Summary
Células mononucleares isoladas do sangue periférico podem ser usadas para a análise de funções e distúrbios imunológicos, doenças metabólicas ou funções mitocondriais. Neste trabalho, descrevemos um método padronizado para o preparo de CMSP a partir de sangue total e posterior criopreservação. A criopreservação torna esse tempo e lugar independentes.
Abstract
As funções fisiológicas das células eucarióticas dependem da energia fornecida principalmente pelas mitocôndrias. A disfunção mitocondrial está ligada a doenças metabólicas e ao envelhecimento. A fosforilação oxidativa desempenha um papel decisivo, pois é crucial para a manutenção da homeostase energética. PBMCs foram identificados como uma amostra minimamente invasiva para medir a função mitocondrial e demonstraram refletir condições da doença. No entanto, a mensuração da função bioenergética mitocondrial pode ser limitada por vários fatores em amostras humanas. As limitações são a quantidade de amostras coletadas, o tempo de amostragem, que muitas vezes é distribuído por vários dias, e os locais. A criopreservação das amostras coletadas pode garantir a coleta e a medição consistentes das amostras. Deve-se tomar cuidado para garantir que os parâmetros medidos sejam comparáveis entre células criopreservadas e recém-preparadas. Aqui, descrevemos métodos de isolamento e criopreservação de CMSP de amostras de sangue humano para analisar a função bioenergética das mitocôndrias nessas células. As CMSP criopreservadas de acordo com o protocolo aqui descrito mostram apenas pequenas diferenças no número e viabilidade celular, nos níveis de trifosfato de adenosina e na atividade da cadeia respiratória medida em comparação com células recém-colhidas. Apenas 8-24 mL de sangue humano são necessários para as preparações descritas, tornando possível coletar amostras durante estudos clínicos multicentralmente e determinar sua bioenergética no local.
Introduction
As células mononucleares do sangue periférico humano (CMSP) são utilizadas para diversas aplicações em diversos campos científicos, incluindo o estudo de questões imunológicas e bioenergéticas, como aquelas relacionadas a processos de envelhecimento ou doenças degenerativas 1,2. As CMSP são heterogêneas em composição e consistem de linfócitos (células B, células T e células NK), monócitos e células dendríticas. As células às vezes mostram grandes diferenças individuais e variações dentro de um sujeito, então procedimentos padronizados para lidar com essas células são necessários. Parâmetros importantes como viabilidade e pureza do isolamento são os requisitos básicos para seu manuseio e são adicionalmente influenciados por fatores ambientais como o tempo de coleta, o nível de melatonina, se o indivíduo está em jejum, entre outros 3,4.
Com base em estudos sobre bioenergética de CMSP, descrevemos aqui um método para o isolamento, criopreserva e cultivo de CMSP que também é adequado para outros métodos. Enquanto a biópsia muscular é considerada o padrão-ouro para o metabolismo energético mitocondrial5, o exame das células sanguíneas é um procedimento rápido e minimamente invasivo. Além disso, cada vez mais estudos sugerem que as alterações da função mitocondrial no envelhecimento e na doença de Alzheimer (DA) ocorrem não só no cérebro, mas também na periferia6,7,8,9,10. O método também permite a investigação de outras condições e doenças, incluindo diabetes mellitus e obesidade11,12,13. Padrões de expressão gênica em pacientes com esclerose múltipla podem ser analisados, assim como a função imune e suas influências em geral 14,15,16.
As CMSP geralmente dependem da fosforilação oxidativa (OXPHOS) para gerar adenosina trifosfato (ATP)17,18. Portanto, os PBMCs cobrem uma ampla gama de aplicações como substitutos. Em relatos anteriores, o metabolismo energético das CMSP tem sido utilizado para tratar disfunções orgânicas, como na insuficiência cardíaca precoce19, choque séptico20 ou diferenças associadas ao sexo4 na função mitocondrial. Um método generalizado para isolamento criopreservacional e cultivo de CMSP teria vantagens na comparabilidade dos resultados obtidos em diferentes institutos. Há grande variação nos protocolos para cadaetapa21,22, o objetivo desse método é fornecer uma diretriz para medidas bioenergéticas em CMSP.
Neste artigo descrevemos um método para mensuração de parâmetros bioenergéticos em CMSP. Explicamos os métodos para isolar, criopinar e medir a bioenergética de CMSP do sangue humano. Este método pode ser usado para determinar parâmetros bioenergéticos em pacientes e avaliá-los em um contexto clínico. Para aplicar essas medidas, os pesquisadores precisam ter acesso a uma população de pacientes a partir da qual amostras de sangue fresco podem ser obtidas.
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Protocol
Todos os protocolos descritos neste manuscrito para coleta, isolamento e análise de sangue foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Giessen, Alemanha. Obteve-se o consentimento dos pacientes para inclusão de suas amostras no estudo. Todas as etapas de isolamento e cultura celular são realizadas sob um gabinete de segurança biológica.
1. Punção venosa
- Preparar todo o equipamento necessário para a coleta de sangue, incluindo spray de desinfecção, swab estéril, cânula de coleta de sangue com tubo de 80 mm e multi-adaptador, torniquete/manguito de pressão arterial, Monovette 9 mL de lítio-heparina.
NOTA: EDTA como um anticoagulante também é eficaz. - Coletar sangue da veia do braço mais apropriada, geralmente vena mediana cubiti ou veia cefálica.
- Aplicar um torniquete/manguito de pressão arterial com leve pressão, em torno de 80 mm/Hg.
- Desinfete luvas e local de punção com spray desinfetante contendo álcool. Deixe o local de punção desinfetado secar ao ar.
- As veias se projetam devido à pressão do manguito de pressão. Inserir a agulha (diâmetro da cânula (exterior) 21G / 0,8 mm, comprimento 19 mm) em um ângulo de 15°-20° da veia tentando evitar trauma e minimizando a sondagem.
- Tome sangue com sistema apropriado, 4 tubos contendo 9 mL de sangue (mais de 7-8 tubos são problemáticos para um experimentador isolar corretamente).
- Após a coleta de sangue, colocar os tubos de coleta no escuro por 5 min para garantir uma anticoagulação uniforme.
2. Isolamento do PBMC
- Prepare todas as soluções necessárias conforme descrito abaixo.
- Levar a solução salina balanceada de Dulbecco (DPBS; concentração 1x) e o meio de isolamento de linfócitos (1,077 g/mL) à temperatura ambiente (20-25 °C).
- Preparar soro fetal bovino (SFB) à temperatura ambiente e manter um tubo cônico estéril de 50 mL com FBS sobre gelo. Para cada amostra de sangue, são necessários 2 mL de FBS.
- Conservar o recipiente de congelação a 4 °C e pré-arrefecer os criotubos a 4 °C.
- Meio de cultura de células aquecidas a 37 °C, o meio consiste de RPMI 1640 com 50 mL de FBS e penicilina 50 U/mL estreptomicina 50 U/mL. Esta solução pode ser armazenada a 3 °C por até 2 meses.
- Adicionar 8 mL de DPBS em tubos cônicos estéreis de 50 mL. Adicionar 15 mL de meio de isolamento de linfócitos em tubo cônico estéril de 50 mL (O meio é sensível à luz, adicione-o antes de iniciar o isolamento).
- Adicione 8 ml de sangue a 8 ml de DPBS e, misture cuidadosamente com uma pipeta de plástico Pasteur de 3 ml.
- Coloque o sangue/DPBS misturando suavemente com uma pipeta plástica de Pasteur de 3 mL sobre o meio de isolamento de linfócitos. Para aplicar a primeira camada no meio, incline o tubo 20°-30°, o que resultará em menor penetração da mistura sangue-PBS na camada média.
- Coloque cuidadosamente a mistura sangue-PBS sobre a parede lateral do tubo sobre o meio de isolamento de linfócitos. Use uma velocidade constante para manter o fluxo sanguíneo constante.
- Na próxima etapa, traga o tubo lentamente para uma posição vertical, o sangue restante é cuidadosamente colocado sobre a parede lateral do tubo na camada de sangue.
- Centrifugar por 10 min a 1000 x g à temperatura ambiente em uma centrífuga com rotor de caçamba oscilante com freios desligados. Após a centrifugação, a mistura sangue/CMSP é separada em quatro camadas. A camada superior é composta por plasma e plaquetas, a segunda camada é a camada PBMC, seguida por uma camada média de isolamento de linfócitos e, finalmente, eritrócitos e granulócitos na camada inferior. As diferentes camadas são exibidas na Figura 1.
- Retire 2/3 da camada de plasma com uma pipeta plástica Pasteur.
- Com pipeta de 1 mL, colete as CMSP na camada média de isolamento de linfócitos, tomando cuidado para não obter nenhum meio na amostra.
- Coloque a ponta 1 mm acima da camada PBMC. A camada de CMSP não deve ser puncionada, caso contrário o meio fluirá sobre as células. A sucção da pipeta puxa os PBMCs até este ponto para que eles possam ser coletados várias vezes neste ponto.
NOTA: Para maximizar o número de PBMCs coletados, no final do procedimento procure o restante na superfície e tente coletar as células lá também. Para estabilizar o procedimento, o tubo pode ser colocado em uma superfície. - Transfira passo a CMSP para um novo tubo de 50 mL até que a camada seja completamente colhida. Adicione DPBS até a marca de 25 mL, lave o meio de isolamento de linfócitos e outros resíduos.
- Centrifugar por 10 min a 100 x g à temperatura ambiente com os freios ligados. Remova o sobrenadante com uma bomba de vácuo ou similar, tome cuidado para não danificar o pellet celular.
- Ressuspender o pellet em 1 mL de DPBS e somar o DPBS até a marca de 25 mL. Repita a lavagem mais uma vez e, em seguida, ressuspenda em meio apropriado para os próximos passos.
Figura 1: Representação esquemática de uma centrifugação por gradiente de densidade para ilustrar as diferentes camadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Criopreservação
- Resfriar um recipiente de congelamento a 4 °C, resfriar o FBS no gelo.
- Ressuspenda a pastilha de PBMC em 1 mL de FBS com uma pipeta de 1 mL, a FBS deve estar à temperatura ambiente.
- Misture DMSO com FBS pré-resfriado em gelo 1:5, concentração final 20% DMSO em seguida, coloque a mistura FBS: DMSO de volta no gelo. Prepare sempre a solução fresca.
- Transfira a suspensão de células PBMC em FBS para criotubos de 2 mL bem marcados. Use um criotubo por tubo de coleta. Ajuste o número de células entre 1 x 107 e 5 x 107 por mL. Use um contador de células automatizado para determinar a contagem e a viabilidade de células.
- Adicione 1 mL de FBS: DMSO mistura gota a gota com uma pipeta de 1 mL, aproximadamente 1-2 gotas por s, no tubo. A adição dropwise leva a uma mistura contínua e consistente.
- Coloque os tubos no recipiente de congelamento pré-resfriado. Coloque o recipiente de congelação num congelador a -80 °C durante 24 horas. O recipiente de congelamento fornece um resfriamento controlado de -1 °C por minuto.
- Retire os tubos do congelador a -80 °C. Após a remoção do congelador armazenar os tubos na fase gasosa de nitrogênio líquido. Documente o local de cada amostra.
4. Descongelamento
- Preparar todas as soluções necessárias: Meio de cultura celular RPMI 1640 com 50 mL de SFB e penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 U/mL. Esta solução pode ser armazenada a 3°C por até 2 meses.
- Meio de cultura celular pré-aquecido a 37 °C. Adicionar 3 mL de meio de cultura celular pré-aquecido em tubos cônicos estéreis de 50 mL.
- Remova a amostra do tanque de nitrogênio líquido. Descongelar as amostras em banho-maria a 37 °C por aproximadamente 3,5 min, retirar do banho-maria assim que o último gelo estiver derretendo. Um pedaço de gelo do tamanho de uma cabeça de alfinete ainda deve ser visível no tubo.
NOTA: DMSO é prejudicial para PBMCs trabalhar o mais rápido possível. - Remova a mistura de célula:FBS:DMSO com uma pipeta de 1 mL do criotubo. Misturar as amostras de PBMC com o meio de cultura celular nos tubos de 50 mL preparados. Lave os tubos com 5 mL de meio de cultura em três etapas de 2 mL, 2 mL e 1 mL.
- Transfira o meio para os tubos. Isso é realizado para transferir possíveis resíduos celulares. Centrifugar durante 10 min a 100 x g à temperatura ambiente.
- Eliminar o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio adequado para utilização planeada. As células estão prontas para experimentos subsequentes.
NOTA: No entanto, com testes funcionais em células frescas ou congeladas, um período de repouso em uma incubadora (normalmente durante a noite) é frequentemente recomendado após o isolamento de linfócitos com base em meio de isolamento ou descongelamento celular.
5. Cultura celular
- Após o isolamento ou descongelamento das células de cultura durante a noite a 37 °C em 5% CO2/95% ar.
- Ressuspender as células em 1 mL de meio RPMI suplementado com SFB a 10%, penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 U/mL. Para uso posterior há muitas possibilidades, tratar as células conforme necessário para os ensaios.
- Para armazenamento geral utilizar placas de cultura celular estéreis de 6 poços e células de colheita após o período de repouso. Transfira 1 mL de suspensão celular com uma pipeta de 1 mL para um poço e adicione 4 mL de meio de cultura celular.
NOTA: A quantidade de CMSP isoladas varia muito entre os indivíduos, um poço com 5 mL de meio de cultura celular é suficiente para cada 8 mL de sangue isolado. No entanto, ao isolar PBMCs de buffy coats, a quantidade de PBMCs é significativamente maior do que em amostras de sangue total e, portanto, as células devem ser divididas em vários poços. - Deixar as células descansarem 24 h em atmosfera umidificada suplementada com 5% de CO2 a 37 °C. Esta incubação é realizada para células recém-isoladas, bem como para células criopreservadas.
6. Ensaio de ATP
- Ressuspender CMSP descongeladas em 1 mL de meio RPMI suplementado com SFB a 10%, penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 U/mL.
- Pegue uma amostra e determine a contagem de células e, em seguida, execute uma discriminação de mortos-vivos com azul de tripano. Retirar 10 μL das células ressuspensas e misturar com meio de cultura celular de 90 μL. Em seguida, tome 10 μL e misture com 10 μL de azul de tripano. Coloque as células em uma câmara de contagem de células ou em um contador automático de células e determine o número de células vivas/mortas.
- Placa de 100 μL de células a uma densidade de 1 x 105 células/100 μL por poço em uma placa de poliestireno branco de 96 poços.
- Deixar as células descansarem durante 24 h numa atmosfera humidificada suplementada com 5% de CO2 a 37 °C.
- Determine as concentrações de ATP com um ensaio de ATP.
- Use a emissão de luz que ocorre quando o ATP é combinado com luciferina. A luz emitida pode ser avaliada com um leitor de placas. Retire as placas para a incubadora arrefecer até à temperatura ambiente durante 15 minutos. Lise as células e deixe-as por 5 min. Em seguida, aplique o reagente de monitoramento nas células e meça de acordo com as instruções do fabricante. Um padrão interno é usado para determinar o nível de ATP.
7. Respirometria de alta resolução
- Ligue o oxígrafo de alta resolução e deixe esquentar por 30 min.
- Tratar as células de acordo com um protocolo descrito na Figura 1. Prepare todos os estoques necessários, conforme Tabela 1.
- Pipetar 2,1 mL de tampão respiratório (Tabela 1) em ambas as câmaras oxigráficas de alta resolução e agitar o tampão continuamente usando uma barra de agitação magnética presente nas câmaras (750 rpm) a 37 °C por 30 min até obter um sinal estável de fluxo de oxigênio do sensor polarográfico de oxigênio.
NOTA: Nas câmaras do oxígrafo, o consumo de oxigênio em tempo real (fluxo) e a saturação de oxigênio da câmara são medidos com o auxílio de eletrodos polarográficos de oxigênio. A calibração de fundo deve ser realizada para evitar ruídos de fundo e garantir resultados confiáveis. - Realizar calibração a ar do sensor polarográfico de oxigênio de acordo com os protocolos do fabricante23.
- Ressuspender CMSP isoladas em 1 mL de meio de respiração mitocondrial (MIR05, a composição é mostrada na Tabela 1) e diluir para 8 x 106 células/mL.
- Após a calibração do ar, aspirar o meio respiratório da câmara oxigráfica e adicionar 2,1 mL de suspensão celular em cada camber do respirômetro. Se necessário, durante a medição, reoxigenar as câmaras (ver Abrir no ponto h na Figura 2), a saturação de oxigênio das câmaras não deve cair abaixo de 100 μM.
- Feche as câmaras inserindo as rolhas, as câmaras são projetadas para conter 2,0 mL de volume. Aspirar a suspensão de células emergentes.
- Misture continuamente a suspensão celular a 37 °C com um agitador magnético (750 rpm) localizado na câmara. Aguarde cerca de 20 minutos até que um sinal estável seja obtido. Determinar a respiração endógena (a) na Figura 2).
- Para determinar as diferentes atividades complexas da cadeia respiratória, injetar os substratos e inibidores da respiração mitocondrial através das portas de injeção de titânio das rolhas. Use a seguinte concentração final na câmara.
- Para romper as membranas celulares, adicionar 5 μL de digitonina 8,1 mM, através da porta de injeção de titânio da rolha da câmara, para remover substratos virgens (b) na Figura 2 , enquanto as membranas mitocondriais permanecem intactas.
- Adicionar substratos 2 M glutamato e 800 mM malato através da porta de injeção da rolha da câmara e registrar a respiração até que um sinal estável seja alcançado. O sinal estabiliza após 2-4 min.
NOTA: Também é possível usar substratos adicionais como o piruvato. - Adicionar 8 μL de difosfato de adenosina (ADP) 500 mM através da porta de injeção da rolha da câmara e registar a respiração até obter um sinal estável. O sinal estabiliza após 2-4 min (d) na Figura 2.
- Adicionar 20 μL de succinato de 1 M através da porta de injeção da rolha da câmara e registar a respiração até se obter um sinal estável. O sinal estabiliza após 2-4 min(e) na Figura 2.
- Titular 1 M de cianeto de carbonila p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) gradualmente a 0,5 μL até ao ponto em que não ocorra qualquer aumento adicional. Aguarde 2-4 min até que o sinal se estabilize (f) na Figura 2. Quando não houver mais aumento na respiração, continue com o próximo passo.
CUIDADO: Tenha cuidado ao manusear o FCCP, pois ele oferece riscos à saúde humana. - Adicionar 5 μL de rotenona 0,1 mM através da porta de injeção da rolha da câmara e registar a respiração até obter um sinal estável. O sinal estabiliza após 2-4 min (g) na Figura 2.
CUIDADO: Tenha cuidado ao manusear a rotenona, pois ela oferece riscos à saúde humana. - Adicionar 1 μL de oligomicina 4 mg/mL através da porta de injeção da rolha da câmara e registrar a respiração até que um sinal estável seja alcançado. O sinal estabiliza após 2-4 min (h) na Figura 2.
CUIDADO: Tenha cuidado ao manusear oligomicina, pois é um veneno que oferece riscos à saúde humana. - Adicionar 1 μL de antimicina A 5 mM através da porta de injeção da rolha da câmara e registar a respiração até se obter um sinal estável. O sinal estabiliza após 2-4 min (i) na Figura 2.
CUIDADO: Tenha cuidado ao manusear a antimicina A, pois é um veneno que oferece riscos à saúde humana. - Ao avaliar a corrida para excluir o consumo de oxigênio de enzimas não envolvidas na fosforilação oxidativa, subtraia os valores de antimicina A de todos os outros valores medidos.
- Adicionar 200 mM N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenodiamina dicloridrato (TMPD; doador de elétrons) e 800 mM ascorbato para manter a TMPD em um estado reduzido. Injetar os substratos através da porta de injeção da rolha da câmara e registrar a respiração até que um sinal estável seja alcançado. O sinal estabiliza após 2-4 min (j) na Figura 2.
- A TMPD está sujeita à autooxidação, portanto, subtraia o consumo de oxigênio resultante do valor medido no Complexo IV.
- Adicionar NaN3 ≥ 100 mM através da porta de injeção da rolha da câmara e registrar a respiração até que um sinal estável seja alcançado. O sinal se estabiliza após 2-4 min para inibir a atividade do complexo IV, restando apenas a auto-oxidação da TMPD.
CUIDADO: Tenha cuidado ao manusear a azida sódica, pois é um veneno que oferece riscos à saúde humana.
Figura 2: Curso esquemático do fluxo O2 . O curso esquemático do fluxo de oxigênio é mostrado. A curva é dividida nas diferentes fases após a adição de inibidores e substratos de a-k. a: respiração endógena; b: células permeabilizadas; c: respiração do complexo I desacoplado; d: respiração acoplada ao complexo I; e: OXFOS ; f: atividade máxima não acoplada de IC e CII; g: respiração desacoplado do complexo II; h: respiração de vazamento; i: respiração residual; j: Respiração desacoplado do CIV(U) e autooxidação da TMPD; k: autooxidação da TMPD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
8. Atividade da citrato sintase
- Meça a atividade da citrato sintase como um parâmetro separado e use-o para normalizar as medidas do oxígrafo de alta resolução.
- Ressuspender CMSP isoladas em 1 mL de meio de respiração mitocondrial (MIR05) e diluir para 8 x 106 células/mL.
- Congelar em azoto líquido e armazenar a -80 °C até à realização de experiências ou para medir células frescas.
- Preparar todas as soluções necessárias: tampão 0,1 M de trietanolamina HCl pH 8,0, tampão Tris-HCl 1,0 M pH = 8,1, 10% Triton X-100, 10 mM Oxacetato em tampão de HCl trietanolamina 0,1 M pH 8,0, DTNB 1,01 mM em tampão Tris-HCl 1,0 M pH = 8,1, acetil-CoA 12,2 mM em duplo destilado H2O.
- Preparar meio de reacção (Quadro 1) contendo 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobezoico) (DTNB; 0,1 mM), acetilcoenzima A (0,31 mM), EDTA (50 μM), trietanolamina HCl (5 mM) e Tris HCl (0,1 M).
- Preparar o reagente de partida (quadro 1) com oxaloacetato 0,5 mM dissolvido em H2O bidestilado.
- Descongele as amostras no gelo, pois a citrato sintase é instável se descongelada muito rapidamente.
- Adicionar 40 μL das amostras a uma placa de 96 poços sobre gelo antes de adicionar 110 μL de meio de reação com uma multipipeta.
- Meio de reacção quente e amostra numa incubadora a 30 °C durante 5 min. Reagente de arranque morno em banho-maria a 30 °C durante 5 min.
- Adicionar 50 μL do reagente de partida com uma multipipeta a cada poço. Meça a absorbância a 30 °C a um comprimento de onda de 412 nm durante 20 minutos através de um leitor de placas.
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Representative Results
Viabilidade e número de células
Para obter sucesso no isolamento e criopreservação, a contagem e a viabilidade celular devem ser as mais altas possíveis. Antes e depois da criopreservação, as células são contadas, e sua viabilidade é determinada para garantir a saúde e a qualidade das células. A Figura 3 é uma ilustração representativa das CMSP antes e após a criopreservação, a contagem de células e a viabilidade dificilmente diferem. Isso indica o isolamento e a preservação bem-sucedidos dos PBMCs.
Figura 3: Efeito da criopreservação sobre o número e a viabilidade celular. Os grupos teste são divididos em grupo controle com CMSP recém-isoladas e CMSP após 1 mês de criopreservação. A contagem das células e a determinação de sua viabilidade foram realizadas com contador automático de células. O azul de tripano foi utilizado para determinar a viabilidade. Cada medida foi realizada como uma triplicata do valor médio foi calculado a partir dos resultados das medidas individuais. (A) Determinação da viabilidade celular de CMSP após isolamento a fresco e após 1 mês de criopreservação. Os valores são dados como média ± EPM. As significâncias foram determinadas com um teste t pareado. (B) Determinação do número de células das CMSP após isolamento a fresco e após 1 mês de criopreservação. Os valores são dados como médias ± EPM. As significâncias foram determinadas com um teste t pareado. A mesma forma e cor mostram a mesma amostra antes e após um mês de criopreservação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O ATP representa a principal fonte de energia para as células eucarióticas. O ATP é determinado através de um sistema de ensaio de luminescência. Se a criopreservação for bem-sucedida, o ATP entre células recém-isoladas e células criopreservadas não deve diferir. A Figura 4 é uma ilustração representativa das CMSP antes e após a criopreservação; Os níveis de ATP são semelhantes. Isso indica o isolamento e a preservação bem-sucedidos dos PBMCs.
Figura 4: Comparação da concentração de ATP dos diferentes períodos de criopreservação. Concentração de ATP (μM / 100.000 células) em CMSP. Os grupos teste são divididos em grupo controle com CMSP recém-isoladas e CMSP após 1 mês de criopreservação. As amostras foram coletadas ao mesmo tempo e, em seguida, armazenadas criologicamente ou medidas após o isolamento. Um teste t pareado foi realizado para testar diferenças significativas; O resultado mostrou que as diferenças não foram significativas. Os valores são apresentados como valores médios ± EPM (N = 13). A mesma forma e cor mostram a mesma amostra antes e após um mês de criopreservação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A citrato sintase (CS) é uma enzima-chave do ciclo do citrato, localizada nas mitocôndrias. Portanto, a atividade do CS representa um marcador robusto de massa mitocondrial. A atividade do CS é determinada com base na conversão de DTNB em TNB. A Figura 5 mostra que antes e após a criopreservação, os valores de CS não diferem nas CMSP. Novamente, isso indica um isolamento e preservação bem-sucedidos dos PBMCs.
Figura 5: Efeito da criopreservação sobre a atividade da citrato sintase. Atividade da citrato sintase em CMSP após 1 mês de criopreservação em comparação com o controle recém-medido. As amostras foram coletadas ao mesmo tempo e, em seguida, armazenadas criologicamente ou medidas após o isolamento. Os valores estão expressos como média ± EPM (N = 8). As significâncias foram determinadas com o teste t pareado. A mesma forma e cor mostram a mesma amostra antes e após um mês de criopreservação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os perfis bioenergéticos das CMSP podem ser determinados usando sensores polarográficos de oxigênio, por exemplo, em oxígrafo de alta resolução. O consumo celular de oxigênio é medido em um sistema de câmara fechada com resolução e sensibilidade muito altas em amostras biológicas, por exemplo, células intactas e permeabilizadas, tecidos ou mitocôndrias isoladas. O dispositivo de oxígrafo de alta resolução é equipado com duas câmaras e usa sensores polarográficos de oxigênio para medir a concentração de oxigênio e calcular o consumo de oxigênio dentro de cada câmara. As taxas de consumo de oxigênio são calculadas por software e expressas em picomoles por s por número de células24. Dentro de cada câmara oxigráfica, eletrodos polarográficos de oxigênio medem a concentração de oxigênio e calculam o consumo (fluxo) de oxigênio dentro de cada câmara. O consumo e a concentração de oxigênio na câmara são apresentados em tempo real (Figura 6). Com a adição de inibidores e substratos específicos, os complexos individuais da cadeia respiratória são visados para medir sua atividade. Após o ensaio, os dados são analisados com o software. Os valores de fluxo foram normalizados para atividade de citrato sintase. A oxigrafia proporcionou menores valores para o complexo IV devido à DTMP parcialmente oxidada. Em uma série de testes, verificou-se que a TMPD utilizada desviou-se por um fator de 1,8. Esse fator foi utilizado para normalizar os valores da Figura 6.
Figura 6: Respiração mitocondrial em CMSP após criopreservação comparada ao controle recém-medido. Uma solução contendo 1,6 x 107 células/mL foi utilizada para medir o consumo de oxigênio das células em um oxígrafo. A respiração foi medida 1 mês após a criopreservação. Para investigar a atividade dos complexos na cadeia respiratória foram adicionados vários inibidores, substratos e desacopladores. A adição de uma substância foi feita da seguinte forma: IC(L) = respiração de vazamento do complexo I; IC(P) = respiração acoplada do complexo I; IC&ICI(P) = respiração fisiológica; IC&CII(U) = respiração desacoplado exibindo atividade máxima dos complexos I e II; CII(U) = respiração desacoplado do complexo II; CII(L) = respiração de vazamento do complexo II; CIV(U) = respiração desacoplada. Um fator de 1,8 foi utilizado para normalizar os valores. Esse fator foi determinado experimentalmente para o presente montante. Os dados são apresentados como a média ± EPM (N = 10). A significância estatística foi testada pelo teste t de Student (*p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A respiração endógena é determinada pela adição de 2 mL de suspensão celular nas câmaras. O fluxo com substratos endógenos é medido. Para distinguir ainda mais entre complexos digitonin é adicionado. A digitonina permeabiliza a membrana plasmática enquanto as membranas mitocondriais permanecem intactas. Para compensar o vazamento de prótons através da membrana, são adicionados substratos glutamato e malato. As taxas de respiração neste ponto ilustram a respiração complexa conduzida por I na ausência de respiração acoplada. Para detectar a capacidade de fosforilação oxidativa (OXPHOS) do complexo I ADP é adicionada, a respiração está agora em um estado acoplado. A respiração acoplada de IC e CII é obtida pela adição de succinato. Agora, a cadeia respiratória trabalha na capacidade máxima. Com a titulação de cianeto de carbonila p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP), a cadeia de transporte de elétrons (ETC) é desacoplada. Com esse desacoplamento, determina-se a atividade máxima não acoplada de IC e CII. Para diferenciar entre IC e ICI é adicionado o inibidor específico do complexo I rotenona. Pela adição de oligomicina, a respiração de vazamento de CII é determinada. Para excluir o consumo de oxigênio por fontes não envolvidas na fosforilação oxidativa, o antibiótico antimicina A é adicionado e esse consumo residual de oxigênio é subtraído de todas as leituras obtidas no experimento. O doador de elétrons N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenodiamina dicloridrato (TMPD; 0,5 mM) é um substrato artificial para CIV. Para manter a TMPD em um estado reduzido, o ascorbato é usado. Ascorbato e TMPD são usados para medir a respiração máxima desacoplado da CIV. Como a TMPD está sujeita à auto-oxidação, NaN3 é adicionado após a estabilização do fluxo para inibir a CIV. O consumo restante de oxigênio é subtraído dos valores brutos de CIV. A Figura 2 mostra uma curva de medida típica.
Os parâmetros apresentados mostram o sucesso da técnica. A técnica foi desenvolvida para realizar medidas bioenergéticas após criopreservação. Os resultados apresentados comparam as células antes e após a medição, como não podem ser observadas diferenças estatisticamente significativas, pode-se supor que este método de preservação seja adequado para armazenamento ao longo de 1 mês.
Tabela 1: Soluções, buffers e consumíveis. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Este protocolo fornece um meio de isolar e criopreservar células mononucleares do sangue periférico (CMSP) do sangue humano de forma adequada para análises bioenergéticas. O método descrito oferece a possibilidade de isolar CMSP suavemente e em grandes quantidades, com alta viabilidade e células suficientes para medidas bioenergéticas. Tem a desvantagem de que, mesmo com interrupções mínimas, ocorrem longos isolamentos, mas a criopreservação subsequente permite uma medição independente do tempo da bioenergética. Com este método, as amostras podem ser coletadas e medidas em momentos posteriores. Também é adequado para coletar amostras em ensaios multicêntricos e medir parâmetros ao mesmo tempo em um local central.
A criopreservação oferece a possibilidade de armazenar células por um longo período de tempo e medi-las posteriormente. O isolamento de PBMCs é um processo demorado de cerca de 2-3 h e permite apenas que um pequeno número de amostras seja coletado de uma só vez. Não é possível para um único experimentador isolar PBMCs frescos de mais de 2 indivíduos simultaneamente sem perda de qualidade. A necessidade de realizar experimentos de acompanhamento com células frescas complica o procedimento e, portanto, está associada a estresse adicional e problemas de tempo. Separar o isolamento da realização dos experimentos pode simplificar os estudos e tornar os testes mais padronizados. Especificamente, coleta de sangue, isolamento, criopreservação de uma amostra coletiva, seguida da realização de experimentos específicos. As amostras podem ser coletadas de diferentes locais e em diferentes momentos e, em seguida, medidas ao mesmo tempo no mesmo local.
A bioenergética desempenha um papel essencial no metabolismo celular, a bioenergética perturbada levando à disfunção mitocondrial provavelmente desempenha um papel importante no envelhecimento e, subsequentemente, na neurodegeneração e outras doenças 25,26. Os métodos descritos acima podem ser usados em CMSP recém-isoladas e criopreservadas para monitorar mudanças. Essas medidas bioenergéticas podem ser usadas como base para estudos e pesquisas clínicas.
Existem vários fatores limitantes para esta técnica e as vantagens e desvantagens da medição a fresco versus a medida após criopreservação devem ser ponderadas. A criopreservação é geralmente muito exigente para PBMCs; Portanto, é importante manter o número de estressores o mais baixo possível. O tempo é essencial, pois as células devem passar o menor tempo possível em DMSO, que é tóxico para PBMCs, cada etapa deve ser preparada antes de descongelar ou congelar as células com DMSO. Além disso, para medições bioenergéticas, o armazenamento em um freezer de -80 °C mostrou-se ineficaz - as amostras devem ser transferidas para nitrogênio líquido após 24 h. Uma taxa de congelamento controlada é obrigatória se o resfriamento for muito rápido, a água restante nas células congela e forma cristais danificando as membranas e compartimentos celulares. Uma taxa de resfriamento muito lenta leva ao contato prolongado com o DMSO tóxico. Os congeladores de células que usam isopropanol podem atingir uma taxa de congelamento de 1 °C/min em um freezer de -80 °C. O descongelamento e o recongelamento de PBMCs devem ser evitados.
Este protocolo descreve o isolamento e criopreservação de CMSP. A fim de confirmar a funcionalidade das CMSP após a preservação para medidas bioenergéticas, medidas exemplares de bioenergética foram realizadas. Este protocolo foi otimizado para a mensuração de fatores bioenergéticos. Fatores bioenergéticos podem ser determinados após a criopreservação, mas também pode ser determinado para outros protocolos se as medidas são possíveis após a criopreservação.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos à equipe clínica do Hospital Universitário Giessen-Marburg pela coleta de sangue. Este trabalho foi financiado pela universidade Justus Liebig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | - | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | - | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | - | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | - | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | - | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | - | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | - | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | - | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | - | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | - | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
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