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) को 0.5 माइक्रोन पर चरणबद्ध तरीके से उस बिंदु तक टाइट्रेट करें जहां आगे कोई वृद्धि नहीं होती है। 2-4 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि चित्रा 2 में संकेत (एफ) स्थिर न हो जाए। जब श्वसन में और वृद्धि न हो, तो अगले चरण के साथ जारी रखें।
    चेतावनी: FCCP से निपटने के दौरान सावधान रहें क्योंकि इसमें मनुष्यों के लिए स्वास्थ्य जोखिम हैं।
  15. चैम्बर स्टॉपर के इंजेक्शन पोर्ट के माध्यम से 0.1 एमएम रोटेनोन के 5 माइक्रोन जोड़ें और एक स्थिर संकेत प्राप्त होने तक श्वसन रिकॉर्ड करें। संकेत चित्रा 2 में 2-4 मिनट (जी) के बाद स्थिर हो जाता है।
    सावधानी: रोटोनोन को संभालते समय सावधान रहें क्योंकि इसमें मनुष्यों के लिए स्वास्थ्य जोखिम हैं।
  16. चैम्बर स्टॉपर के इंजेक्शन पोर्ट के माध्यम से 4 मिलीग्राम/एमएल ओलिगोमाइसिन का 1 माइक्रोन जोड़ें और एक स्थिर संकेत प्राप्त होने तक श्वसन रिकॉर्ड करें। संकेत चित्रा 2 में 2-4 मिनट (एच) के बाद स्थिर हो जाता है.
    चेतावनी: ऑलिगोमाइसिन को संभालते समय सावधान रहें क्योंकि यह एक जहर है जो मनुष्यों के लिए स्वास्थ्य जोखिम पैदा करता है।
  17. चैम्बर स्टॉपर के इंजेक्शन पोर्ट के माध्यम से 5 एमएम एंटीमाइसिन ए के 1 माइक्रोन जोड़ें और एक स्थिर संकेत प्राप्त होने तक श्वसन रिकॉर्ड करें। संकेत चित्रा 2 में 2-4 मिनट (मैं) के बाद स्थिर हो जाता है.
    चेतावनी: एंटीमाइसिन ए को संभालते समय सावधान रहें क्योंकि यह एक जहर है जो मनुष्यों के लिए स्वास्थ्य जोखिम पैदा करता है।
  18. ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण में शामिल नहीं एंजाइमों की ऑक्सीजन खपत को बाहर करने के लिए रन का मूल्यांकन करते समय, एंटीमाइसिन ए मानों को अन्य सभी मापा मूल्यों से घटाएं।
  19. टीएमपीडी को कम अवस्था में रखने के लिए 200 एमएम एन, एन, एन', एन'-टेट्रामेथिल-पी-फेनिलीनडायमाइन डाइहाइड्रोक्लोराइड (टीएमपीडी; इलेक्ट्रॉन दाता) और 800 एमएम एस्कॉर्बेट जोड़ें। चैम्बर डाट के इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से substrates इंजेक्षन और रिकॉर्ड श्वसन जब तक एक स्थिर संकेत प्राप्त किया है. संकेत चित्रा 2 में 2-4 मिनट (जे) के बाद स्थिर हो जाता है.
  20. टीएमपीडी ऑटोऑक्सीडेशन के अधीन है, इसलिए कॉम्प्लेक्स IV पर मापा मूल्य से परिणामी ऑक्सीजन खपत घटाएं।
  21. चैम्बर स्टॉपर के इंजेक्शन पोर्ट के माध्यम से NaN3 ≥ 100 मिमी जोड़ें और एक स्थिर संकेत प्राप्त होने तक श्वसन रिकॉर्ड करें। जटिल IV गतिविधि को बाधित करने के लिए सिग्नल 2-4 मिनट के बाद स्थिर हो जाता है, केवल TMPD autooxidation रहता है।
    सावधानी: सोडियम एज़ाइड से निपटने के दौरान सावधान रहें क्योंकि यह एक जहर है जो मनुष्यों के लिए स्वास्थ्य जोखिम पैदा करता है।

Figure 2
चित्रा 2: ओ2 प्रवाह का योजनाबद्ध पाठ्यक्रम। ऑक्सीजन प्रवाह का योजनाबद्ध पाठ्यक्रम दिखाया गया है। वक्र को ए-के से अवरोधकों और सब्सट्रेट के अतिरिक्त के बाद विभिन्न चरणों में विभाजित किया गया है। ए: अंतर्जात श्वसन; बी: पारगम्य कोशिकाएं; सी: uncoupled जटिल मैं श्वसन; डी: युग्मित जटिल मैं श्वसन; ई: ऑक्सफॉस; च: सीआई और सीआईआई की अधिकतम अयुग्मित गतिविधि; जी: जटिल II का अयुग्मित श्वसन; एच: रिसाव श्वसन; मैं: अवशिष्ट श्वसन; जे: सीआईवी (यू) अयुग्मित श्वसन और टीएमपीडी का ऑटोऑक्सीडेशन; k: TMPD का ऑटोऑक्सीडेशन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

8. साइट्रेट सिंथेज़ गतिविधि

  1. साइट्रेट सिंथेज़ गतिविधि को एक अलग पैरामीटर के रूप में मापें और उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑक्सीग्राफ के माप को सामान्य करने के लिए इसका उपयोग करें।
  2. माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माध्यम (MIR05) के 1 एमएल में पृथक पीबीएमसी को फिर से निलंबित करें और 8 x 106 कोशिकाओं/एमएल तक पतला करें।
  3. तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि प्रयोग नहीं किए जाते हैं या ताजा कोशिकाओं को मापने के लिए।
  4. आवश्यक सभी समाधान तैयार करें: 0.1 एम ट्राइथेनॉलमाइन एचसीएल बफर पीएच 8.0, 1.0 एम ट्रिस-एचसीएल बफर पीएच = 8.1, 10% ट्राइटन एक्स -100, 0.1 एम ट्राइथेनॉलमाइन एचसीएल बफर पीएच 8.0 में 10 एमएम ऑक्सालेटेट, 1.01 एम ट्रिस-एचसीएल बफर पीएच = 8.1 में 1.01 एमएम डीटीएनबी, डबल डिस्टिल्ड एच2ओ में एसिटाइल-सीओए 12.2 एमएम।
  5. 5,5'-डिथियो-बीआईएस- (2-नाइट्रोबेज़ोइक एसिड) (डीटीएनबी; 0.1 मिमी), एसिटाइल कोएंजाइम ए (0.31 मिमी), ईडीटीए (50 माइक्रोन), ट्राइथेनॉलमाइन एचसीएल (5 मिमी) और ट्रिस एचसीएल (0.1 एम) युक्त प्रतिक्रिया माध्यम (तालिका 1) तैयार करें।
  6. डबल आसुत एच2ओ में भंग 0.5 मिमी oxaloacetate के साथ शुरू अभिकर्मक (तालिका 1) तैयार करें.
  7. साइट्रेट सिंथेज़ अस्थिर है अगर बहुत जल्दी thawed के रूप में बर्फ पर नमूने पिघलना.
  8. एक multipipette के साथ प्रतिक्रिया माध्यम के 110 माइक्रोन जोड़ने से पहले बर्फ पर एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए नमूनों के 40 माइक्रोन जोड़ें.
  9. गर्म प्रतिक्रिया मध्यम और 5 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के लिए एक इनक्यूबेटर में नमूना. 5 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के लिए पानी के स्नान में गर्म शुरू अभिकर्मक।
  10. प्रत्येक अच्छी तरह से एक multipipette के साथ शुरू अभिकर्मक के 50 माइक्रोन जोड़ें. प्लेट रीडर के माध्यम से 20 मिनट के लिए 412 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर 30 डिग्री सेल्सियस पर अवशोषण को मापें।

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Representative Results

सेल व्यवहार्यता और संख्या
सफल अलगाव और क्रायोप्रिजर्वेशन प्राप्त करने के लिए, सेल काउंट और व्यवहार्यता यथासंभव अधिक होनी चाहिए। क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले और बाद में, कोशिकाओं को गिना जाता है, और कोशिकाओं के स्वास्थ्य और गुणवत्ता को सुनिश्चित करने के लिए उनकी व्यवहार्यता निर्धारित की जाती है। चित्रा 3 क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले और बाद में पीबीएमसी का एक प्रतिनिधि चित्रण है, सेल काउंट और व्यवहार्यता शायद ही भिन्न हो। यह पीबीएमसी के सफल अलगाव और संरक्षण को इंगित करता है।

Figure 3
चित्रा 3: सेल नंबर और व्यवहार्यता पर क्रायोप्रिजर्वेशन का प्रभाव। परीक्षण समूहों को 1 महीने के क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद ताजा पृथक पीबीएमसी और पीबीएमसी के साथ नियंत्रण समूह में विभाजित किया गया है। कोशिकाओं की गिनती और उनकी व्यवहार्यता का निर्धारण एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ किया गया था। व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए ट्रिपैन ब्लू का उपयोग किया गया था। प्रत्येक माप को किया गया था क्योंकि औसत मूल्य के तीन प्रतियों की गणना व्यक्तिगत माप के परिणामों से की गई थी। (क) नए पृथक किए जाने के बाद और 1 माह के क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद पीबीएमसी की सेल व्यवहार्यता का निर्धारण। मान SEM ± माध्य के रूप में दिए गए हैं। महत्व एक युग्मित टी-परीक्षण के साथ निर्धारित किए गए थे। (ख) नए पृथक्करण के बाद और 1 माह क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद पीबीएमसी की सेल संख्या का निर्धारण। मान एसईएम ± साधन के रूप में दिए जाते हैं। महत्व एक युग्मित टी-परीक्षण के साथ निर्धारित किए गए थे। क्रायोप्रिजर्वेशन के एक महीने से पहले और बाद में एक ही आकार और रंग एक ही नमूना दिखाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एटीपी यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए ऊर्जा के प्रमुख स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है। एटीपी एक ल्यूमिनेसेंस परख प्रणाली के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। यदि क्रायोप्रेज़र्वेशन सफल होता है, तो ताजा पृथक कोशिकाओं और क्रायोप्रेज़र्व्ड कोशिकाओं के बीच एटीपी भिन्न नहीं होना चाहिए। चित्रा 4 क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले और बाद में पीबीएमसी का एक प्रतिनिधि चित्रण है; एटीपी-स्तर समान हैं। यह पीबीएमसी के सफल अलगाव और संरक्षण को इंगित करता है।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न क्रायोप्रिजर्वेशन अवधि के एटीपी एकाग्रता की तुलना। पीबीएमसी में एटीपी एकाग्रता (माइक्रोन / परीक्षण समूहों को 1 महीने के क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद ताजा पृथक पीबीएमसी और पीबीएमसी के साथ नियंत्रण समूह में विभाजित किया गया है। नमूने एक ही समय में एकत्र किए गए थे और फिर या तो क्रायो-संग्रहीत या अलगाव के बाद मापा गया था। महत्वपूर्ण अंतरों का परीक्षण करने के लिए एक युग्मित टी-परीक्षण किया गया था; परिणाम से पता चला कि मतभेद महत्वपूर्ण नहीं थे। मान SEM (N = 13) ± माध्य मानों के रूप में दिए गए हैं। क्रायोप्रिजर्वेशन के एक महीने से पहले और बाद में एक ही आकार और रंग एक ही नमूना दिखाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

साइट्रेट सिंथेज़ (सीएस) साइट्रेट-चक्र का एक प्रमुख एंजाइम है, जो माइटोकॉन्ड्रिया में स्थित है। इसलिए, सीएस गतिविधि माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान के लिए एक मजबूत मार्कर का प्रतिनिधित्व करती है। सीएस गतिविधि डीटीएनबी से टीएनबी में रूपांतरण के आधार पर निर्धारित की जाती है। चित्रा 5 से पता चलता है कि क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले और बाद में, सीएस मान पीबीएमसी में भिन्न नहीं होते हैं। फिर, यह पीबीएमसी के एक सफल अलगाव और संरक्षण को इंगित करता है।

Figure 5
चित्रा 5: साइट्रेट सिंथेज़ गतिविधि पर क्रायोप्रेज़र्वेशन का प्रभाव। ताजा मापा नियंत्रण की तुलना में 1 महीने क्रायोप्रेज़र्वेशन के बाद पीबीएमसी में साइट्रेट सिंथेज़ गतिविधि। नमूने एक ही समय में एकत्र किए गए थे और फिर या तो क्रायो-संग्रहीत या अलगाव के बाद मापा गया था। मान को SEM (N = 8) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। महत्व एक युग्मित टी-परीक्षण के साथ निर्धारित किए गए थे। क्रायोप्रिजर्वेशन के एक महीने से पहले और बाद में एक ही आकार और रंग एक ही नमूना दिखाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पीबीएमसी के बायोएनेरजेटिक प्रोफाइल को पोलोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑक्सीग्राफ में। सेलुलर ऑक्सीजन की खपत को जैविक नमूनों में बहुत उच्च रिज़ॉल्यूशन और संवेदनशीलता के साथ एक बंद-कक्ष प्रणाली में मापा जाता है, उदाहरण के लिए, बरकरार और पारगम्य कोशिकाओं, ऊतकों, या पृथक माइटोकॉन्ड्रिया। उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑक्सीग्राफ डिवाइस दो कक्षों से लैस है और ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने और प्रत्येक कक्ष के भीतर ऑक्सीजन की खपत की गणना करने के लिए पोलोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर का उपयोग करता है। ऑक्सीजन की खपत दर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गणना कर रहे हैं और कोशिकाओं24 की संख्या प्रति एस के रूप में picomoles के रूप में व्यक्त किया. प्रत्येक ऑक्सीग्राफ कक्ष के भीतर पोलोरोग्राफिक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड ऑक्सीजन एकाग्रता को मापते हैं और प्रत्येक कक्ष के भीतर ऑक्सीजन की खपत (फ्लक्स) की गणना करते हैं। चैम्बर में ऑक्सीजन की खपत और एकाग्रता वास्तविक समय (चित्रा 6) में प्रदर्शित होती है। विशिष्ट अवरोधकों और सब्सट्रेट के अतिरिक्त के साथ, श्वसन श्रृंखला के व्यक्तिगत परिसरों को उनकी गतिविधि को मापने के लिए लक्षित किया जाता है। परख के बाद, डेटा सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया है. सिंथेज़ गतिविधि को साइट्रेट करने के लिए फ्लक्स मूल्यों को सामान्यीकृत किया गया था। ऑक्सीग्राफी ने आंशिक रूप से ऑक्सीकरण टीएमपीडी के कारण जटिल चतुर्थ के लिए कम मूल्य प्रदान किए। परीक्षणों की एक श्रृंखला में, हमने पाया कि TMPD का उपयोग 1.8 के कारक से विचलित होता है। इस कारक चित्रा 6 में मूल्यों को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

Figure 6
चित्रा 6: ताजा मापा नियंत्रण की तुलना में क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद पीबीएमसीएस में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन। एक ऑक्सीग्राफ में कोशिकाओं की ऑक्सीजन खपत को मापने के लिए 1.6 x 107 कोशिकाओं/एमएल युक्त एक समाधान का उपयोग किया गया था। क्रायोप्रिजर्वेशन के 1 महीने बाद श्वसन को मापा गया था। श्वसन श्रृंखला में परिसरों की गतिविधि की जांच करने के लिए कई अवरोधक, सब्सट्रेट और अनकपलर जोड़े गए थे। एक पदार्थ का जोड़ निम्नानुसार किया गया था: CI (L) = जटिल I का रिसाव श्वसन; CI (P) = जटिल I का युग्मित श्वसन; CI&CII(P) = शारीरिक श्वसन; CI&CII(U) = कॉम्प्लेक्स I और II की अधिकतम गतिविधि प्रदर्शित करने वाला अयुग्मित श्वसन; CII(U) = जटिल II का अयुग्मित श्वसन; CII(L) = जटिल II का रिसाव श्वसन; CIV(U) = अयुग्मित श्वसन। मूल्यों को सामान्य करने के लिए 1.8 के कारक का उपयोग किया गया था। यह कारक वर्तमान सेटअप के लिए प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया गया था। डेटा को SEM (N = 10) ± साधन के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। सांख्यिकीय महत्व छात्र के टी-टेस्ट (* पी < 0.05) के माध्यम से परीक्षण किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अंतर्जात श्वसन कक्षों में सेल निलंबन के 2 एमएल जोड़कर निर्धारित किया जाता है। अंतर्जात सब्सट्रेट के साथ प्रवाह मापा जाता है। परिसरों के बीच अंतर करने के लिए, डिजिटोनिन जोड़ा जाता है। डिजिटोनिन प्लाज्मा झिल्ली को पार करता है जबकि माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली बरकरार रहती है। झिल्ली के माध्यम से प्रोटॉन रिसाव की भरपाई करने के लिए, सब्सट्रेट, ग्लूटामेट और मैलेट जोड़े जाते हैं। इस बिंदु पर श्वसन दर युग्मित श्वसन की अनुपस्थिति में जटिल I-संचालित श्वसन को दर्शाती है। जटिल I ADP की ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (OXPHOS) क्षमता का पता लगाने के लिए, श्वसन अब युग्मित अवस्था में है। CI और CII का युग्मित श्वसन succinate के अतिरिक्त द्वारा प्राप्त किया जाता है। अब श्वसन श्रृंखला अधिकतम क्षमता पर काम करती है। कार्बोनिल साइनाइड p-trifluoromethoxy phenylhydrazone (FCCP) के अनुमापन के साथ, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ETC) अयुग्मित है। इस अनकपलिंग के साथ CI और CII की अधिकतम अनकपल्ड गतिविधि निर्धारित की जाती है। सीआई और सीआईआई के बीच अंतर करने के लिए जटिल I विशिष्ट अवरोधक रोटोनोन जोड़ा जाता है। ऑलिगोमाइसिन के अलावा, सीआईआई का रिसाव श्वसन निर्धारित किया जाता है। ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण में शामिल स्रोतों द्वारा ऑक्सीजन की खपत को बाहर करने के लिए, एंटीबायोटिक एंटीमाइसिन ए जोड़ा जाता है और इस अवशिष्ट ऑक्सीजन खपत को प्रयोग में प्राप्त सभी रीडिंग से घटाया जाता है। इलेक्ट्रॉन दाता एन, एन, एन', एन'-टेट्रामेथिल-पी-फेनिलीनडायमाइन डाइहाइड्रोक्लोराइड (टीएमपीडी; 0.5 मिमी) सीआईवी के लिए एक कृत्रिम सब्सट्रेट है। टीएमपीडी को कम अवस्था में रखने के लिए, एस्कॉर्बेट का उपयोग किया जाता है। एस्कॉर्बेट और टीएमपीडी का उपयोग सीआईवी के अधिकतम अयुग्मित श्वसन को मापने के लिए किया जाता है। चूंकि टीएमपीडी ऑटो-ऑक्सीकरण के अधीन है, एनएएन3 को सीआईवी को बाधित करने के लिए प्रवाह के स्थिरीकरण के बाद जोड़ा जाता है। शेष ऑक्सीजन की खपत कच्चे सीआईवी मूल्यों से घटाई जाती है। चित्रा 2 एक विशिष्ट माप वक्र दिखाता है।

दिखाए गए पैरामीटर तकनीक की सफलता दिखाते हैं। क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद बायोएनेरजेटिक माप करने के लिए तकनीक विकसित की गई थी। दिखाए गए परिणाम माप से पहले और बाद में कोशिकाओं की तुलना करते हैं, क्योंकि कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा जा सकता है, यह माना जा सकता है कि संरक्षण की यह विधि 1 महीने से अधिक भंडारण के लिए उपयुक्त है।

तालिका 1: समाधान, बफ़र्स और उपभोग्य सामग्रियाँ। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल बायोएनेरजेटिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त तरीके से मानव रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को अलग करने और क्रायोप्रेज़र्विंग करने का एक साधन प्रदान करता है। वर्णित विधि पीबीएमसी को धीरे-धीरे और बड़ी मात्रा में अलग करने की संभावना प्रदान करती है, जिसमें उच्च व्यवहार्यता और बायोएनेरजेटिक माप के लिए पर्याप्त कोशिकाएं होती हैं। इसका नुकसान यह है कि न्यूनतम रुकावटों के साथ भी, लंबे अलगाव होते हैं, लेकिन बाद में क्रायोप्रेज़र्वेशन बायोएनेरगेटिक्स के समय-स्वतंत्र माप की अनुमति देता है। इस पद्धति के साथ, नमूने एकत्र किए जा सकते हैं और बाद के समय बिंदुओं पर मापा जा सकता है। यह बहुस्तरीय परीक्षणों में नमूने एकत्र करने और केंद्रीय स्थान पर एक ही समय में मापदंडों को मापने के लिए भी उपयुक्त है।

क्रायोप्रिजर्वेशन कोशिकाओं को लंबे समय तक संग्रहीत करने और बाद में उन्हें मापने की संभावना प्रदान करता है। पीबीएमसी का अलगाव लगभग 2-3 घंटे की समय लेने वाली प्रक्रिया है और केवल एक बार में कुछ ही नमूने लेने की अनुमति देता है। एक प्रयोगकर्ता के लिए गुणवत्ता के नुकसान के बिना एक साथ 2 से अधिक व्यक्तियों से ताजा पीबीएमसी को अलग करना संभव नहीं है। ताजा कोशिकाओं के साथ अनुवर्ती प्रयोगों प्रदर्शन करने की जरूरत प्रक्रिया को जटिल और इस प्रकार अतिरिक्त तनाव और समय की परेशानी के साथ जुड़ा हुआ है. प्रयोगों के प्रदर्शन से अलगाव को अलग करना अध्ययन को सरल बना सकता है और परीक्षणों को अधिक मानकीकृत बना सकता है। विशेष रूप से, रक्त संग्रह, अलगाव, एक नमूना सामूहिक का क्रायोप्रिजर्वेशन, विशिष्ट प्रयोगों के प्रदर्शन के बाद। नमूने विभिन्न स्थानों से और अलग-अलग समय पर एकत्र किए जा सकते हैं और फिर एक ही स्थान पर एक ही समय में मापा जा सकता है।

Bioenergetics सेल चयापचय में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, mitochondrial शिथिलता के लिए अग्रणी परेशान bioenergetics उम्र बढ़ने में और बाद में neurodegeneration और अन्य रोगों25,26 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की संभावना है. ऊपर वर्णित विधियों का उपयोग परिवर्तनों की निगरानी के लिए ताजा पृथक और क्रायोप्रेज़र्ड पीबीएमसी में किया जा सकता है। इन बायोएनेरजेटिक मापों का उपयोग नैदानिक अध्ययन और अनुसंधान के आधार के रूप में किया जा सकता है।

इस तकनीक के कई सीमित कारक हैं और क्रायोप्रेज़र्वेशन के बाद ताजा माप बनाम माप के फायदे और नुकसान को तौला जाना चाहिए। क्रायोप्रिजर्वेशन आम तौर पर पीबीएमसी के लिए बहुत मांग है; इसलिए, तनावों की संख्या को यथासंभव कम रखना महत्वपूर्ण है। समय सार का है क्योंकि कोशिकाओं को डीएमएसओ में जितना संभव हो उतना कम समय बिताना चाहिए जो पीबीएमसी के लिए विषाक्त है, प्रत्येक चरण को डीएमएसओ के साथ कोशिकाओं को पिघलने या ठंड से पहले तैयार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बायोएनेरजेटिक माप के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में भंडारण अप्रभावी साबित हुआ - नमूनों को 24 घंटे के बाद तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। एक नियंत्रित ठंड दर अनिवार्य है यदि शीतलन बहुत तेज है, तो कोशिकाओं में शेष पानी जम जाता है और कोशिका झिल्ली और डिब्बों को नुकसान पहुंचाने वाले क्रिस्टल बनाता है। बहुत धीमी शीतलन दर विषाक्त डीएमएसओ के साथ लंबे समय तक संपर्क की ओर ले जाती है। आइसोप्रोपेनॉल का उपयोग करने वाले सेल फ्रीजर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 1 डिग्री सेल्सियस/मिनट की ठंड दर प्राप्त कर सकते हैं। पीबीएमसी के विगलन और रीफ्रीजिंग से बचा जाना चाहिए।

यह प्रोटोकॉल पीबीएमसी के अलगाव और क्रायोप्रिजर्वेशन का वर्णन करता है। बायोएनेरजेटिक माप के संरक्षण के बाद पीबीएमसी की कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए, बायोएनेरगेटिक्स के अनुकरणीय माप किए गए थे। इस प्रोटोकॉल को बायोएनेरजेटिक कारकों के मापन के लिए अनुकूलित किया गया है। क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद बायोएनेरजेटिक कारकों को निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन यह अन्य प्रोटोकॉल के लिए भी निर्धारित किया जा सकता है कि क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद माप संभव है या नहीं।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम रक्त संग्रह के लिए यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल गिएसेन-मारबर्ग की नैदानिक टीम को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम जस्टस लिबिग विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) Self-prepared -
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer Self-prepared -
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) Self-prepared -
1.01 mM DTBB Self-prepared -
10 % Triton X-100 Self-prepared -
10 mM Oxalacetat Self-prepared -
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly Sarstedt 156353_v
37% HCl Carl Roth GmbH & Co. KG -
70% Ethanol (EtOH) Self-prepared -
Acetyl-CoA Pancreac Applichem A3753
ADP Sigma-Aldrich A5285
Alcohol wipes  (70% isopropyl alcohol)
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Aqua (bidest.) With MilliQ Academic (self-made) -
Ascorbate Sigma-Aldrich A4034
ATP-Standard Sigma-Aldrich 6016949
Biocoll Seperating Solution Biochrom 6115
Biological safty cabinet MSC Advantage Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 1450016
Cryotube Cryo.S Grainer Bio-One 126263-2DG
Digitonin Sigma-Aldrich 37008
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck 102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips Gilson F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) Gibco (Thermo Scientific) 15217168
Ethanol (EtOH 100%) Carl ROTH GmbH & Co. KG 9065.3
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665
Frezer (-80°C) Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate Sigma-Aldrich G1626
Holder/adapter 
Incubator Midi 40 CO2 Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe Hamilton
Malate Sigma-Aldrich M-1000
MIR05 Self-prepared -
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific Inc. 10110051
Multireader CLARIOstar BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxalacetate Sigma-Aldrich -
Oxygraph-2k Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin PAA 15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) Gibco (Thermo Scientific) 11530586
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saccharose Carl ROTH GmbH & Co. KG 9286.2
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Succinate Sigma-Aldrich S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD) Sigma-Aldrich T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane Sigma-Aldrich 108382
Triton X-100 Sigma-Aldrich 108643
Trypanblau Biochrom T6146
Vacuum pump Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96 Perkin Elmer 6005181
Water bath WNB22 Memmert GmbH & Co. KG

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References

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Dieter, F., Grube, J., Birkenhauer, T., Quentin, A., Eckert, G. P. Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (200), e65730, doi:10.3791/65730 (2023).

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