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Immunology and Infection

Cryoconservation et évaluation bioénergétique des cellules mononucléées du sang périphérique humain

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65730
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Center, Institute of Nutritional Sciences, Justus-Liebig-University of Giessen

Summary

Les cellules mononucléées isolées du sang périphérique peuvent être utilisées pour l’analyse des fonctions et des troubles immunitaires, des maladies métaboliques ou des fonctions mitochondriales. Dans ce travail, nous décrivons une méthode standardisée pour la préparation de PBMC à partir de sang total et la cryoconservation ultérieure. La cryoconservation rend ce temps et ce lieu indépendants.

Abstract

Les fonctions physiologiques des cellules eucaryotes reposent sur l’énergie principalement fournie par les mitochondries. Le dysfonctionnement mitochondrial est lié aux maladies métaboliques et au vieillissement. La phosphorylation oxydative joue un rôle décisif, car elle est cruciale pour le maintien de l’homéostasie énergétique. Les PBMC ont été identifiés comme un échantillon peu invasif pour mesurer la fonction mitochondriale et il a été démontré qu’ils reflètent les conditions de la maladie. Cependant, la mesure de la fonction bioénergétique mitochondriale peut être limitée par plusieurs facteurs dans des échantillons humains. Les limites sont la quantité d’échantillons prélevés, le temps d’échantillonnage, qui s’étale souvent sur plusieurs jours, et les emplacements. La cryoconservation des échantillons prélevés peut assurer une collecte et une mesure cohérentes des échantillons. Il faut veiller à ce que les paramètres mesurés soient comparables entre les cellules cryoconservées et les cellules fraîchement préparées. Ici, nous décrivons des méthodes d’isolement et de cryoconservation des PBMC à partir d’échantillons de sang humain afin d’analyser la fonction bioénergétique des mitochondries dans ces cellules. Les PBMC cryoconservés selon le protocole décrit ici ne montrent que des différences mineures dans le nombre et la viabilité des cellules, les niveaux d’adénosine triphosphate et l’activité mesurée de la chaîne respiratoire par rapport aux cellules fraîchement récoltées. Seulement 8 à 24 mL de sang humain sont nécessaires pour les préparations décrites, ce qui permet de prélever des échantillons lors d’études cliniques de manière multicentralisée et de déterminer leur bioénergétique sur place.

Introduction

Les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) sont utilisées pour diverses applications dans de nombreux domaines scientifiques, y compris l’étude de questions immunologiques et bioénergétiques, telles que celles liées aux processus de vieillissement ou aux maladies dégénératives 1,2. Les PBMC ont une composition hétérogène et se composent de lymphocytes (lymphocytes B, lymphocytes T et cellules NK), de monocytes et de cellules dendritiques. Les cellules présentent parfois de grandes différences et variations individuelles au sein d’un sujet, de sorte que des procédures standardisées pour la manipulation de ces cellules sont nécessaires. Des paramètres importants tels que la viabilité et la pureté de l’isolant sont les exigences de base pour sa manipulation et sont en outre influencés par des facteurs environnementaux tels que le moment de la collecte, le niveau de mélatonine, si le sujet est à jeun, etc. 3,4.

Sur la base d’études sur la bioénergétique des PBMCs, nous décrivons ici une méthode d’isolement, de cryoconservation et de culture des PBMCs qui convient également à d’autres méthodes. Alors que la biopsie musculaire est considérée comme l’étalon-or pour le métabolisme énergétique mitochondrial5, l’examen des cellules sanguines est une procédure rapide et peu invasive. En plus de cela, de plus en plus d’études suggèrent que les changements dans la fonction mitochondriale dans le vieillissement et la maladie d’Alzheimer (MA) se produisent non seulement dans le cerveau mais aussi dans la périphérie 6,7,8,9,10. La méthode permet également d’étudier d’autres affections et maladies, notamment le diabète sucré et l’obésité 11,12,13. Les modèles d’expression génique chez les patients atteints de sclérose en plaques peuvent être analysés, ou la fonction immunitaire et les influences sur celle-ci en général 14,15,16.

Les PBMC s’appuient généralement sur la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour générer de l’adénosine triphosphate (ATP)17,18. Par conséquent, les PBMC couvrent un large éventail d’applications en tant que substituts. Dans des rapports précédents, le métabolisme énergétique des PBMC a été utilisé pour traiter des dysfonctionnements d’organes, tels que l’insuffisance cardiaque précoce19, le choc septique20 ou les différences associées au sexe4 dans la fonction mitochondriale. Une méthode généralisée de cryoconservation, d’isolement et de culture des PBMC présenterait des avantages dans la comparabilité des résultats obtenus dans différents instituts. Il y a beaucoup de variations dans les protocoles pour chaque étape21,22, le but de cette méthode est de fournir une ligne directrice pour les mesures bioénergétiques dans les PBMC.

Dans cet article, nous décrivons une méthode de mesure des paramètres bioénergétiques dans les PBMC. Nous expliquons les méthodes d’isolement, de cryoconservation et de mesure de la bioénergétique des PBMC à partir du sang humain. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer les paramètres bioénergétiques chez les patients et les évaluer dans un contexte clinique. Pour appliquer ces mesures, les chercheurs ont besoin d’avoir accès à une population de patients à partir de laquelle des échantillons de sang frais peuvent être obtenus.

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Protocol

Tous les protocoles décrits dans ce manuscrit pour la collecte, l’isolement et l’analyse du sang ont été examinés et approuvés par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Giessen, en Allemagne. Le consentement des patients à inclure leurs échantillons dans l’étude a été obtenu. Toutes les étapes d’isolement et de culture cellulaire sont effectuées sous une enceinte de sécurité biologique.

1. Ponction veineuse

  1. Préparez tout l’équipement nécessaire à la collecte de sang, y compris le vaporisateur de désinfection, l’écouvillon stérile, la canule de prélèvement sanguin avec tube de 80 mm et multi-adaptateur, le garrot / brassard de tensiomètre, la monovette 9 ml de lithium-héparine.
    REMARQUE : L’EDTA en tant qu’anticoagulant est également efficace.
  2. Prélevez du sang dans la veine du bras la plus appropriée, généralement la veine médiane cubiti ou la veine céphalique.
  3. Appliquer un garrot/brassard de tensiomètre avec une légère pression, autour de 80 mm/Hg.
  4. Désinfectez les gants et le site de ponction avec un spray désinfectant contenant de l’alcool. Laissez le site de ponction désinfecté sécher à l’air libre.
  5. Les veines font saillie en raison de la pression du brassard de pression. Insérez l’aiguille (diamètre de la canule (extérieur) 21G / 0,8 mm, longueur 19 mm) à un angle de 15°-20° de la veine en essayant d’éviter le traumatisme et en minimisant le sondage.
  6. Prélever du sang avec le système approprié, 4 tubes contenant 9 mL de sang (plus de 7 à 8 tubes sont difficiles à isoler correctement pour un expérimentateur).
  7. Après le prélèvement sanguin, placez les tubes de prélèvement dans l’obscurité pendant 5 min pour assurer une anticoagulation uniforme.

2. Isolement PBMC

  1. Préparez toutes les solutions nécessaires comme décrit ci-dessous.
  2. Amener la solution saline équilibrée de Dulbecco (DPBS ; concentration 1x) et le milieu d’isolement lymphocytaire (1,077 g/mL) à température ambiante (20-25 °C).
  3. Préparer le sérum de veau fœtal (FBS) à température ambiante et conserver un tube conique stérile de 50 mL avec FBS sur de la glace. Pour chaque échantillon de sang, 2 mL de FBS sont nécessaires.
  4. Conserver le récipient de congélation à 4 °C et prérefroidir les cryotubes à 4 °C.
  5. Milieu de culture cellulaire chaud à 37 °C, le milieu se compose de RPMI 1640 avec 50 mL de FBS et de pénicilline 50 U/mL de streptomycine 50 U/mL. Cette solution peut être conservée à 3 °C jusqu’à 2 mois.
  6. Ajouter 8 mL de DPBS dans des tubes coniques stériles de 50 mL. Ajouter 15 mL de milieu d’isolement lymphocytaire dans un tube conique stérile de 50 mL (le milieu est sensible à la lumière, ajoutez-le avant de commencer l’isolement).
  7. Ajouter 8 mL de sang à 8 mL de DPBS et mélanger soigneusement avec une pipette Pasteur en plastique de 3 mL.
  8. Superposer délicatement le mélange sang/DPBS à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique de 3 ml sur le milieu d’isolement lymphocytaire. Pour appliquer la première couche sur le milieu, inclinez le tube de 20° à 30°, ce qui réduira la pénétration du mélange sang-PBS dans la couche moyenne.
  9. Superposez soigneusement le mélange sang-PBS sur la paroi latérale du tube sur le milieu d’isolement lymphocytaire. Utilisez une vitesse constante pour maintenir le flux sanguin constant.
  10. À l’étape suivante, amenez lentement le tube en position verticale, le sang restant est soigneusement superposé sur la paroi latérale du tube sur la couche de sang.
  11. Centrifuger pendant 10 min à 1000 x g à température ambiante dans une centrifugeuse avec rotor à godets oscillants avec freins désactivés. Après centrifugation, le mélange sang/PBMC est séparé en quatre couches. La couche supérieure est constituée de plasma et de plaquettes, la deuxième couche est la couche PBMC, suivie d’une couche moyenne d’isolement des lymphocytes et, enfin, d’érythrocytes et de granulocytes dans la couche inférieure. Les différentes couches sont illustrées à la figure 1.
  12. Prélever les 2/3 de la couche plasmatique à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique.
  13. À l’aide d’une pipette de 1 mL, prélever les PBMC sur la couche de milieu d’isolement lymphocytaire en prenant soin de ne pas mettre de milieu dans l’échantillon.
  14. Placez la pointe à 1 mm au-dessus de la couche PBMC. La couche PBMC ne doit pas être perforée, sinon le milieu s’écoulera sur les cellules. L’aspiration de la pipette tire les PBMC jusqu’à ce point, de sorte qu’ils peuvent être collectés plusieurs fois à ce stade.
    REMARQUE : Pour maximiser le nombre de PBMC collectés, à la fin de la procédure, recherchez le reste sur la surface et essayez de collecter les cellules là aussi. Pour stabiliser la procédure, le tube peut être placé sur une surface.
  15. Transférez les PBMC étape par étape dans un nouveau tube de 50 ml jusqu’à ce que la couche soit complètement récoltée. Ajouter le DPBS jusqu’à 25 mL, laver le milieu d’isolement lymphocytaire et les autres résidus.
  16. Centrifuger pendant 10 min à 100 x g à température ambiante avec les freins activés. Retirez le surnageant à l’aide d’une pompe à vide ou similaire, veillez à ne pas endommager la pastille de cellule.
  17. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de DPBS et ajouter le DPBS jusqu’à la marque de 25 mL. Répétez le lavage une fois de plus, puis remettez-le en suspension dans un milieu approprié pour les étapes suivantes.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique d’une centrifugation à gradient de densité pour illustrer les différentes couches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Cryoconservation

  1. Refroidir un récipient de congélation à 4 °C, laisser refroidir le FBS sur de la glace.
  2. Remettre en suspension la pastille PBMC dans 1 mL de FBS à l’aide d’une pipette de 1 mL, le FBS doit être à température ambiante.
  3. Mélangez le DMSO avec le FBS pré-refroidi sur de la glace 1 :5, concentration finale 20% de DMSO, puis remettez le mélange FBS : DMSO sur la glace. Préparez toujours la solution fraîche.
  4. Transférez la suspension cellulaire PBMC dans du FBS dans des cryotubes de 2 ml bien étiquetés. Utilisez un cryotube par tube de prélèvement. Ajustez le nombre de cellules entre 1 x 107 et 5 x 107 par mL. Utilisez un compteur de cellules automatisé pour déterminer le nombre de cellules et leur viabilité.
  5. Ajouter 1 mL de mélange FBS : DMSO goutte à goutte avec une pipette de 1 mL, environ 1 à 2 gouttes par s, dans le tube. L’ajout goutte à goutte permet d’obtenir un mélange continu et constant.
  6. Placez les tubes dans le récipient de congélation prérefroidi. Placez le récipient de congélation dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h. Le récipient de congélation assure un refroidissement contrôlé de -1 °C par minute.
  7. Sortez les tubes du congélateur à -80 °C. Après avoir été retirés du congélateur, conservez les tubes en phase gazeuse d’azote liquide. Documentez l’emplacement de chaque échantillon.

4. Décongélation

  1. Préparer toutes les solutions nécessaires : Milieu de culture cellulaire RPMI 1640 avec 50 mL de FBS et pénicilline 50 U/mL, streptomycine 50 U/mL. Cette solution peut être conservée à 3°C jusqu’à 2 mois.
  2. Préchauffer le milieu de culture cellulaire à 37 °C. Ajouter 3 mL de milieu de culture cellulaire préchauffé dans des tubes coniques stériles de 50 mL.
  3. Retirer l’échantillon du réservoir d’azote liquide. Décongeler les échantillons au bain-marie à 37 °C pendant env. 3,5 min, les retirer du bain-marie dès que la dernière glace a fondu. Un morceau de glace de la taille d’une tête d’épingle doit toujours être visible dans le tube.
    REMARQUE : Le DMSO est nocif pour le travail des PBMC aussi rapidement que possible.
  4. Retirez le mélange cellule :FBS :DMSO avec une pipette de 1 ml du cryotube. Mélanger les échantillons PBMC avec le milieu de culture cellulaire dans les tubes de 50 ml préparés. Lavez les tubes avec 5 ml de milieu de culture en trois étapes de 2 ml, 2 ml et 1 ml.
  5. Transférez le milieu dans les tubes. Ceci est effectué pour transférer d’éventuels résidus cellulaires. Centrifuger pendant 10 min à 100 x g à température ambiante.
  6. Jeter le surnageant et ajouter 1 mL de milieu approprié à l’utilisation prévue. Les cellules sont prêtes pour les expériences ultérieures.
    REMARQUE : Cependant, dans le cas de tests fonctionnels sur des cellules fraîches ou congelées, une période de repos dans un incubateur (généralement pendant la nuit) est souvent recommandée après l’isolement des lymphocytes à base de milieu ou la décongélation des cellules.

5. Culture cellulaire

  1. Après isolement ou décongélation des cellules de culture, une nuit à 37 °C dans de l’air à 5 % de CO2/95 %.
  2. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu RPMI complété par 10 % de FBS, péniciline 50 U/mL, streptomycine 50 U/mL. Pour une utilisation ultérieure, il existe de nombreuses possibilités, traiter les cellules au besoin pour les tests.
  3. Pour le stockage général, utilisez des plaques de culture cellulaire stériles à 6 puits et des cellules de récolte après la période de repos. Transférez 1 mL de suspension cellulaire à l’aide d’une pipette de 1 mL dans un puits et ajoutez 4 mL de milieu de culture cellulaire.
    REMARQUE : La quantité de PBMC isolée varie considérablement d’un individu à l’autre, un puits avec 5 mL de milieu de culture cellulaire est suffisant pour chaque 8 mL de sang isolé. Cependant, lors de l’isolement des PBMC des couches leucocytes, la quantité de PBMC est significativement plus élevée que dans les échantillons de sang total et les cellules doivent donc être divisées en plusieurs puits.
  4. Laisser reposer les cellules 24 h dans une atmosphère humidifiée complétée par 5 % de CO2 à 37 °C. Cette incubation est réalisée pour les cellules fraîchement isolées, ainsi que pour les cellules cryoconservées.

6. Test de l’ATP

  1. Remettre en suspension les PBMC décongelés dans 1 mL de milieu RPMI supplémenté en FBS à 10 %, pénicilline 50 U/mL, streptomycine 50 U/mL.
  2. Prélevez un échantillon et déterminez le nombre de cellules, puis effectuez une discrimination vivante-morte avec du bleu de trypan. Prélever 10 μL des cellules remises en suspension et mélanger avec un milieu de culture cellulaire de 90 μL. Ensuite, prenez 10 μL et mélangez avec 10 μL de bleu de trypan. Placez les cellules soit dans une chambre de comptage de cellules, soit dans un compteur automatique de cellules et déterminez le nombre de cellules vivantes/mortes.
  3. Plaquer 100 μL de cellules à une densité de 1 x 105 cellules/100 μL par puits dans une plaque de polystyrène blanc à 96 puits.
  4. Laisser reposer les cellules pendant 24 h dans une atmosphère humidifiée complétée par 5 % de CO2 à 37 °C.
  5. Déterminer les concentrations d’ATP à l’aide d’un test d’ATP.
    1. Utilisez l’émission de lumière qui se produit lorsque l’ATP est combiné avec la luciférine. La lumière émise peut être évaluée à l’aide d’un lecteur de plaques. Retirez les plaques pour que l’incubateur refroidisse à température ambiante pendant 15 minutes. Lysez les cellules et laissez-les pendant 5 min. Appliquez ensuite un réactif de surveillance sur les cellules et mesurez selon les instructions du fabricant. Une norme interne est utilisée pour déterminer le niveau d’ATP.

7. Respirométrie à haute résolution

  1. Allumez l’oxygraphe haute résolution et laissez-le se réchauffer pendant 30 minutes.
  2. Traiter les cellules selon un protocole décrit à la figure 1. Préparez tous les stocks nécessaires comme indiqué dans le tableau 1.
  3. Pipeter 2,1 mL de tampon respiratoire (tableau 1) dans les deux chambres d’oxygraphe à haute résolution et agiter le tampon en continu à l’aide d’une barre d’agitation magnétique présente dans les chambres (750 tr/min) à 37 °C pendant 30 min jusqu’à l’obtention d’un signal de flux d’oxygène stable du capteur d’oxygène polarographique.
    REMARQUE : Dans les chambres de l’oxygraphe, la consommation d’oxygène en temps réel (flux) et la saturation en oxygène de la chambre sont mesurées à l’aide d’électrodes d’oxygène polarographiques. L’étalonnage de l’arrière-plan doit être effectué pour éviter les bruits de fond et garantir des résultats fiables.
  4. Effectuer un étalonnage de l’air du capteur d’oxygène polarographique selon les protocoles du fabricant23.
  5. Remettre en suspension les PBMC isolés dans 1 mL de milieu respiratoire mitochondrial (MIR05, la composition est indiquée dans le tableau 1) et diluer à 8 x 106 cellules/mL.
  6. Après l’étalonnage de l’air, aspirer le milieu respiratoire de la chambre de l’oxygraphe et ajouter 2,1 mL de suspension cellulaire dans chaque cambrure du respiromètre. S’il est nécessaire de réoxygéner les chambres pendant la mesure (voir Ouvrir au point h de la figure 2), la saturation en oxygène des chambres ne doit pas descendre en dessous de 100 μM.
  7. Fermez les chambres en insérant les bouchons, les chambres sont conçues pour contenir un volume de 2,0 mL. Aspirer la suspension cellulaire émergente.
  8. Mélanger en continu la suspension cellulaire à 37 °C avec un agitateur magnétique (750 tr/min) situé dans la chambre. Attendez environ 20 min jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Déterminer la respiration endogène ((a) dans la figure 2).
  9. Pour déterminer les différentes activités complexes de la chaîne respiratoire, injecter les substrats et les inhibiteurs de la respiration mitochondriale à travers les orifices d’injection en titane des bouchons. Utilisez la concentration finale suivante dans la chambre.
  10. Pour perturber les membranes cellulaires, ajouter 5 μL de digitonine de 8,1 mM, à travers l’orifice d’injection en titane du bouchon de la chambre, pour éliminer les substrats naïfs (b) de la figure 2 tandis que les membranes mitochondriales restent intactes.
  11. Ajouter des substrats de 2 M de glutamate et 800 mM de malate à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à ce qu’un signal stable soit obtenu. Le signal se stabilise au bout de 2 à 4 minutes.
    REMARQUE : Il est également possible d’utiliser des substrats supplémentaires comme le pyruvate.
  12. Ajouter 8 μL d’adénosine diphosphate (ADP) de 500 mM à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (d) dans la figure 2.
  13. Ajouter 20 μL de succinate 1 M à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (e) dans la figure 2.
  14. Titrer 1 M de cyanure de carbonyle p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (PCFC) par étapes à raison de 0,5 μL jusqu’au point où il n’y a plus d’augmentation. Attendez 2 à 4 minutes jusqu’à ce que le signal se stabilise (f) dans la Figure 2. Lorsqu’il n’y a plus d’augmentation de la respiration, passez à l’étape suivante.
    ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez le FCCP car il présente des risques pour la santé humaine.
  15. Ajouter 5 μL de roténone à 0,1 mM à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (g) dans la figure 2.
    ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez de la roténone car elle présente des risques pour la santé humaine.
  16. Ajouter 1 μL d’oligomycine à 4 mg/mL par l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (h) dans la figure 2.
    ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez de l’oligomycine car il s’agit d’un poison qui présente des risques pour la santé humaine.
  17. Ajouter 1 μL d’antimycine A à 5 mM par l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (i) dans la figure 2.
    ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez de l’antimycine A car il s’agit d’un poison qui présente des risques pour la santé humaine.
  18. Lors de l’évaluation de l’essai pour exclure la consommation d’oxygène des enzymes non impliquées dans la phosphorylation oxydative, soustraire les valeurs d’antimycine A de toutes les autres valeurs mesurées.
  19. Ajouter 200 mM DE DICHLORHYDRATE DE TÉTRAMÉTHYL-P-PHÉNYLÈNEDIAMINE (TMPD ; donneur d’électrons) et 800 mM d’ascorbate pour maintenir le TMPD dans un état réduit. Injectez les substrats à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrez la respiration jusqu’à ce qu’un signal stable soit obtenu. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (j) dans la figure 2.
  20. Le TMPD est sujet à l’auto-oxydation, il faut donc soustraire la consommation d’oxygène résultante de la valeur mesurée au complexe IV.
  21. AjoutezNaN 3 ≥ 100 mM à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrez la respiration jusqu’à ce qu’un signal stable soit atteint. Le signal se stabilise après 2 à 4 minutes pour inhiber l’activité IV complexe, il ne reste que l’auto-oxydation TMPD.
    ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez de l’azoture de sodium car il s’agit d’un poison qui présente des risques pour la santé humaine.

Figure 2
Figure 2 : Évolution schématique du flux d’O2. Le déroulement schématique du flux d’oxygène est représenté. La courbe est divisée en différentes phases après l’ajout d’inhibiteurs et de substrats de a-k. a : respiration endogène ; b : cellules perméabilisées ; c : respiration complexe I découplée ; d : respiration couplée complexe I ; e : OXPHOS ; f : activité maximale non couplée de l’IC et de l’IC ; g : respiration non couplée du complexe II ; h : respiration par fuite ; i : respiration résiduelle ; j : Respiration découplée CIV(U) et auto-oxydation du TMPD ; k : auto-oxydation du TMPD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

8. Activité de la citrate synthase

  1. Mesurez l’activité de la citrate synthase en tant que paramètre distinct et utilisez-le pour normaliser les mesures de l’oxygraphe à haute résolution.
  2. Remettre en suspension le PBMC isolé dans 1 mL de milieu respiratoire mitochondrial (MIR05) et diluer à 8 x 106 cellules/mL.
  3. Congeler dans de l’azote liquide et conserver à −80 °C jusqu’à ce que des expériences soient menées ou pour mesurer des cellules fraîches.
  4. Préparez toutes les solutions nécessaires : tampon HCl de triéthanolamine de 0,1 M pH 8,0, tampon de tris-HCl de 1,0 M pH = 8,1, Triton X-100 à 10 %, 10 mM d’oxacétate dans un tampon de triéthanolamine HCl à 0,1 M pH 8,0, DTNB de 1,01 mM dans un tampon de Tris-HCl à 1,0 M pH = 8,1, acétyl-CoA 12,2 mM dans H2O distillé en double.
  5. Préparer un milieu réactionnel (tableau 1) contenant du 5,5'-dithio-bis-(acide 2-nitrobézoïque) (DTNB ; 0,1 mM), de l’acétylcoenzyme A (0,31 mM), de l’EDTA (50 μM), de la triéthanolamine HCl (5 mM) et du Tris HCl (0,1 M).
  6. Préparer le réactif de départ (tableau 1) avec 0,5 mM d’oxaloacétate dissous dans du H2O distillé deux fois.
  7. Décongelez les échantillons sur de la glace, car la citrate synthase est instable si elle est décongelée trop rapidement.
  8. Ajouter 40 μL d’échantillons à une plaque de 96 puits sur de la glace avant d’ajouter 110 μL de milieu réactionnel à l’aide d’une multipipette.
  9. Chauffer le milieu de réaction et l’échantillon dans un incubateur à 30 °C pendant 5 min. Réchauffer le réactif de départ au bain-marie à 30 °C pendant 5 min.
  10. Ajouter 50 μL du réactif de départ à l’aide d’une multipipette dans chaque puits. Mesure de l’absorbance à 30 °C à une longueur d’onde de 412 nm pendant 20 min à l’aide d’un lecteur de plaques.

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Representative Results

Viabilité et nombre de cellules
Pour réussir l’isolement et la cryoconservation, le nombre et la viabilité des cellules doivent être aussi élevés que possible. Avant et après la cryoconservation, les cellules sont comptées et leur viabilité est déterminée pour assurer la santé et la qualité des cellules. La figure 3 est une illustration représentative des PBMC avant et après cryoconservation, le nombre de cellules et la viabilité ne diffèrent guère. Cela indique que l’isolement et la préservation des PBMC ont été couronnés de succès.

Figure 3
Figure 3 : Effet de la cryoconservation sur le nombre et la viabilité des cellules. Les groupes de test sont divisés en deux groupes : le groupe témoin avec des PBMC fraîchement isolés et les PBMC après 1 mois de cryoconservation. Le comptage des cellules et la détermination de leur viabilité ont été effectués à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Le bleu de trypan a été utilisé pour déterminer la viabilité. Chaque mesure a été effectuée en trois exemplaires, la valeur moyenne a été calculée à partir des résultats des mesures individuelles. (A) Détermination de la viabilité cellulaire des PBMC après un nouvel isolement et après 1 mois de cryoconservation. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± MEB. Les significations ont été déterminées à l’aide d’un test t apparié. (B) Détermination du nombre de cellules de PBMC après un nouvel isolement et après 1 mois de cryoconservation. Les valeurs sont données sous forme de moyennes ± MEB. Les significations ont été déterminées à l’aide d’un test t apparié. La même forme et la même couleur montrent le même échantillon avant et après un mois de cryoconservation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’ATP représente la principale source d’énergie pour les cellules eucaryotes. L’ATP est déterminé par un système de test de luminescence. Si la cryoconservation est réussie, l’ATP entre les cellules fraîchement isolées et les cellules cryoconservées ne devrait pas différer. La figure 4 est une illustration représentative des PBMC avant et après la cryoconservation ; Les niveaux d’ATP sont similaires. Cela indique que l’isolement et la préservation des PBMC ont été couronnés de succès.

Figure 4
Figure 4 : Comparaison de la concentration en ATP de différentes périodes de cryoconservation. Concentration d’ATP (μM / 100 000 cellules) dans les PBMC. Les groupes de test sont divisés en deux groupes : le groupe témoin avec des PBMC fraîchement isolés et les PBMC après 1 mois de cryoconservation. Les échantillons ont été prélevés en même temps, puis soit cryo-stockés, soit mesurés après isolement. Un test t apparié a été effectué pour tester les différences significatives ; Le résultat a montré que les différences n’étaient pas significatives. Les valeurs sont exprimées sous forme de valeurs moyennes ± MEB (N = 13). La même forme et la même couleur montrent le même échantillon avant et après un mois de cryoconservation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La citrate synthase (CS) est une enzyme clé du cycle du citrate, située dans les mitochondries. Par conséquent, l’activité CS représente un marqueur robuste de la masse mitochondriale. L’activité CS est déterminée sur la base de la conversion de DTNB en TNB. La figure 5 montre qu’avant et après cryoconservation, les valeurs CS ne diffèrent pas dans les PBMC. Encore une fois, cela indique que l’isolement et la préservation des PBMC ont été couronnés de succès.

Figure 5
Figure 5 : Effet de la cryoconservation sur l’activité de la citrate synthase. L’activité de la citrate synthase dans les PBMC après 1 mois de cryoconservation par rapport au témoin fraîchement mesuré. Les échantillons ont été prélevés en même temps, puis soit cryo-stockés, soit mesurés après isolement. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± MEB (N = 8). Les significations ont été déterminées à l’aide d’un test t apparié. La même forme et la même couleur montrent le même échantillon avant et après un mois de cryoconservation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les profils bioénergétiques des PBMC peuvent être déterminés à l’aide de capteurs d’oxygène polarographiques, par exemple dans un oxygraphe à haute résolution. La consommation d’oxygène cellulaire est mesurée dans un système à chambre fermée avec une résolution et une sensibilité très élevées dans des échantillons biologiques, par exemple des cellules, des tissus ou des mitochondries isolées intacts et perméabilisés. L’appareil d’oxygraphe haute résolution est équipé de deux chambres et utilise des capteurs d’oxygène polarographiques pour mesurer la concentration d’oxygène et calculer la consommation d’oxygène dans chaque chambre. Les taux de consommation d’oxygène sont calculés à l’aide d’un logiciel et exprimés en picomoles par s et par nombre de cellules24. À l’intérieur de chaque chambre d’oxygraphe, des électrodes d’oxygène polarographiques mesurent la concentration d’oxygène et calculent la consommation d’oxygène (flux) à l’intérieur de chaque chambre. La consommation et la concentration d’oxygène dans la chambre sont affichées en temps réel (Figure 6). Avec l’ajout d’inhibiteurs et de substrats spécifiques, les différents complexes de la chaîne respiratoire sont ciblés afin de mesurer leur activité. Après le test, les données sont analysées avec le logiciel. Les valeurs de flux ont été normalisées en fonction de l’activité de la citrate synthase. L’oxygraphie a fourni des valeurs plus faibles pour le complexe IV en raison de la TMPD partiellement oxydée. Lors d’une série de tests, nous avons constaté que le TMPD utilisé s’écartait d’un facteur de 1,8. Ce facteur a été utilisé pour normaliser les valeurs de la figure 6.

Figure 6
Figure 6 : Respiration mitochondriale dans les PBMC après cryoconservation par rapport au témoin fraîchement mesuré. Une solution contenant 1,6 x 107 cellules/mL a été utilisée pour mesurer la consommation d’oxygène des cellules dans un oxygraphe. La respiration a été mesurée 1 mois après la cryoconservation. Pour étudier l’activité des complexes dans la chaîne respiratoire, plusieurs inhibiteurs, substrats et découpleurs ont été ajoutés. L’ajout d’une substance s’est fait de la manière suivante : CI(L) = respiration par fuite du complexe I ; IC(P) = respiration couplée du complexe I ; CI&CII(P) = respiration physiologique ; CI&CII(U) = respiration non couplée présentant l’activité maximale des complexes I et II ; CII(U) = respiration non couplée du complexe II ; CII(L) = respiration par fuite du complexe II ; CIV(U) = respiration non couplée. Un facteur de 1,8 a été utilisé pour normaliser les valeurs. Ce facteur a été déterminé expérimentalement pour la présente configuration. Les données sont affichées sous forme de moyennes ± MEB (N = 10). La signification statistique a été testée à l’aide du test t de Student (*p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La respiration endogène est déterminée par l’ajout de 2 mL de suspension cellulaire dans les chambres. Le flux avec des substrats endogènes est mesuré. Pour mieux distinguer les complexes, la digitonine est ajoutée. La digitonine perméabilise la membrane plasmique tandis que les membranes mitochondriales restent intactes. Pour compenser la fuite de protons à travers la membrane, des substrats de glutamate et de malate sont ajoutés. Les fréquences respiratoires à ce stade illustrent une respiration complexe pilotée par l’I en l’absence de respiration couplée. Pour détecter la capacité de phosphorylation oxydative (OXPHOS) du complexe I ADP est ajouté, la respiration est maintenant dans un état couplé. La respiration couplée de l’IC et de l’IC est obtenue par l’ajout de succinate. Maintenant, la chaîne respiratoire fonctionne au maximum de sa capacité. Avec le titrage du cyanure de carbonyle p-trifluorométhoxy phénylhydrazone (FCCP), la chaîne de transport d’électrons (ETC) est découplée. Avec ce découplage, l’activité découplée maximale de l’IC et de l’IC est déterminée. Pour différencier l’IC de l’IC, on ajoute la roténone, un inhibiteur spécifique du complexe I. Par l’ajout d’oligomycine, la respiration de fuite de CII est déterminée. Pour exclure la consommation d’oxygène par des sources non impliquées dans la phosphorylation oxydative, l’antibiotique antimycine A est ajouté et cette consommation résiduelle d’oxygène est soustraite de toutes les lectures obtenues dans l’expérience. Le dichlorhydrate de N,N,N',N'-tétraméthyl-p-phénylènediamine (TMPD ; 0,5 mM) est un substrat artificiel pour le CIV. Pour maintenir le TMPD dans un état réduit, l’ascorbate est utilisé. L’ascorbate et le TMPD sont utilisés pour mesurer la respiration maximale non couplée de la CIV. Étant donné que le TMPD est sujet à l’auto-oxydation, le NaN3 est ajouté après stabilisation du flux pour inhiber la CIV. La consommation d’oxygène restante est soustraite des valeurs brutes de CIV. La figure 2 montre une courbe de mesure typique.

Les paramètres indiqués montrent le succès de la technique. La technique a été développée pour effectuer des mesures bioénergétiques après cryoconservation. Les résultats présentés comparent les cellules avant et après la mesure, comme aucune différence statistiquement significative ne peut être observée, on peut supposer que cette méthode de conservation convient à un stockage de plus de 1 mois.

Tableau 1 : Solutions, tampons et consommables. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Ce protocole permet d’isoler et de cryoconserver les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) du sang humain d’une manière adaptée aux analyses bioénergétiques. La méthode décrite offre la possibilité d’isoler les PBMC en douceur et en grande quantité, avec une viabilité élevée et suffisamment de cellules pour les mesures bioénergétiques. Il présente l’inconvénient que, même avec un minimum d’interruptions, de longs isolements se produisent, mais la cryoconservation ultérieure permet une mesure de la bioénergétique indépendante du temps. Avec cette méthode, les échantillons peuvent être prélevés et mesurés à des moments ultérieurs. Il est également adapté pour collecter des échantillons dans des essais multicentriques et mesurer les paramètres en même temps dans un emplacement central.

La cryoconservation offre la possibilité de stocker des cellules pendant une longue période et de les mesurer par la suite. L’isolement des PBMC est un processus qui prend du temps et qui prend environ 2 à 3 heures et ne permet de prélever qu’un petit nombre d’échantillons à la fois. Il n’est pas possible pour un seul expérimentateur d’isoler des PBMC frais de plus de 2 individus simultanément sans perte de qualité. La nécessité d’effectuer des expériences de suivi avec des cellules fraîches complique la procédure et est donc associée à un stress supplémentaire et à des problèmes de temps. Séparer l’isolement de la performance des expériences peut simplifier les études et rendre les tests plus standardisés. Plus précisément, la collecte de sang, l’isolement, la cryoconservation d’un échantillon collectif, suivie de la réalisation d’expériences spécifiques. Les échantillons peuvent être prélevés à différents endroits et à différents moments, puis mesurés en même temps au même endroit.

La bioénergétique joue un rôle essentiel dans le métabolisme cellulaire, la bioénergétique perturbée conduisant à un dysfonctionnement mitochondrial est susceptible de jouer un rôle important dans le vieillissement et par la suite dans la neurodégénérescence et d’autres maladies25,26. Les méthodes décrites ci-dessus peuvent être utilisées dans les PBMC fraîchement isolés et cryoconservés pour surveiller les changements. Ces mesures bioénergétiques peuvent servir de base à des études cliniques et à des recherches.

Il existe plusieurs facteurs limitants à cette technique et les avantages et les inconvénients d’une mesure fraîche par rapport à une mesure après cryoconservation doivent être pesés. La cryoconservation est généralement très exigeante pour les PBMC ; Par conséquent, il est important de maintenir le nombre de facteurs de stress aussi bas que possible. Le temps presse, car les cellules doivent passer le moins de temps possible dans le DMSO qui est toxique pour les PBMC, chaque étape doit être préparée avant la décongélation ou la congélation des cellules avec du DMSO. De même, pour les mesures bioénergétiques, le stockage dans un congélateur à -80 °C s’est avéré inefficace - les échantillons doivent être transférés à l’azote liquide après 24 h. Une vitesse de congélation contrôlée est obligatoire si le refroidissement est trop rapide, l’eau restant dans les cellules gèle et forme des cristaux endommageant les membranes et les compartiments cellulaires. Une vitesse de refroidissement trop lente entraîne un contact prolongé avec le DMSO toxique. Les congélateurs cellulaires utilisant de l’isopropanol peuvent atteindre un taux de congélation de 1 °C/min dans un congélateur à -80 °C. La décongélation et la recongélation des PBMC doivent être évitées.

Ce protocole décrit l’isolement et la cryoconservation des PBMC. Afin de confirmer la fonctionnalité des PBMC après conservation pour les mesures bioénergétiques, des mesures exemplaires de la bioénergétique ont été réalisées. Ce protocole a été optimisé pour la mesure des facteurs bioénergétiques. Les facteurs bioénergétiques peuvent être déterminés après cryoconservation, mais il est également possible de déterminer pour d’autres protocoles si des mesures sont possibles après cryoconservation.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier l’équipe clinique de l’hôpital universitaire de Giessen-Marburg pour la collecte de sang. Ces travaux ont été financés par l’université Justus Liebig.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) Self-prepared -
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer Self-prepared -
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) Self-prepared -
1.01 mM DTBB Self-prepared -
10 % Triton X-100 Self-prepared -
10 mM Oxalacetat Self-prepared -
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly Sarstedt 156353_v
37% HCl Carl Roth GmbH & Co. KG -
70% Ethanol (EtOH) Self-prepared -
Acetyl-CoA Pancreac Applichem A3753
ADP Sigma-Aldrich A5285
Alcohol wipes  (70% isopropyl alcohol)
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Aqua (bidest.) With MilliQ Academic (self-made) -
Ascorbate Sigma-Aldrich A4034
ATP-Standard Sigma-Aldrich 6016949
Biocoll Seperating Solution Biochrom 6115
Biological safty cabinet MSC Advantage Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 1450016
Cryotube Cryo.S Grainer Bio-One 126263-2DG
Digitonin Sigma-Aldrich 37008
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck 102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips Gilson F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) Gibco (Thermo Scientific) 15217168
Ethanol (EtOH 100%) Carl ROTH GmbH & Co. KG 9065.3
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665
Frezer (-80°C) Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate Sigma-Aldrich G1626
Holder/adapter 
Incubator Midi 40 CO2 Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe Hamilton
Malate Sigma-Aldrich M-1000
MIR05 Self-prepared -
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific Inc. 10110051
Multireader CLARIOstar BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxalacetate Sigma-Aldrich -
Oxygraph-2k Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin PAA 15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) Gibco (Thermo Scientific) 11530586
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saccharose Carl ROTH GmbH & Co. KG 9286.2
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Succinate Sigma-Aldrich S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD) Sigma-Aldrich T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane Sigma-Aldrich 108382
Triton X-100 Sigma-Aldrich 108643
Trypanblau Biochrom T6146
Vacuum pump Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96 Perkin Elmer 6005181
Water bath WNB22 Memmert GmbH & Co. KG

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References

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Dieter, F., Grube, J., Birkenhauer, T., Quentin, A., Eckert, G. P. Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (200), e65730, doi:10.3791/65730 (2023).

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