Summary
Isolerade mononukleära celler i perifert blod kan användas för analys av immunfunktioner och störningar, metabola sjukdomar eller mitokondriella funktioner. I detta arbete beskriver vi en standardiserad metod för beredning av PBMC från helblod och efterföljande kryokonservering. Kryokonservering gör denna tid och plats oberoende.
Abstract
De eukaryota cellernas fysiologiska funktioner är beroende av energi som huvudsakligen tillhandahålls av mitokondrier. Mitokondriell dysfunktion är kopplad till metabola sjukdomar och åldrande. Oxidativ fosforylering spelar en avgörande roll, eftersom den är avgörande för upprätthållandet av energisk homeostas. PBMC har identifierats som ett minimalt invasivt prov för att mäta mitokondriell funktion och har visat sig återspegla sjukdomstillstånd. Mätning av mitokondriell bioenergetisk funktion kan dock begränsas av flera faktorer i humana prover. Begränsningar är antalet prover som tas, provtagningstiden, som ofta är utspridd över flera dagar, och platser. Kryokonservering av de insamlade proverna kan säkerställa konsekvent insamling och mätning av prover. Försiktighet bör iakttas för att säkerställa att de uppmätta parametrarna är jämförbara mellan kryokonserverade och nypreparerade celler. Här beskriver vi metoder för att isolera och kryokonservera PBMC från humana blodprover för att analysera mitokondriernas bioenergetiska funktion i dessa celler. PBMC kryokonserverad enligt det protokoll som beskrivs här visar endast mindre skillnader i cellantal och viabilitet, adenosintrifosfatnivåer och uppmätt andningskedjeaktivitet jämfört med nyskördade celler. Endast 8-24 ml humant blod behövs för de beskrivna preparaten, vilket gör det möjligt att samla in prover under kliniska studier multicentralt och bestämma deras bioenergetik på plats.
Introduction
Humana mononukleära celler i perifert blod (PBMC) används för olika tillämpningar inom många vetenskapliga områden, inklusive studier av immunologiska och bioenergetiska frågor, såsom de som är relaterade till åldrandeprocesser eller degenerativa sjukdomar 1,2. PBMC är heterogen i sammansättning och består av lymfocyter (B-celler, T-celler och NK-celler), monocyter och dendritiska celler. Cellerna uppvisar ibland stora individuella skillnader och variationer inom ett ämne, så standardiserade rutiner för att hantera dessa celler krävs. Viktiga parametrar som isoleringens livskraft och renhet är de grundläggande kraven för dess hantering och påverkas dessutom av miljöfaktorer som tidpunkten för insamlingen, melatoninnivån, om försökspersonen fastar och andra 3,4.
Baserat på studier av bioenergetik hos PBMC beskriver vi här en metod för isolering, kryokonservering och odling av PBMC som är lämplig även för andra metoder. Medan muskelbiopsi anses vara guldstandarden för mitokondriell energimetabolism5, är undersökningen av blodkroppar en snabb, minimalt invasiv procedur. Utöver detta tyder fler och fler studier på att förändringarna i mitokondriell funktion vid åldrande och Alzheimers sjukdom (AD) inte bara sker i hjärnan utan även i periferin 6,7,8,9,10. Metoden gör det också möjligt att undersöka andra tillstånd och sjukdomar, bland annat diabetes mellitus och fetma 11,12,13. Genuttrycksmönster hos patienter med multipel skleros kan analyseras, eller immunfunktionen och påverkan på den i allmänhet 14,15,16.
PBMC förlitar sig i allmänhet på oxidativ fosforylering (OXPHOS) för att generera adenosintrifosfat (ATP)17,18. Därför täcker PBMC:er ett brett spektrum av applikationer som surrogatmammor. I tidigare rapporter har energimetabolismen hos PBMC använts för att ta itu med organdysfunktioner, såsom vid tidig hjärtsvikt19, septisk chock20 eller könsrelaterade skillnader4 i mitokondriell funktion. En generaliserad metod för kryokonservering, isolering och odling av PBMC skulle ha fördelar i jämförbarheten av resultat som erhållits vid olika institut. Det finns en stor variation i protokollen för varje steg21,22, målet med denna metod är att ge en riktlinje för bioenergetiska mätningar i PBMC.
I den här artikeln beskriver vi en metod för att mäta bioenergetiska parametrar i PBMC. Vi förklarar metoderna för att isolera, kryokonservera och mäta bioenergetik hos PBMC från humant blod. Denna metod kan användas för att bestämma bioenergetiska parametrar hos patienter och utvärdera dem i ett kliniskt sammanhang. För att kunna tillämpa dessa mätningar behöver forskarna tillgång till en patientpopulation från vilken färska blodprover kan erhållas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll som beskrivs i detta manuskript för blodinsamling, isolering och analys har granskats och godkänts av Institutional Review Board vid University of Giessen, Tyskland. Patienternas samtycke till att inkludera deras prover i studien erhölls. Alla steg för isolering och cellodling utförs under ett biologiskt säkerhetsskåp.
1. Punktion
- Förbered all utrustning som behövs för bloduppsamling inklusive desinfektionsspray, steril pinne, bloduppsamlingskanyl med 80 mm slang och multiadapter, tourniquet/blodtrycksmanschett, Monovette 9 ml litium-heparin.
OBS: EDTA som antikoagulantia är också effektivt. - Samla blod från den lämpligaste ven i armen, vanligtvis vena mediana cubiti eller vena cephalica.
- Applicera en tourniquet/blodtrycksmanschett med lätt tryck, cirka 80 mm/Hg.
- Desinficera handskar och stickstället med desinfektionsspray som innehåller alkohol. Låt det desinficerade punkteringsstället lufttorka.
- Venerna sticker ut på grund av trycket från tryckmanschetten. Sätt in nålen (kanyldiameter (yttre) 21G / 0,8 mm, längd 19 mm) i en 15°-20° vinkel på venen för att försöka undvika trauma och minimera sonderingen.
- Ta blod med lämpligt system, 4 rör som innehåller 9 ml blod (mer än 7-8 rör är problematiska för en försöksledare att isolera ordentligt).
- Efter bloduppsamlingen, placera uppsamlingsrören i mörker i 5 minuter för att säkerställa enhetlig antikoagulering.
2. PBMC-isolering
- Förbered alla nödvändiga lösningar enligt beskrivningen nedan.
- Värm Dulbeccos balanserade saltlösning (DPBS; koncentration 1x) och lymfocytisoleringsmedium (1,077 g/ml) till rumstemperatur (20-25 °C).
- Förbered fetalt bovint serum (FBS) i rumstemperatur och förvara ett sterilt 50 ml koniskt rör med FBS på is. För varje blodprov krävs 2 ml FBS.
- Förvara frysbehållaren vid 4 °C och förkyl kryorören vid 4 °C.
- Varmt cellodlingsmedium till 37 °C, mediet består av RPMI 1640 med 50 ml FBS och penicillin 50 E/ml streptomycin 50 E/ml. Denna lösning kan förvaras vid 3 °C i upp till 2 månader.
- Tillsätt 8 ml DPBS i sterila 50 ml koniska rör. Tillsätt 15 ml lymfocytisoleringsmedium i sterilt 50 ml koniskt rör (mediet är ljuskänsligt, tillsätt det innan isoleringen påbörjas).
- Tillsätt 8 ml blod till 8 ml DPBS och blanda försiktigt ytterligare med en 3 ml Pasteurpipett av plast.
- Skikta blod/DPBS-blandningen försiktigt med en 3 ml Pasteur-plastpipett ovanpå lymfocytisoleringsmediet. För att applicera det första lagret på mediet, luta röret 20°-30°, vilket kommer att resultera i mindre penetration av blod-PBS-blandningen i mediumskiktet.
- Lägg blod-PBS-blandningen försiktigt över rörets sidovägg på lymfocytisoleringsmediet. Använd en jämn hastighet för att hålla blodflödet konstant.
- I nästa steg, för långsamt röret till upprätt läge, det återstående blodet skiktas försiktigt över rörets sidovägg på blodskiktet.
- Centrifugera i 10 minuter vid 1000 x g vid rumstemperatur i en centrifug med svängskopa med bromsarna avstängda. Efter centrifugeringen separeras blod/PBMC-blandningen i fyra lager. Det översta lagret består av plasma och blodplättar, det andra lagret är PBMC-skiktet, följt av ett lymfocytisoleringsmediumskikt, och slutligen erytrocyter och granulocyter i det nedre lagret. De olika lagren visas i figur 1.
- Ta bort 2/3av plasmaskiktet med en Pasteurpipett av plast.
- Använd en 1 ml pipett och samla upp PBMC på lymfocytisoleringsmedieskiktet och var noga med att inte få något medium i sample.
- Placera spetsen 1 mm ovanför PBMC-skiktet. PBMC-skiktet bör inte punkteras, annars kommer mediet att flöda över cellerna. Pipettens sug drar PBMC:erna till denna punkt så att de kan samlas in flera gånger vid denna tidpunkt.
OBS: För att maximera antalet PBMC:er som samlas in, sök efter resten på ytan i slutet av proceduren och försök att samla cellerna där också. För att stabilisera proceduren kan röret placeras på en yta. - Överför PBMC:erna steg för steg till ett nytt 50 ml rör tills lagret är helt skördat. Tillsätt DPBS upp till 25 ml-märket, tvätta bort lymfocytisoleringsmedium och andra rester.
- Centrifugera i 10 minuter vid 100 x g i rumstemperatur med bromsarna på. Ta bort supernatanten med en vakuumpump eller liknande, var noga med att inte skada cellpelleten.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml DPBS och lägg till DPBS till 25 ml-märket. Upprepa tvättningen en gång till och blanda sedan upp den på nytt i ett medium som är lämpligt för nästa steg.
Figur 1: Schematisk representation av en densitetsgradientcentrifugering för att illustrera de olika lagren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Kryokonservering
- Kyl ner frysbehållaren till 4 °C, kyl FBS på is.
- Återsuspendera PBMC-pellets i 1 ml FBS med en 1 ml pipett, FBS ska ha rumstemperatur.
- Blanda DMSO med förkyld FBS på is 1:5, slutlig koncentration 20 % DMSO och lägg sedan tillbaka FBS: DMSO-blandningen på is. Förbered alltid lösningen färsk.
- Överför PBMC-cellsuspensionen i FBS till väl märkta 2 ml kryorör. Använd ett kryorör per uppsamlingsrör. Justera antalet celler mellan 1 x 107 och 5 x 107 per ml. Använd en automatiserad cellräknare för att bestämma cellantal och livskraft.
- Tillsätt 1 ml FBS: DMSO-blandning droppvis med en 1 ml pipett, cirka 1-2 droppar per s, i röret. Den droppvisa tillsatsen leder till kontinuerlig och konsekvent blandning.
- Placera rören i den förkylda frysbehållaren. Placera frysbehållaren i en frys på -80 °C i 24 timmar. Frysbehållaren ger en kontrollerad kylning på -1 °C per minut.
- Ta ut rören ur frysen med -80 °C. När rören har tagits ut ur frysen förvaras de i gasfas av flytande kväve. Dokumentera platsen för varje prov.
4. Upptining
- Förbered alla nödvändiga lösningar: Cellodlingsmedium RPMI 1640 med 50 ml FBS och penicillin 50 E/ml, streptomycin 50 E/ml. Denna lösning kan förvaras vid 3°C i upp till 2 månader.
- Förvärm cellodlingsmediet till 37 °C. Tillsätt 3 ml förvärmt cellodlingsmedium i sterila 50 ml koniska rör.
- Ta bort sample från tanken med flytande kväve. Tina proverna i ett vattenbad vid 37 °C i ca 3,5 min, ta upp dem ur vattenbadet så snart den sista isen har smält. En isbit stor som ett knappnålshuvud ska fortfarande vara synlig i röret.
OBS: DMSO är skadligt för PBMC:s arbete så snabbt som möjligt. - Ta bort cell:FBS:DMSO-blandningen med en 1 ml pipett från kryoröret. Blanda PBMC-proverna med cellodlingsmediet i de förberedda 50 ml-rören. Tvätta ur tuberna med 5 ml odlingsmedium i tre steg om 2 ml, 2 ml och 1 ml.
- Överför mediet till rören. Detta utförs för att överföra eventuella cellrester. Centrifugera i 10 minuter vid 100 x g vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och tillsätt 1 ml medium som är lämpligt för planerad användning. Cellerna är redo för efterföljande experiment.
OBS: Vid funktionstester på färska eller frysta celler rekommenderas dock ofta en viloperiod i en inkubator (vanligtvis över natten) efter lymfocytisolering, mediebaserad isolering eller upptining av celler.
5. Cellodling
- Efter isolering eller upptining odlar cellerna över natten vid 37 °C i 5 % CO2/95 % luft.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml RPMI-medium kompletterat med 10 % FBS, penicilin 50 E/ml, streptomycin 50 E/ml. För vidare användning finns det många möjligheter, behandla celler efter behov för analyserna.
- För allmän förvaring, använd sterila 6-brunns cellodlingsplattor och skörda celler efter viloperiod. Överför 1 ml cellsuspension med en 1 ml pipett till en brunn och tillsätt 4 ml cellodlingsmedium.
OBS: Mängden isolerade PBMC varierar mycket mellan individer, en brunn med 5 ml cellodlingsmedium räcker för varje 8 ml blod som isoleras. Vid isolering av PBMC från buffy coat är dock mängden PBMC betydligt högre än i helblodsprover och cellerna bör därför delas upp i flera brunnar. - Låt cellerna vila 24 timmar i en fuktad atmosfär kompletterad med 5 % CO2 vid 37 °C. Denna inkubation utförs för nyligen isolerade celler, såväl som för kryokonserverade celler.
6. ATP-analys
- Återsuspendera tinade PBMC i 1 ml RPMI-medium kompletterat med 10 % FBS, penicillin 50 E/ml, streptomycin 50 E/ml.
- Ta ett prov och bestäm cellantalet och utför sedan en levande-död diskriminering med trypanblått. Ta 10 μl från de återsuspenderade cellerna och blanda med 90 μL cellodlingsmedium. Ta sedan 10 μL och blanda med 10 μL trypan blue. Placera cellerna antingen i en cellräkningskammare eller en automatisk cellräknare och bestäm antalet levande/döda celler.
- Platta 100 μL celler med en densitet av 1 x 105 celler/100 μL per brunn i en vit polystyrenplatta med 96 brunnar.
- Låt cellerna vila i 24 timmar i en fuktad atmosfär kompletterad med 5 %CO 2 vid 37 °C.
- Bestäm ATP-koncentrationerna med en ATP-analys.
- Använd ljusemission som uppstår när ATP kombineras med luciferin. Det emitterade ljuset kan utvärderas med en plattläsare. Ta bort plattorna för inkubatorn för att svalna till rumstemperatur i 15 min. Lyse cellerna och låt dem stå i 5 min. Applicera sedan övervakningsreagens på cellerna och mät enligt tillverkarens instruktioner. En intern standard används för att bestämma ATP-nivån.
7. Högupplöst respirometri
- Slå PÅ den högupplösta oxygrafen och låt den värmas upp i 30 minuter.
- Behandla cellerna enligt ett protokoll som beskrivs i figur 1. Förbered alla lager som behövs enligt tabell 1.
- Pipettera 2,1 ml andningsbuffert (tabell 1) i båda de högupplösta oxygrafkamrarna och rör om bufferten kontinuerligt med hjälp av en magnetisk omrörningsstav som finns i kamrarna (750 varv/min) vid 37 °C i 30 minuter tills en stabil syreflödessignal från den polarografiska syresensorn erhålls.
OBS: I oxigrafens kammare mäts syreförbrukningen i realtid (flöde) och syremättnaden i kammaren med hjälp av polarografiska syreelektroder. Bakgrundskalibrering måste utföras för att undvika bakgrundsbrus och för att säkerställa tillförlitliga resultat. - Utför en luftkalibrering av den polarografiska syresensorn enligt tillverkarens protokoll23.
- Återsuspendera isolerade PBMC i 1 ml mitokondriellt andningsmedium (MIR05, sammansättningen visas i tabell 1) och späd till 8 x 106 celler/ml.
- Efter luftkalibrering aspirerar du andningsmediet från oxigrafkammaren och tillsätter 2,1 ml cellsuspension i varje camber på respirometern. Om det behövs under mätningen syresätts kamrarna på nytt (se Öppna vid punkt h i figur 2), och syremättnaden i kamrarna bör inte sjunka under 100 μM.
- Stäng kamrarna genom att sätta in propparna, kamrarna är utformade för att hålla 2.0 ml volym. Aspirera den framväxande cellsuspensionen.
- Blanda cellsuspensionen kontinuerligt vid 37 °C med en magnetomrörare (750 varv per minut) i kammaren. Vänta i cirka 20 minuter tills en stabil signal erhålls. Bestäm endogen andning ((a) i figur 2).
- För att bestämma de olika komplexa aktiviteterna i andningskedjan, injicera substrat och hämmare för mitokondriell andning genom titaninjektionsportarna på propparna. Använd följande slutliga koncentration i kammaren.
- För att störa cellmembranen, tillsätt 5 μL 8,1 mM digitonin genom titaninjektionsporten på kammarproppen, för att avlägsna naiva substrat (b) i figur 2 medan mitokondriemembranen förblir intakta.
- Tillsätt substrat 2 M glutamat och 800 mM malat genom injektionsporten på kammarproppen och registrera andningen tills en stabil signal uppnås. Signalen stabiliseras efter 2-4 min.
OBS: Det är också möjligt att använda ytterligare substrat som pyruvat. - Tillsätt 8 μl 500 mM adenosindifosfat (ADP) genom injektionsporten på kammarproppen och registrera andningen tills en stabil signal uppnås. Signalen stabiliseras efter 2-4 minuter (d) i figur 2.
- Tillsätt 20 μl 1 M succinat genom injektionsporten på kammarproppen och registrera andningen tills en stabil signal uppnås. Signalen stabiliseras efter 2-4 minuter (e) i figur 2.
- Titrera 1 M karbonylcyanid p-trifluormetoxifenylhydrazon (FCCP) stegvis vid 0,5 μl tills ingen ytterligare ökning sker. Vänta 2-4 minuter tills signalen stabiliseras (f) i figur 2. När det inte finns någon ytterligare ökning av andningen, fortsätt med nästa steg.
VARNING: Var försiktig när du hanterar FCCP eftersom det har hälsorisker för människor. - Tillsätt 5 μl 0,1 mM rotenon genom injektionsporten på kammarproppen och registrera andningen tills en stabil signal uppnås. Signalen stabiliseras efter 2-4 minuter (g) i figur 2.
VARNING: Var försiktig när du hanterar rotenon eftersom det har hälsorisker för människor. - Tillsätt 1 μl 4 mg/ml oligomycin genom injektionsporten på kammarproppen och registrera andningen tills en stabil signal uppnås. Signalen stabiliseras efter 2-4 min (h) i figur 2.
VARNING: Var försiktig när du hanterar oligomycin eftersom det är ett gift som utgör hälsorisker för människor. - Tillsätt 1 μl 5 mM antimycin A genom injektionsporten på kammarproppen och registrera andningen tills en stabil signal uppnås. Signalen stabiliseras efter 2-4 minuter (i) i figur 2.
VARNING: Var försiktig när du hanterar antimycin A eftersom det är ett gift som utgör hälsorisker för människor. - Vid utvärdering av körningen för att utesluta syreförbrukningen hos enzymer som inte är involverade i oxidativ fosforylering, subtrahera antimycin A-värdena från alla andra uppmätta värden.
- Tillsätt 200 mM N,N,N',N'-tetrametyl-p-fenylendiamindihydroklorid (TMPD; elektrondonator) och 800 mM askorbat för att hålla TMPD i reducerat tillstånd. Injicera substraten genom injektionsporten på kammarproppen och registrera andningen tills en stabil signal uppnås. Signalen stabiliseras efter 2-4 minuter (j) i figur 2.
- TMPD är föremål för autooxidation, så subtrahera den resulterande syreförbrukningen från det uppmätta värdet vid komplex IV.
- Tillsätt NaN3 ≥ 100 mM genom injektionsporten på kammarproppen och registrera andningen tills en stabil signal uppnås. Signalen stabiliseras efter 2-4 minuter för att hämma komplex IV-aktivitet, endast TMPD-autooxidation återstår.
VARNING: Var försiktig när du hanterar natriumazid eftersom det är ett gift som utgör hälsorisker för människor.
Figur 2: Schematisk kurs för O 2-flödet. Det schematiska förloppet för syreflödet visas. Kurvan är uppdelad i de olika faserna efter tillsats av inhibitorer och substrat från a-k. a: endogen andning; b: permeabiliserade celler; c: okopplad komplex I-andning; d: kopplad komplex I-andning; e: OXPHOS ; f: maximal okopplad aktivitet av CI och CII. g: okopplad andning av komplex II; h: läckageandning; i: kvarvarande andning; j: CIV(U) okopplad respiration och autooxidation av TMPD; k: autooxidation av TMPD. Klicka här för att se en större version av denna figur.
8. Citratsyntas aktivitet
- Mät citratsyntasaktivitet som en separat parameter och använd den för att normalisera mätningarna av den högupplösta oxigrafen.
- Återsuspendera isolerat PBMC i 1 ml mitokondriellt andningsmedium (MIR05) och späd till 8 x 106 celler/ml.
- Frys in i flytande kväve och förvara vid −80 °C tills experiment utförs eller för att mäta färska celler.
- Bered alla lösningar som behövs: 0,1 M trietanolamin HCl-buffert pH 8,0, 1,0 M Tris-HCl-buffert pH = 8,1, 10 % Triton X-100, 10 mM Oxalacetat i 0,1 M trietanolamin HCl-buffert pH 8,0, 1,01 mM DTNB i 1,0 M Tris-HCl-buffert pH = 8,1, acetyl-CoA 12,2 mM i dubbeldestillerad H2O.
- Bered reaktionsmedium (tabell 1) innehållande 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobezoesyra) (DTNB; 0,1 mM), acetylkoenzym A (0,31 mM), EDTA (50 μM), trietanolamin HCl (5 mM) och Tris HCl (0,1 M).
- Bered startreagens (tabell 1) med 0,5 mM oxaloacetat löst i dubbeldestillerat H2O.
- Tina proverna på is eftersom citratsyntas är instabilt om det tinas upp för snabbt.
- Tillsätt 40 μl av proverna till en 96-hålsplatta på is innan 110 μL reaktionsmedium tillsätts med en multipipett.
- Varmt reaktionsmedium och prov i en inkubator till 30 °C i 5 min. Varmt startreagens i ett vattenbad till 30 °C i 5 min.
- Tillsätt 50 μl av startreagenset med en multipipett till varje brunn. Mät absorbansen vid 30 °C vid en våglängd på 412 nm i 20 minuter via plattläsare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellviabilitet och antal
För att uppnå framgångsrik isolering och kryokonservering bör cellantalet och viabiliteten vara så hög som möjligt. Före och efter kryokonservering räknas cellerna och deras livskraft bestäms för att säkerställa cellernas hälsa och kvalitet. Figur 3 är en representativ illustration av PBMC före och efter kryokonservering, cellantal och viabilitet skiljer sig knappast åt. Detta indikerar framgångsrik isolering och bevarande av PBMC.
Figur 3: Effekt av kryokonservering på cellantal och viabilitet. Testgrupperna delas in i kontrollgruppen med nyisolerade PBMC och PBMC efter 1 månads kryokonservering. Räkningen av cellerna och bestämningen av deras livskraft utfördes med en automatiserad cellräknare. Trypan blue användes för att bestämma livskraften. Varje mätning utfördes som en trippel av medelvärdet beräknades från resultaten av de enskilda mätningarna. (A) Bestämning av cellviabilitet hos PBMC efter färsk isolering och efter 1 månads kryokonservering. Värdena anges som medelvärde ± SEM. Signifikanserna bestämdes med ett parat t-test. (B) Bestämning av cellantal av PBMC efter ny isolering och efter 1 månads kryokonservering. Värdena anges som medelvärden ± SEM. Signifikanserna bestämdes med ett parat t-test. Samma form och färg visar samma prov före och efter en månads kryokonservering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
ATP representerar den viktigaste energikällan för eukaryota celler. ATP bestäms via ett luminiscensanalyssystem. Om kryokonservering är framgångsrik bör ATP mellan nyisolerade celler och kryokonserverade celler inte skilja sig åt. Figur 4 är en representativ illustration av PBMC före och efter kryokonservering; ATP-nivåerna är likartade. Detta indikerar framgångsrik isolering och bevarande av PBMC.
Figur 4: Jämförelse av ATP-koncentration under olika kryokonserveringsperioder. ATP-koncentration (μM / 100 000 celler) i PBMC. Testgrupperna delas in i kontrollgruppen med nyisolerade PBMC och PBMC efter 1 månads kryokonservering. Prover samlades in samtidigt och sedan antingen kryoförvarades eller mättes efter isolering. Ett parat t-test utfördes för att testa signifikanta skillnader; Resultatet visade att skillnaderna inte var signifikanta. Värdena anges som medelvärden ± SEM (N = 13). Samma form och färg visar samma prov före och efter en månads kryokonservering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Citratsyntas (CS) är ett nyckelenzym i citratcykeln, beläget i mitokondrier. Därför representerar CS-aktivitet en robust markör för mitokondriell massa. CS-aktiviteten bestäms på grundval av omvandling från DTNB till TNB. Figur 5 visar att CS-värdena före och efter kryokonservering inte skiljer sig åt i PBMC. Återigen indikerar detta en framgångsrik isolering och bevarande av PBMC.
Figur 5: Effekt av kryokonservering på citratsyntasaktivitet. Citratsyntasaktivitet i PBMC efter 1 månads kryokonservering jämfört med den nyligen uppmätta kontrollen. Prover samlades in samtidigt och sedan antingen kryoförvarades eller mättes efter isolering. Värdena uttrycks som medelvärde ± SEM (N = 8). Signifikanserna bestämdes med ett parat t-test. Samma form och färg visar samma prov före och efter en månads kryokonservering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
De bioenergetiska profilerna för PBMC kan bestämmas med hjälp av polarografiska syresensorer, t.ex. i högupplöst oxygraf. Cellulär syreförbrukning mäts i ett slutet kammarsystem med mycket hög upplösning och känslighet i biologiska prover, t.ex. intakta och permeabiliserade celler, vävnader eller isolerade mitokondrier. Den högupplösta oxygrafenheten är utrustad med två kammare och använder polarografiska syresensorer för att mäta syrekoncentrationen och beräkna syreförbrukningen i varje kammare. Syreförbrukningen beräknas med hjälp av programvara och uttrycks som pikomoler per s per antal celler24. Inom varje oxigrafkammare mäter polarografiska syreelektroder syrekoncentrationen och beräknar syreförbrukningen (flödet) inom varje kammare. Syreförbrukning och koncentration i kammaren visas i realtid (figur 6). Med tillsats av specifika hämmare och substrat riktas de enskilda komplexen i andningskedjan för att mäta deras aktivitet. Efter analysen analyseras data med programvaran. Flödesvärdena normaliserades till citratsyntasaktivitet. Oxigrafin gav lägre värden för komplex IV på grund av delvis oxiderad TMPD. I en serie tester fann vi att TMPD som användes avvek med en faktor på 1,8. Denna faktor användes för att normalisera värdena i figur 6.
Figur 6: Mitokondriell respiration i PBMCS efter kryokonservering jämfört med nyuppmätt kontroll. En lösning innehållande 1,6 x 107 celler/ml användes för att mäta cellernas syreförbrukning i en oxigraf. Andningen mättes 1 månad efter kryokonservering. För att undersöka aktiviteten hos komplexen i andningskedjan tillsattes flera hämmare, substrat och avkopplare. Tillsatsen av ett ämne gjordes på följande sätt: CI (L) = läckagerespiration av komplex I; CI(P) = kopplad respiration av komplex I, CI&CII(P) = fysiologisk andning; CI&CII(U) = okopplad andning som uppvisar maximal aktivitet hos komplex I och II, CII(U) = okopplad respiration av komplex II, CII(L) = läckagerespiration av komplex II, CIV(U) = okopplad andning. En faktor på 1,8 användes för att normalisera värdena. Denna faktor bestämdes experimentellt för den aktuella uppställningen. Data visas som medelvärden ± SEM (N = 10). Statistisk signifikans testades via Students t-test (*p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Endogen andning bestäms genom att tillsätta 2 ml cellsuspension i kamrarna. Flödet med endogena substrat mäts. För att ytterligare skilja mellan komplex läggs digitonin till. Digitonin permeabiliserar plasmamembranet medan mitokondriella membran förblir intakta. För att kompensera för protonläckage genom membranet tillsätts substraten glutamat och malat. Andningsfrekvensen vid denna tidpunkt illustrerar komplex I-driven andning i frånvaro av kopplad andning. För att detektera den oxidativa fosforyleringskapaciteten (OXPHOS) hos komplex I ADP tillsätts, är andningen nu i ett kopplat tillstånd. Den kopplade andningen av CI och CII uppnås genom tillsats av succinat. Nu arbetar andningskedjan med maximal kapacitet. Med titrering av karbonylcyanid p-trifluormetoxifenylhydrazon (FCCP) kopplas elektrontransportkedjan (ETC) bort. Med denna frikoppling bestäms den maximala okopplade aktiviteten hos CI och CII. För att skilja mellan CI och CII tillsätts komplex I-specifik hämmare rotenon. Genom tillsats av oligomycin bestäms läckageandningen av CII. För att utesluta syreförbrukning hos källor som inte är involverade i oxidativ fosforylering tillsätts antibiotikumet antimycin A och denna återstående syreförbrukning subtraheras från alla avläsningar som erhållits i experimentet. Elektrondonatorn N,N,N',N'-tetrametyl-p-fenylendiamindihydroklorid (TMPD; 0,5 mM) är ett artificiellt substrat för CIV. För att hålla TMPD i reducerat tillstånd används askorbat. Askorbat och TMPD används för att mäta den maximala okopplade andningen av CIV. Eftersom TMPD är föremål för autooxidation tillsättsNaN3 efter stabilisering av flödet för att hämma CIV. Den återstående syreförbrukningen subtraheras från de råa CIV-värdena. Figur 2 visar en typisk mätkurva.
Parametrarna som visas visar hur framgångsrik tekniken är. Tekniken utvecklades för att utföra bioenergetiska mätningar efter kryokonservering. Resultaten som visas jämför cellerna före och efter mätningen, eftersom inga statistiskt signifikanta skillnader kan ses, kan man anta att denna konserveringsmetod är lämplig för lagring över 1 månad.
Tabell 1: Lösningar, buffertar och förbrukningsvaror. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll gör det möjligt att isolera och kryokonservera mononukleära celler (PBMC) i perifert blod från humant blod på ett sätt som lämpar sig för bioenergetiska analyser. Den beskrivna metoden ger möjlighet att isolera PBMC försiktigt och i stora mängder, med hög viabilitet och tillräckligt med celler för bioenergetiska mätningar. Det har nackdelen att även med minimala avbrott uppstår långa isoleringar, men efterföljande kryokonservering möjliggör en tidsoberoende mätning av bioenergetik. Med denna metod kan prover samlas in och mätas vid senare tidpunkter. Det är också lämpligt att samla in prover i multicenterförsök och mäta parametrar samtidigt på en central plats.
Kryokonservering ger möjlighet att lagra celler under lång tid och mäta dem efteråt. Isoleringen av PBMC är en tidskrävande process på cirka 2-3 timmar och gör det endast möjligt att ta ett litet antal prover samtidigt. Det är inte möjligt för en enskild försöksledare att isolera färska PBMC från mer än 2 individer samtidigt utan kvalitetsförlust. Behovet av att utföra uppföljande experiment med färska celler komplicerar proceduren och är därmed förknippat med ytterligare stress och tidsproblem. Att separera isolering från experimentens prestanda kan förenkla studier och göra testerna mer standardiserade. Specifikt blodinsamling, isolering, kryokonservering av ett provkollektiv, följt av utförande av specifika experiment. Prover kan samlas in från olika platser och vid olika tidpunkter och sedan mätas samtidigt på samma plats.
Bioenergetik spelar en viktig roll i cellmetabolismen, störd bioenergetik som leder till mitokondriell dysfunktion kommer sannolikt att spela en viktig roll i åldrande och därefter i neurodegeneration och andra sjukdomar25,26. Metoderna som beskrivs ovan kan användas i nyligen isolerade och kryokonserverade PBMC:er för att övervaka förändringar. Dessa bioenergetiska mätningar kan användas som underlag för kliniska studier och forskning.
Det finns flera begränsande faktorer för denna teknik och för- och nackdelarna med färsk mätning kontra mätning efter kryokonservering måste vägas mot varandra. Kryokonservering är i allmänhet mycket krävande för PBMC; Därför är det viktigt att hålla antalet stressfaktorer så lågt som möjligt. Tiden är avgörande eftersom cellerna ska tillbringa så lite tid som möjligt i DMSO som är giftigt för PBMC, varje steg bör förberedas innan celler tinas upp eller fryses med DMSO. För bioenergetiska mätningar visade sig förvaring i en frys på -80 °C vara ineffektiv - proverna måste överföras till flytande kväve efter 24 timmar. En kontrollerad fryshastighet är obligatorisk om kylningen är för snabb, vattnet som finns kvar i cellerna fryser och bildar kristaller som skadar cellmembran och fack. En för långsam nedkylningshastighet leder till långvarig kontakt med den giftiga DMSO:n. Cellfrysar som använder isopropanol kan uppnå en fryshastighet på 1 °C/min i en frys på -80 °C. Upptining och återfrysning av PBMC bör undvikas.
Detta protokoll beskriver isolering och kryokonservering av PBMC. För att bekräfta funktionaliteten hos PBMC efter konservering för bioenergetiska mätningar utfördes exemplifierande mätningar av bioenergetiska mätningar. Detta protokoll har optimerats för mätning av bioenergetiska faktorer. Bioenergetiska faktorer kan bestämmas efter kryokonservering, men det kan också bestämmas för andra protokoll om mätningar är möjliga efter kryokonservering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi vill tacka det kliniska teamet på universitetssjukhuset Giessen-Marburg för blodinsamlingen. Detta arbete finansierades av Justus Liebig-universitetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | - | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | - | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | - | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | - | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | - | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | - | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | - | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | - | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | - | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | - | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al.
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M.
