Summary
Isolerte mononukleære celler i perifert blod kan brukes til analyse av immunfunksjoner og forstyrrelser, metabolske sykdommer eller mitokondrielle funksjoner. I dette arbeidet beskriver vi en standardisert metode for fremstilling av PBMC fra fullblod og påfølgende kryopreservering. Kryopreservering gjør denne tiden og stedet uavhengig.
Abstract
De fysiologiske funksjonene til eukaryote celler er avhengige av energi hovedsakelig levert av mitokondrier. Mitokondriell dysfunksjon er knyttet til metabolske sykdommer og aldring. Oksidativ fosforylering spiller en avgjørende rolle, da det er avgjørende for vedlikehold av energisk homeostase. PBMC har blitt identifisert som en minimalt invasiv prøve for å måle mitokondriell funksjon og har vist seg å gjenspeile sykdomsforhold. Måling av mitokondriell bioenergetisk funksjon kan imidlertid begrenses av flere faktorer i humane prøver. Begrensninger er mengden prøver som tas, prøvetakingstid, som ofte er spredt over flere dager, og steder. Kryopreservering av de innsamlede prøvene kan sikre konsistent innsamling og måling av prøver. Det må utvises forsiktighet for å sikre at de målte parametrene er sammenlignbare mellom kryopreserverte og nytilberedte celler. Her beskriver vi metoder for å isolere og kryopreservere PBMC fra humane blodprøver for å analysere mitokondrienes bioenergetiske funksjon i disse cellene. PBMC-kryopreservert i henhold til protokollen beskrevet her viser bare mindre forskjeller i cellenummer og levedyktighet, adenosintrifosfatnivåer og målt respiratorisk kjedeaktivitet sammenlignet med nyhøstede celler. Bare 8-24 ml humant blod er nødvendig for de beskrevne preparatene, noe som gjør det mulig å samle prøver under kliniske studier multisentralt og bestemme deres bioenergetikk på stedet.
Introduction
Humane perifere blodmononukleære celler (PBMC) brukes til ulike applikasjoner på mange vitenskapelige felt, inkludert studier av immunologiske og bioenergetiske problemstillinger, som de som er relatert til aldringsprosesser eller degenerative sykdommer 1,2. PBMC er heterogen i sammensetning og består av lymfocytter (B-celler, T-celler og NK-celler), monocytter og dendrittiske celler. Cellene viser noen ganger store individuelle forskjeller og variasjoner innen et emne, så standardiserte prosedyrer for håndtering av disse cellene er nødvendig. Viktige parametere som levedyktighet og renhet av isolasjonen er de grunnleggende kravene til håndtering og påvirkes i tillegg av miljøfaktorer som tidspunktet for innsamling, melatoninnivået, om motivet er fastende og andre 3,4.
Basert på studier av bioenergetikk av PBMC, beskriver vi her en metode for isolering, kryopreservering og dyrking av PBMC som også er egnet for andre metoder. Mens muskelbiopsi regnes som gullstandarden for mitokondriell energimetabolisme5, er undersøkelsen av blodceller en rask, minimalt invasiv prosedyre. I tillegg til dette tyder flere og flere studier på at endringene i mitokondriell funksjon i aldring og Alzheimers sykdom (AD) forekommer ikke bare i hjernen, men også i periferien 6,7,8,9,10. Metoden gjør det også mulig å undersøke andre tilstander og sykdommer, blant annet diabetes mellitus og fedme 11,12,13. Genuttrykksmønstre hos multippel sklerose-pasienter kan analyseres, eller immunfunksjon og påvirkning på det generelt 14,15,16.
PBMC er generelt avhengige av oksidativ fosforylering (OXPHOS) for å generere adenosintrifosfat (ATP)17,18. Derfor dekker PBMC et bredt spekter av applikasjoner som surrogater. I tidligere rapporter har energimetabolismen av PBMC blitt brukt til å behandle organdysfunksjoner, som ved tidlig hjertesvikt19, septisk sjokk20 eller kjønnsrelaterte forskjeller4 i mitokondriell funksjon. En generalisert metode for kryopreservering, isolering og dyrking av PBMC ville ha fordeler i sammenlignbarheten av resultater oppnådd ved forskjellige institutter. Det er stor variasjon i protokollene for hvert trinn21,22, målet med denne metoden er å gi en retningslinje for bioenergetiske målinger i PBMCs.
I denne artikkelen beskriver vi en metode for måling av bioenergetiske parametere i PBMC. Vi forklarer metodene for å isolere, kryopreservere og måle bioenergetikk av PBMC fra humant blod. Denne metoden kan brukes til å bestemme bioenergetiske parametere hos pasienter og evaluere dem i en klinisk sammenheng. For å bruke disse målingene trenger forskerne tilgang til en pasientpopulasjon som ferske blodprøver kan fås fra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller beskrevet i dette manuskriptet for blodinnsamling, isolering og analyse er gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board ved Universitetet i Giessen, Tyskland. Samtykke fra pasientene til å inkludere sine prøver i studien ble innhentet. Alle trinn for isolasjon og cellekultur utføres under et biologisk sikkerhetsskap.
1. Venepunktur
- Forbered alt utstyr som trengs for blodoppsamling, inkludert desinfeksjonsspray, steril vattpinne, blodoppsamlingskanyle med 80 mm rør og multiadapter, turniquet/blodtrykksmansjett, Monovette 9 ml litium-heparin.
MERK: EDTA som antikoagulant er også effektiv. - Samle blod fra den mest passende armvenen, vanligvis vena mediana cubiti eller vena cephalica.
- Påfør en turniquet/blodtrykksmansjett med lett trykk, rundt 80 mm/Hg.
- Desinfiser hansker og stikksted med desinfiserende spray som inneholder alkohol. La det desinfiserte stikkstedet lufttørke.
- Venene stikker ut på grunn av trykket på mansjetten. Sett nålen (kanylediameter (ytre) 21G / 0,8 mm, lengde 19 mm) i en 15°-20° vinkel på venen for å unngå traumer og minimere sondering.
- Ta blod med passende system, 4 rør som inneholder 9 ml blod (mer enn 7-8 rør er problematiske for en eksperimentør å isolere riktig).
- Etter blodoppsamling, plasser oppsamlingsrørene i mørket i 5 minutter for å sikre jevn antikoagulasjon.
2. PBMC-isolasjon
- Forbered alle nødvendige løsninger som beskrevet nedenfor.
- Bring Dulbeccos balanserte saltløsning (DPBS; konsentrasjon 1x) og lymfocyttisolasjonsmedium (1,077 g/ml) til romtemperatur (20-25 °C).
- Forbered Fetal bovine serum (FBS) ved romtemperatur og hold ett sterilt 50 ml konisk rør med FBS på is. For hver blodprøve kreves 2 ml FBS.
- Oppbevar frysebeholdere ved 4 °C og forkjøl kryorør ved 4 °C.
- Varmt cellekulturmedium til 37 °C, mediet består av RPMI 1640 med 50 ml FBS og penicillin 50 U/ml streptomycin 50 U/ml. Denne oppløsningen kan oppbevares ved 3 °C i opptil 2 måneder.
- Tilsett 8 ml DPBS i sterile 50 ml koniske rør. Tilsett 15 ml lymfocyttisolasjonsmedium i sterilt 50 ml konisk rør (Medium er lysfølsomt, legg det til før isolasjonen starter).
- Tilsett 8 ml blod til 8 ml DPBS, og bland forsiktig med en 3 ml plastisk Pasteur-pipette.
- Legg blod/DPBS forsiktig lagvis med en 3 ml plastisk Pasteur-pipette på toppen av lymfocyttisolasjonsmediet. For å påføre det første laget på mediet, vipp røret 20 ° -30 °, noe som vil resultere i mindre penetrasjon av blod-PBS-blandingen i mellomlaget.
- Legg blod-PBS-blandingen forsiktig over sideveggen av røret på lymfocyttisolasjonsmediet. Bruk en jevn hastighet for å holde blodstrømmen konstant.
- I neste trinn, ta røret sakte i oppreist stilling, det gjenværende blodet er forsiktig lagdelt over sideveggen av røret på blodlaget.
- Sentrifuge i 10 min ved 1000 x g ved romtemperatur i en sentrifuge med en svingende bøtte rotor med bremser av. Etter sentrifugering separeres blod/PBMC-blandingen i fire lag. Topplaget består av plasma og blodplater, det andre laget er PBMC-laget, etterfulgt av et lymfocytisoleringsmediumlag, og til slutt erytrocytter og granulocytter i bunnlaget. De ulike lagene er vist i figur 1.
- Fjern 2/3rd av plasmalaget med en plast Pasteur pipette.
- Bruk en 1 ml pipette til å samle PBMCene på lymfocyttisolasjonsmedielaget, og pass på at du ikke får noe medium i prøven.
- Plasser spissen 1 mm over PBMC-laget. PBMC-laget skal ikke punkteres, ellers vil mediet strømme over cellene. Suget av pipetten trekker PBMC-ene til dette punktet slik at de kan samles flere ganger på dette tidspunktet.
MERK: For å maksimere antall PBMCer samlet, på slutten av prosedyren, søk etter resten på overflaten og prøv å samle cellene der også. For å stabilisere prosedyren kan røret plasseres på en overflate. - Overfør PBMCene trinn for trinn til et nytt 50 ml rør til laget er fullstendig høstet. Legg DPBS opp til 25 ml-merket, vask bort lymfocyttisolasjonsmedium og andre rester.
- Sentrifuge i 10 min ved 100 x g ved romtemperatur med bremser på. Fjern supernatanten med en vakuumpumpe eller lignende, pass på at cellepelleten ikke skades.
- Resuspender pelleten i 1 ml DPBS og legg opp DPBS til 25 ml-merket. Gjenta vaskingen en gang til og resuspender deretter i medium som passer for de neste trinnene.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av sentrifugering av tetthetsgradient for å illustrere de ulike lagene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Kryopreservering
- Kjøl ned en frysebeholder til 4 °C, avkjøl FBS på is.
- Resuspender PBMC-pellet i 1 ml FBS med en 1 ml pipette, FBS skal være ved romtemperatur.
- Bland DMSO med forkjølt FBS på is 1:5, endelig konsentrasjon 20% DMSO og legg deretter FBS: DMSO-blandingen tilbake på is. Forbered alltid løsningen frisk.
- Overfør PBMC-cellesuspensjonen i FBS til godt merkede 2 ml kryorør. Bruk ett kryorør per oppsamlingsrør. Juster antall celler mellom 1 x 107 og 5 x 107 per ml. Bruk en automatisert celleteller for å bestemme celleantall og levedyktighet.
- Tilsett 1 ml FBS: DMSO-blanding dråpevis med en 1 ml pipette, ca. 1-2 dråper per s, inn i røret. Den dråpevise tilsetningen fører til kontinuerlig og konsistent blanding.
- Plasser rør i den forkjølte frysebeholderen. Plasser frysebeholderen i en fryser på -80 °C i 24 timer. Frysebeholderen gir en kontrollert kjøling på -1 °C per min.
- Fjern tubene fra fryseren ved -80 °C. Etter fjerning fra fryseren lagrer rørene i gassfasen av flytende nitrogen. Dokumenter stedet for hver prøve.
4. Tining
- Forbered alle nødvendige løsninger: Cellekulturmedium RPMI 1640 med 50 ml FBS og penicillin 50 U / ml, streptomycin 50 U / ml. Denne oppløsningen kan oppbevares ved 3 °C i opptil 2 måneder.
- Forvarm cellekultur medium til 37 °C. Tilsett 3 ml forvarmet cellekulturmedium i sterile 50 ml koniske rør.
- Fjern prøven fra flytende nitrogentank. Tine prøver i vannbad ved 37 °C i ca. 3,5 min, tas ut av vannbadet så snart siste is smelter. Et stykke is på størrelse med et knappenålshode skal fortsatt være synlig i røret.
MERK: DMSO er skadelig for PBMCs arbeid så raskt som mulig. - Fjern cellen:FBS:DMSO bland med en 1 ml pipette fra kryorøret. Bland PBMC-prøvene med cellekulturmediet i de tilberedte 50 ml rørene. Vask ut rørene med 5 ml dyrkningsmedium i tre trinn på 2 ml, 2 ml og 1 ml.
- Overfør mediet inn i rørene. Dette utføres for å overføre mulige cellerester. Sentrifuge i 10 min ved 100 x g ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og tilsett 1 ml medium egnet til planlagt bruk. Cellene er klare for påfølgende eksperimenter.
MERK: Men med funksjonelle tester på friske eller frosne celler, anbefales en hvileperiode i en inkubator (vanligvis over natten) ofte etter lymfocyttisolasjon, mediumbasert isolasjon eller celletining.
5. Cellekultur
- Etter isolering eller tining av kulturceller over natten ved 37 °C i 5 % CO2/95 % luft.
- Resuspender cellene i 1 ml RPMI-medium supplert med 10% FBS, penicilin 50 U / ml, streptomycin 50 U / ml. For videre bruk er det mange muligheter, behandle celler etter behov for analysene.
- For generell lagring bruk sterile 6 brønncellekulturplater og høstceller etter hvileperiode. Overfør 1 ml cellesuspensjon med en 1 ml pipette til en brønn og tilsett 4 ml cellekulturmedium.
MERK: Mengden isolerte PBMCer varierer sterkt mellom individer, en brønn med 5 ml cellekulturmedium er tilstrekkelig for hver 8 ml isolert blod. Ved isolering av PBMC fra buffy coats er imidlertid mengden PBMC betydelig høyere enn i fullblodprøver, og cellene bør derfor deles inn i flere brønner. - La cellene hvile 24 timer i en fuktet atmosfære supplert med 5 % CO2 ved 37 °C. Denne inkubasjonen utføres for ferskt isolerte celler, så vel som for kryopreserverte celler.
6. ATP-analyse
- Resuspendere tinte PBMC i 1 ml RPMI-medium supplert med 10 % FBS, penicillin 50 U/ml, streptomycin 50 U/ml.
- Ta en prøve og bestem celletallet, og utfør deretter en levende død diskriminering med trypanblå. Ta 10 μL fra de resuspenderte cellene og bland med 90 μL cellekulturmedium. Ta deretter 10 μL og bland med 10 μL trypanblå. Plasser cellene enten i et celletellekammer eller en automatisk celleteller og bestem antall levende / døde celler.
- Plate 100 μL celler med en tetthet på 1 x 105 celler / 100 μL per brønn i en 96-brønns hvit polystyrenplate.
- La cellene hvile i 24 timer i en fuktet atmosfære supplert med 5 % CO2 ved 37 °C.
- Bestem ATP-konsentrasjonene med en ATP-analyse.
- Bruk lysutslipp som oppstår når ATP kombineres med luciferin. Det utstrålede lyset kan evalueres med en plateleser. Fjern platene for inkubatoren for å kjøle seg ned til romtemperatur i 15 minutter. Lyse cellene og la dem stå i 5 min. Påfør deretter overvåkingsreagens på cellene og mål i henhold til produsentens instruksjoner. En intern standard brukes til å bestemme ATP-nivået.
7. Respirometri med høy oppløsning
- Slå på den høyoppløselige oksygrafen og la den varmes opp i 30 minutter.
- Behandle celler i henhold til en protokoll beskrevet i figur 1. Forbered alle nødvendige lagre som i tabell 1.
- Pipett 2,1 ml respirasjonsbuffer (tabell 1) inn i begge oksygrafkamrene med høy oppløsning og rør bufferen kontinuerlig ved hjelp av en magnetisk omrøringsstang i kamrene (750 o / min) ved 37 °C i 30 minutter til et stabilt oksygenflukssignal fra den polarografiske oksygensensoren er oppnådd.
MERK: I oksygrafens kamre måles oksygenforbruket i sanntid (fluss) og oksygenmetningen i kammeret ved hjelp av polarografiske oksygenelektroder. Bakgrunnskalibrering må utføres for å unngå bakgrunnsstøy og for å sikre pålitelige resultater. - Utfør en luftkalibrering av den polarografiske oksygensensoren i henhold til produsentens protokoller23.
- Resuspender isolerte PBMCer i 1 ml mitokondrielt respirasjonsmedium (MIR05, sammensetningen er vist i tabell 1) og fortynn til 8 x 106 celler/ml.
- Etter luftkalibrering, aspirer respirasjonsmediet fra oksygrafkammeret og tilsett 2,1 ml cellesuspensjon i hver camber i respirometeret. Hvis det er nødvendig under målingen å oksygenere kamrene (se Åpne ved punkt h i figur 2), bør oksygenmetningen i kamrene ikke falle under 100 μM.
- Lukk kamrene ved å sette inn proppene, kamrene er utformet for å holde 2,0 ml volum. Aspirer den fremvoksende cellesuspensjonen.
- Bland cellesuspensjonen kontinuerlig ved 37 °C med en magnetomrører (750 rpm) i kammeret. Vent i ca. 20 minutter til et stabilt signal er oppnådd. Bestem endogen respirasjon ((a) i figur 2).
- For å bestemme de forskjellige komplekse aktivitetene i luftveiene, injiser substratene og hemmerne for mitokondriell respirasjon gjennom titaninjeksjonsportene på proppene. Bruk følgende endelige konsentrasjon i kammeret.
- For å forstyrre cellemembraner, tilsett 5 μL 8,1 mM digitonin, gjennom titaninjeksjonsporten på kammerproppen, for å fjerne naive substrater (b) i figur 2 mens mitokondriemembranene forblir intakte.
- Tilsett substratene 2 M glutamat og 800 mM malat gjennom injeksjonsporten på kammerproppen og registrer respirasjonen til et stabilt signal oppnås. Signalet stabiliserer seg etter 2-4 min.
MERK: Det er også mulig å bruke ekstra underlag som pyruvat. - Tilsett 8 μL 500 mM adenosindifosfat (ADP) gjennom injeksjonsporten på kammerproppen og registrer respirasjonen til et stabilt signal oppnås. Signalet stabiliserer seg etter 2-4 min (d) i figur 2.
- Tilsett 20 μL 1 M succinat gjennom injeksjonsporten på kammerproppen og registrer respirasjonen til et stabilt signal oppnås. Signalet stabiliserer seg etter 2-4 min (e) i figur 2.
- Titrat 1 M karbonylcyanid p-trifluormetoksyfenylhydrazon (FCCP) trinnvis ved 0,5 μL opp til det punktet hvor ingen ytterligere økning skjer. Vent 2–4 minutter til signalet stabiliserer seg (f) i figur 2. Når det ikke er ytterligere økning i respirasjonen, fortsett med neste trinn.
FORSIKTIG: Vær forsiktig når du håndterer FCCP, da det har helserisiko for mennesker. - Tilsett 5 μL 0,1 mM rotenon gjennom injeksjonsporten på kammerproppen og registrer respirasjonen til et stabilt signal oppnås. Signalet stabiliserer seg etter 2-4 min (g) i figur 2.
FORSIKTIG: Vær forsiktig når du håndterer rotenon, da det har helserisiko for mennesker. - Tilsett 1 μL 4 mg/ml oligomycin gjennom injeksjonsporten på kammerproppen og registrer respirasjonen til et stabilt signal oppnås. Signalet stabiliserer seg etter 2-4 min (h) i figur 2.
FORSIKTIG: Vær forsiktig når du håndterer oligomycin, da det er en gift som utgjør helserisiko for mennesker. - Tilsett 1 μL 5 mM antimycin A gjennom injeksjonsporten på kammerproppen og registrer respirasjonen til et stabilt signal oppnås. Signalet stabiliserer seg etter 2-4 min (i) i figur 2.
FORSIKTIG: Vær forsiktig når du håndterer antimycin A, da det er en gift som utgjør helserisiko for mennesker. - Når du evaluerer kjøringen for å utelukke oksygenforbruket til enzymer som ikke er involvert i oksidativ fosforylering, trekker du antimycin A-verdiene fra alle andre målte verdier.
- Tilsett 200 mM N, N, N', N'-tetrametyl-p-fenylendiamindihydroklorid (TMPD; elektrondonator) og 800 mM askorbat for å holde TMPD i redusert tilstand. Injiser substratene gjennom injeksjonsporten på kammerproppen og registrer respirasjonen til et stabilt signal oppnås. Signalet stabiliserer seg etter 2-4 min (j) i figur 2.
- TMPD er gjenstand for autooksidasjon, så trekk det resulterende oksygenforbruket fra den målte verdien ved kompleks IV.
- Tilsett NaN3 ≥ 100 mM gjennom injeksjonsporten på kammerproppen og registrer respirasjonen til et stabilt signal oppnås. Signalet stabiliseres etter 2-4 minutter for å hemme kompleks IV-aktivitet, bare TMPD-autooksidasjon gjenstår.
FORSIKTIG: Vær forsiktig når du håndterer natriumazid, da det er en gift som utgjør helserisiko for mennesker.
Figur 2: Skjematisk forløp avO2-fluksen . Det skjematiske løpet av oksygenstrømmen er vist. Kurven er delt inn i de forskjellige fasene etter tilsetning av hemmere og substrater fra a-k. a: endogen respirasjon; b: permeabiliserte celler; c: uncoupled kompleks I respirasjon; d: koblet kompleks I respirasjon; e: OXPHOS ; f: maksimal ukoblet aktivitet av CI og CII ; g: frakoblet respirasjon av kompleks II; h: lekkasje åndedrett; I: gjenværende respirasjon; j: CIV (U) frakoblet respirasjon og autooksidasjon av TMPD; k: autooksidasjon av TMPD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
8. Sitrat syntase aktivitet
- Mål citratsyntaseaktivitet som en separat parameter og bruk den til å normalisere målingene av høyoppløselig oksygraf.
- Resuspender isolert PBMC i 1 ml mitokondrielt respirasjonsmedium (MIR05) og fortynn til 8 x 106 celler/ml.
- Frys i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 °C til forsøk er utført eller for å måle ferske celler.
- Forbered alle nødvendige løsninger: 0,1 M trietanolamin HCl buffer pH 8,0, 1,0 M Tris-HCl buffer pH = 8,1, 10% Triton X-100, 10 mM oksalacetat i 0,1 M trietanolamin HCl buffer pH 8,0, 1,01 mM DTNB i 1,0 M Tris-HCl buffer pH = 8,1, acetyl-CoA 12,2 mM i dobbeltdestillert H2O.
- Preparat reaksjonsmedium (tabell 1) inneholdende 5,5'-dithio-bis-(2-nitrobezoesyre) (DTNB; 0,1 mM), acetylkoenzym A (0,31 mM), EDTA (50 μM), trietanolamin HCl (5 mM) og Tris HCl (0,1 M).
- Klargjør startreagens (tabell 1) med 0,5 mM oksaloacetat oppløst i dobbeltdestillertH2O.
- Tine prøvene på is, da sitratsyntase er ustabil hvis den tines for raskt.
- Tilsett 40 μL av prøvene til en 96-brønnsplate på is før tilsetning av 110 μL reaksjonsmedium med en multipipette.
- Varmt reaksjonsmedium og prøve i en inkubator til 30 °C i 5 minutter. Varm startreagens i vannbad til 30 °C i 5 minutter.
- Tilsett 50 μL av startreagenset med en multipipette til hver brønn. Mål absorbansen ved 30 °C ved en bølgelengde på 412 nm i 20 minutter via plateleser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celle levedyktighet og antall
For å oppnå vellykket isolasjon og kryopreservering, bør celletall og levedyktighet være så høyt som mulig. Før og etter kryopreservering telles cellene, og deres levedyktighet bestemmes for å sikre cellens helse og kvalitet. Figur 3 er en representativ illustrasjon av PBMC før og etter kryopreservering, celletall og levedyktighet er knapt forskjellig. Dette indikerer vellykket isolering og bevaring av PBMC.
Figur 3: Effekt av kryopreservering på cellenummer og levedyktighet. Testgruppene deles inn i kontrollgruppen med ferskt isolerte PBMC og PBMC etter 1 måneds kryopreservering. Tellingen av cellene og bestemmelsen av deres levedyktighet ble utført med en automatisert celleteller. Trypanblå ble brukt til å bestemme levedyktigheten. Hver måling ble utført som en triplikat av middelverdien ble beregnet ut fra resultatene av de enkelte målingene. (A) Bestemmelse av cellenes levedyktighet av PBMC etter ny isolasjon og etter 1 måneds kryopreservering. Verdier er gitt som gjennomsnitt ± SEM. Signifikans ble bestemt med paret t-test. (B) Bestemmelse av celleantall PBMC etter fersk isolasjon og etter 1 måneds kryopreservering. Verdier er gitt som middel ± SEM. Signifikans ble bestemt med paret t-test. Den samme formen og fargen viser den samme prøven før og etter en måneds kryopreservering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
ATP representerer den viktigste energikilden for eukaryote celler. ATP bestemmes via et luminescensanalysesystem. Hvis kryopreservering er vellykket, bør ATP mellom ferskt isolerte celler og kryopreserverte celler ikke avvike. Figur 4 er en representativ illustrasjon av PBMC før og etter kryopreservering; ATP-nivåene er like. Dette indikerer vellykket isolering og bevaring av PBMC.
Figur 4: Sammenligning av ATP-konsentrasjon av forskjellige kryopreserveringsperioder. ATP-konsentrasjon (μM / 100 000 celler) i PBMC. Testgruppene deles inn i kontrollgruppen med ferskt isolerte PBMC og PBMC etter 1 måneds kryopreservering. Prøvene ble samlet inn samtidig, og deretter enten kryolagret eller målt etter isolering. En paret t-test ble utført for å teste signifikante forskjeller; Resultatet viste at forskjellene ikke var signifikante. Verdiene er angitt som middelverdier ± SEM (N = 13). Den samme formen og fargen viser den samme prøven før og etter en måneds kryopreservering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Citratsyntase (CS) er et nøkkelenzym i citratsyklusen, lokalisert i mitokondrier. Derfor representerer CS-aktivitet en robust markør for mitokondriemasse. CS-aktivitet bestemmes på grunnlag av konvertering fra DTNB til TNB. Figur 5 viser at før og etter kryopreservering er CS-verdiene ikke forskjellige i PBMC. Igjen indikerer dette en vellykket isolering og bevaring av PBMC.
Figur 5: Effekt av kryopreservering på citratsyntaseaktivitet. Citratsyntaseaktivitet i PBMC etter 1 måneds kryopreservering sammenlignet med den nylig målte kontrollen. Prøvene ble samlet inn samtidig, og deretter enten kryolagret eller målt etter isolering. Verdier uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM (N = 8). Signifikans ble bestemt med paret t-test. Den samme formen og fargen viser den samme prøven før og etter en måneds kryopreservering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
De bioenergetiske profilene til PBMC kan bestemmes ved hjelp av polarografiske oksygensensorer, for eksempel i høyoppløselig oksygraf. Cellulær oksygenforbruk måles i et lukket kammersystem med svært høy oppløsning og følsomhet i biologiske prøver, for eksempel intakte og permeabiliserte celler, vev eller isolerte mitokondrier. Den høyoppløselige oksygrafenheten er utstyrt med to kamre og bruker polarografiske oksygensensorer for å måle oksygenkonsentrasjon og beregne oksygenforbruk i hvert kammer. Oksygenforbruk beregnes ved hjelp av programvare og uttrykkes som picomoles per s per antall celler24. Innenfor hvert oksygrafkammer måler polarografiske oksygenelektroder oksygenkonsentrasjonen og beregner oksygenforbruk (fluks) i hvert kammer. Oksygenforbruk og konsentrasjon i kammeret vises i sanntid (figur 6). Ved tilsetning av spesifikke hemmere og substrater er de enkelte kompleksene i luftveiene målrettet for å måle deres aktivitet. Etter analysen analyseres dataene med programvaren. Fluksverdiene ble normalisert til citratsyntaseaktivitet. Oksygrafien ga lavere verdier for kompleks IV på grunn av delvis oksidert TMPD. I en serie tester fant vi at TMPD-bruken avvek med en faktor på 1,8. Denne faktoren ble brukt til å normalisere verdiene i figur 6.
Figur 6: Mitokondriell respirasjon i PBMCS etter kryopreservering sammenlignet med nymålt kontroll. En oppløsning inneholdende 1,6 x 107 celler/ml ble brukt til å måle oksygenforbruket til celler i en oksygraf. Respirasjonen ble målt 1 måned etter kryopreservering. For å undersøke aktiviteten til kompleksene i luftveiene ble flere hemmere, substrater og uncouplers tilsatt. Tilsetningen av et stoff ble gjort som følger: CI (L) = lekkasje respirasjon av kompleks I; CI(P) = koblet respirasjon av kompleks I; CI&CII(P) = fysiologisk respirasjon; CI&CII(U) = frakoblet respirasjon som viser maksimal aktivitet av kompleksene I og II; CII(U) = frakoblet respirasjon av kompleks II; CII(L) = lekkasjerespirasjon av kompleks II; CIV(U) = frakoblet respirasjon. En faktor på 1,8 ble brukt for å normalisere verdiene. Denne faktoren ble bestemt eksperimentelt for det nåværende oppsettet. Data vises som middel ± SEM (N = 10). Statistisk signifikans ble testet med Student t-test (*p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Endogen respirasjon bestemmes ved å tilsette 2 ml cellesuspensjon i kamrene. Fluxen med endogene substrater måles. For ytterligere å skille mellom komplekser er digitonin lagt til. Digitonin permeabiliserer plasmamembranen mens mitokondriemembranene forblir intakte. For å kompensere for protonlekkasje gjennom membranen, tilsettes substratene glutamat og malat. Respirasjonsratene på dette punktet illustrerer kompleks I-drevet respirasjon i fravær av koblet respirasjon. For å oppdage oksidativ fosforylering (OXPHOS) kapasitet av kompleks I ADP tilsettes, er respirasjonen nå i en koblet tilstand. Den koblede respirasjonen av CI og CII oppnås ved tilsetning av succinat. Nå fungerer åndedrettskjeden med maksimal kapasitet. Ved titrering av karbonylcyanid p-trifluormetoksyfenylhydrazon (FCCP) er elektrontransportkjeden (ETC) frakoblet. Med denne frakoblingen bestemmes den maksimale frakoblede aktiviteten til CI og CII. For å skille mellom CI og CII tilsettes kompleks I-spesifikk inhibitorrotenon. Ved tilsetning av oligomycin bestemmes lekkasjerespirasjonen av CII. For å utelukke oksygenforbruk av kilder som ikke er involvert i oksidativ fosforylering, tilsettes antibiotikumet antimycin A, og dette gjenværende oksygenforbruket trekkes fra alle avlesninger oppnådd i forsøket. Elektrondonoren N,N,N',N'-tetrametyl-p-fenylendiamedihydroklorid (TMPD; 0,5 mM) er et kunstig substrat for CIV. For å holde TMPD i redusert tilstand, brukes askorbat. Askorbat og TMPD brukes til å måle maksimal ukoblet respirasjon av CIV. Siden TMPD er utsatt for autooksidasjon, tilsettes NaN3 etter stabilisering av fluksen for å hemme CIV. Det gjenværende oksygenforbruket trekkes fra de rå CIV-verdiene. Figur 2 viser en typisk målekurve.
Parametrene som vises viser suksessen til teknikken. Teknikken ble utviklet for å utføre bioenergetiske målinger etter kryopreservering. De viste resultatene sammenligner cellene før og etter målingen, da ingen statistisk signifikante forskjeller kan sees, kan det antas at denne konserveringsmetoden er egnet for lagring over 1 måned.
Tabell 1: Løsninger, buffere og forbruksvarer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gjør det mulig å isolere og kryopreservere mononukleære celler (PBMC) fra humant blod på en måte som er egnet for bioenergetiske analyser. Den beskrevne metoden gir mulighet til å isolere PBMC forsiktig og i store mengder, med høy levedyktighet og tilstrekkelige celler for bioenergetiske målinger. Det har den ulempen at selv med minimale avbrudd oppstår lange isolasjoner, men etterfølgende kryopreservering tillater en tidsuavhengig måling av bioenergetikk. Med denne metoden kan prøver samles inn og måles på senere tidspunkter. Det er også egnet til å samle prøver i multisenterforsøk og måle parametere samtidig på et sentralt sted.
Kryopreservering gir muligheten til å lagre celler i lang tid og måle dem etterpå. Isoleringen av PBMC er en tidkrevende prosess på ca. 2-3 timer og gjør det bare mulig å ta et lite antall prøver samtidig. Det er ikke mulig for en enkelt eksperimentør å isolere ferske PBMC fra mer enn 2 personer samtidig uten tap av kvalitet. Behovet for å utføre oppfølgingsforsøk med friske celler kompliserer prosedyren og er dermed forbundet med ekstra stress og tidsproblemer. Å skille isolasjon fra utførelsen av forsøkene kan forenkle studier og gjøre testene mer standardiserte. Spesielt blodinnsamling, isolasjon, kryopreservering av en prøvekollektiv, etterfulgt av utførelsen av spesifikke eksperimenter. Prøver kan samles inn fra forskjellige steder og til forskjellige tider og deretter måles samtidig på samme sted.
Bioenergetikk spiller en viktig rolle i cellemetabolisme, forstyrret bioenergetikk som fører til mitokondriell dysfunksjon vil sannsynligvis spille en viktig rolle i aldring og deretter i nevrodegenerasjon og andre sykdommer25,26. Metodene beskrevet ovenfor kan brukes i nylig isolerte og kryopreserverte PBMCer for å overvåke endringer. Disse bioenergetiske målingene kan brukes som grunnlag for kliniske studier og forskning.
Det er flere begrensende faktorer ved denne teknikken, og fordeler og ulemper ved fersk måling kontra måling etter kryopreservering må veies. Kryopreservering er generelt svært krevende for PBMC; Derfor er det viktig å holde antall stressfaktorer så lave som mulig. Tid er avgjørende, da cellene skal bruke så lite tid som mulig i DMSO som er giftig for PBMC, bør hvert trinn være forberedt før tining eller frysing av celler med DMSO. Også for bioenergetiske målinger viste lagring i en fryser på -80 °C seg å være ineffektiv - prøvene må overføres til flytende nitrogen etter 24 timer. En kontrollert frysehastighet er obligatorisk hvis kjølingen er for rask, vannet som er igjen i cellene fryser og danner krystaller som skader cellemembraner og rom. For langsom kjølehastighet fører til langvarig kontakt med giftig DMSO. Cellefrysere som bruker isopropanol kan oppnå en frysehastighet på 1 °C/min i en fryser på -80 °C. Tining og gjenfrysing av PBMC bør unngås.
Denne protokollen beskriver isolering og kryopreservering av PBMC. For å bekrefte funksjonaliteten til PBMCene etter bevaring for bioenergetiske målinger ble det utført eksemplariske målinger av bioenergetikk. Denne protokollen er optimalisert for måling av bioenergetiske faktorer. Bioenergetiske faktorer kan bestemmes etter kryopreservering, men det kan også bestemmes for andre protokoller om målinger er mulig etter kryopreservering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker det kliniske teamet ved Universitetssykehuset Giessen-Marburg for blodinnsamlingen. Dette arbeidet ble finansiert av Justus Liebig-universitetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | - | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | - | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | - | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | - | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | - | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | - | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | - | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | - | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | - | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | - | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al.
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M.
