Summary
Изолированные мононуклеарные клетки периферической крови могут быть использованы для анализа иммунных функций и нарушений, метаболических заболеваний или митохондриальных функций. В данной работе описан стандартизированный метод получения МПМК из цельной крови и последующей криоконсервации. Криоконсервация делает это время и место независимым.
Abstract
Физиологические функции эукариотических клеток зависят от энергии, в основном обеспечиваемой митохондриями. Митохондриальная дисфункция связана с метаболическими заболеваниями и старением. Окислительное фосфорилирование играет решающую роль, так как оно имеет решающее значение для поддержания энергетического гомеостаза. PBMC были идентифицированы как минимально инвазивный образец для измерения митохондриальной функции и, как было показано, отражают состояние заболевания. Однако измерение биоэнергетической функции митохондрий может быть ограничено несколькими факторами в образцах человека. Ограничениями являются количество взятых проб, время отбора проб, которое часто растягивается на несколько дней, и местоположение. Криоконсервация собранных образцов может обеспечить последовательный сбор и измерение образцов. Следует позаботиться о том, чтобы измеренные параметры были сопоставимы между криоконсервированными и свежеприготовленными клетками. В этой статье мы опишем методы выделения и криоконсервации МПМК из образцов крови человека для анализа биоэнергетической функции митохондрий в этих клетках. Криоконсервированные PBMC в соответствии с протоколом, описанным здесь, показывают лишь незначительные различия в количестве и жизнеспособности клеток, уровнях аденозинтрифосфата и измеренной активности дыхательной цепи по сравнению со свежесобранными клетками. Для описываемых препаратов необходимо всего 8-24 мл человеческой крови, что позволяет проводить многоцентральный отбор образцов в ходе клинических исследований и определять их биоэнергетику на месте.
Introduction
Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МПКМ) используются для различных применений во многих научных областях, включая изучение иммунологических и биоэнергетических проблем, таких как те, которые связаны с процессами старения или дегенеративными заболеваниями 1,2. ПБМК неоднородны по составу и состоят из лимфоцитов (В-клеток, Т-клеток и NK-клеток), моноцитов и дендритных клеток. Клетки иногда демонстрируют большие индивидуальные различия и вариации в пределах одного субъекта, поэтому требуются стандартизированные процедуры для работы с этими клетками. Такие важные параметры, как жизнеспособность и чистота изолятора, являются основными требованиями к обращению с ним и дополнительно зависят от факторов окружающей среды, таких как время сбора, уровень мелатонина, голодает ли испытуемый и др. 3,4.
Основываясь на исследованиях биоэнергетики МПМК, мы описываем здесь метод выделения, криоконсервации и культивирования МПМК, который подходит и для других методов. В то время как биопсия мышц считается золотым стандартом митохондриального энергетического метаболизма, исследование клеток крови является быстрой, минимально инвазивной процедурой. В дополнение к этому, все больше и больше исследований показывают, что изменения функции митохондрий при старении и болезни Альцгеймера (БА) происходят не только в головном мозге, но и на периферии 6,7,8,9,10. Метод также позволяет исследовать другие состояния и заболевания, включая сахарный диабет и ожирение 11,12,13. Паттерны экспрессии генов у пациентов с рассеянным склерозом могут быть проанализированы или иммунная функция и влияние на нее в целом 14,15,16.
ПБМК обычно полагаются на окислительное фосфорилирование (OXPHOS) для получения аденозинтрифосфата (АТФ)17,18. Таким образом, PBMC охватывают широкий спектр применений в качестве суррогатов. В предыдущих отчетах энергетический метаболизм PBMC использовался для устранения органных дисфункций, таких как ранняя сердечная недостаточность19, септический шок20 или связанные с полом различия4 в функции митохондрий. Обобщенный метод криоконсервации, выделения и культивирования МПМК будет иметь преимущества в сопоставимости результатов, полученных в разных институтах. Существует большое количество вариаций в протоколах для каждого шага21,22, целью этого метода является предоставление рекомендаций по биоэнергетическим измерениям в PBMC.
В данной статье описан метод измерения биоэнергетических параметров в ПБМК. Описаны методы выделения, криоконсервации и измерения биоэнергетики МПМК из крови человека. Этот метод может быть использован для определения биоэнергетических параметров у пациентов и оценки их в клиническом контексте. Чтобы применить эти измерения, исследователям необходим доступ к популяции пациентов, у которых можно получить свежие образцы крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы сбора, изоляции и анализа крови, описанные в данной рукописи, были рассмотрены и одобрены Институциональным наблюдательным советом Гиссенского университета, Германия. Получено согласие пациентов на включение их образцов в исследование. Все этапы выделения и культивирования клеток проводятся под шкафом биологической безопасности.
1. Венепункция
- Подготовьте все оборудование, необходимое для забора крови, включая дезинфицирующий спрей, стерильный тампон, канюлю для забора крови с 80-миллиметровой трубкой и мультиадаптером, жгут/манжету для измерения артериального давления, литий-гепарин Monovette 9 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: ЭДТА в качестве антикоагулянта также эффективна. - Возьмите кровь из наиболее подходящей вены руки, обычно из средней или цефалической вены.
- Наложите жгут/манжету для измерения артериального давления с легким давлением, около 80 мм/рт.
- Продезинфицируйте перчатки и место прокола дезинфицирующим спреем, содержащим спирт. Дайте продезинфицированному месту прокола высохнуть на воздухе.
- Вены выпячиваются из-за давления манжеты. Введите иглу (диаметр канюли (внешний) 21 г / 0,8 мм, длина 19 мм) под углом 15°-20° вены, стараясь избежать травмы и свести к минимуму зондирование.
- Забор крови с соответствующей системой, 4 пробирки по 9 мл крови (более 7-8 пробирок одному экспериментатору сложно правильно изолировать).
- После забора крови поместите пробирки для сбора в темноту на 5 минут, чтобы обеспечить равномерную антикоагулянтную терапию.
2. Изоляция PBMC
- Подготовьте все необходимые растворы, как описано ниже.
- Доведите сбалансированный солевой раствор Дульбекко (DPBS; концентрация 1x) и среду для выделения лимфоцитов (1,077 г/мл) до комнатной температуры (20-25 °C).
- Приготовьте фетальную бычью сыворотку (FBS) при комнатной температуре и держите одну стерильную коническую пробирку объемом 50 мл с FBS на льду. На каждый образец крови требуется 2 мл ФБС.
- Храните контейнер для заморозки при температуре 4 °C и предварительно охладите криопробирки при температуре 4 °C.
- Питательная среда для прогревания клеток до 37 °C, среда состоит из RPMI 1640 с 50 мл FBS и пенициллина 50 U/мл стрептомицина 50 U/мл. Этот раствор можно хранить при температуре 3 °C до 2 месяцев.
- Добавьте 8 мл DPBS в стерильные конические пробирки по 50 мл. Добавьте 15 мл среды для выделения лимфоцитов в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл (среда светочувствительна, добавляйте ее перед началом выделения).
- Добавьте 8 мл крови к 8 мл DPBS и тщательно перемешайте пластиковой пипеткой Пастера объемом 3 мл.
- Смесь крови/DPBS аккуратно нанесите пластиковой пипеткой Пастера объемом 3 мл поверх среды для выделения лимфоцитов. Для нанесения первого слоя на среду наклоните пробирку на 20°-30°, что приведет к меньшему проникновению смеси крови и PBS в слой среды.
- Осторожно нанесите смесь крови и PBS на боковую стенку пробирки на среду для выделения лимфоцитов. Используйте постоянную скорость, чтобы поддерживать постоянный кровоток.
- На следующем этапе медленно верните пробирку в вертикальное положение, остатки крови аккуратно наносятся слоем через боковую стенку пробирки на слой крови.
- Центрифугу в течение 10 мин при 1000 x g при комнатной температуре в центрифуге с ротором с качающимся ковшом и выключенными тормозами. После центрифугирования смесь крови и PBMC разделяется на четыре слоя. Верхний слой состоит из плазмы и тромбоцитов, второй слой – слой PBMC, за ним следует средний слой изоляции лимфоцитов и, наконец, эритроциты и гранулоциты в нижнем слое. Различные слои показаны на рисунке 1.
- Удалите 2/3 слоя плазмы пластиковой пипеткой Пастера.
- С помощью пипетки объемом 1 мл соберите МПМК на слое среды для выделения лимфоцитов, стараясь не допустить попадания среды в образец.
- Расположите наконечник на 1 мм выше слоя PBMC. Слой PBMC не должен быть проколот, иначе среда будет стекать по клеткам. Всасывание пипетки подтягивает PBMC к этой точке, чтобы их можно было собрать несколько раз в этой точке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимально увеличить количество собранных PBMC, в конце процедуры найдите остальные клетки на поверхности и попытайтесь собрать клетки там же. Для стабилизации процедуры трубку можно положить на поверхность. - Постепенно перекладывайте PBMC в новую пробирку объемом 50 мл до тех пор, пока слой не будет полностью собран. Добавьте DPBS до отметки 25 мл, смойте изоляционную среду лимфоцитов и другие остатки.
- Центрифуга в течение 10 мин при 100 x g при комнатной температуре при включенных тормозах. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса или аналогичного насоса, будьте осторожны, чтобы не повредить гранулу клетки.
- Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл DPBS и добавьте DPBS до отметки 25 мл. Повторите стирку еще раз, а затем снова взвесьте в среде, подходящей для следующих этапов.
Рисунок 1: Схематическое изображение центрифугирования с градиентом плотности для иллюстрации различных слоев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Криоконсервация
- Емкость для заморозки охладить до 4 °C, охладить FBS на льду.
- Ресуспендируйте гранулу PBMC в 1 мл FBS с помощью пипетки объемом 1 мл, FBS должна быть комнатной температуры.
- Смешайте ДМСО с предварительно охлажденным ФБС на льду 1:5, конечная концентрация 20% ДМСО, затем снова положите смесь ФБС:ДМСО на лед. Всегда готовьте раствор свежим.
- Перенесите клеточную суспензию PBMC в FBS в хорошо маркированные криопробирки объемом 2 мл. Используйте одну криопробирку на пробирку для сбора. Отрегулируйте количество клеток от 1 x 107 до 5 x 107 на мл. Используйте автоматический счетчик клеток для определения количества клеток и жизнеспособности.
- Добавьте в пробирку 1 мл смеси FBS:DMSO по каплям с помощью пипетки объемом 1 мл, примерно по 1-2 капли на секунду. Добавление по каплям приводит к непрерывному и последовательному перемешиванию.
- Поместите пробирки в предварительно охлажденный контейнер для заморозки. Поместите контейнер для заморозки в морозильную камеру с температурой -80 °C на 24 часа. Морозильный контейнер обеспечивает контролируемое охлаждение -1 °C в минуту.
- Выньте пробирки из морозильной камеры с температурой -80 °C. После извлечения из морозильной камеры храните пробирки в газовой фазе жидкого азота. Задокументируйте место каждого образца.
4. Размораживание
- Приготовьте все необходимые растворы: питательную среду для клеток RPMI 1640 с 50 мл ФБС и пенициллином 50 ЕД/мл, стрептомицин 50 ЕД/мл. Этот раствор можно хранить при температуре 3°C до 2 месяцев.
- Предварительно прогрейте среду для культивирования клеток до 37 °C. Добавьте 3 мл предварительно подогретой питательной среды в стерильные конические пробирки по 50 мл.
- Извлеките образец из резервуара с жидким азотом. Разморозьте образцы на водяной бане при температуре 37 °C в течение примерно 3,5 минут, снимите с водяной бани, как только растает последний лед. Кусочек льда размером с булавочную головку все еще должен быть виден в трубке.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДМСО вреден для работы PBMC как можно быстрее. - Извлеките смесь cell:FBS:DMSO с помощью пипетки объемом 1 мл из криопробирки. Смешайте образцы PBMC с питательной средой для клеток в подготовленных пробирках по 50 мл. Промывают пробирки 5 мл питательной среды в три приема по 2 мл, 2 мл и 1 мл.
- Перелейте среду в трубки. Это делается для переноса возможных остатков клеток. Центрифуга в течение 10 мин при 100 х г при комнатной температуре.
- Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл среды, подходящей для запланированного использования. Клетки готовы к последующим экспериментам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тем не менее, при функциональных тестах на свежих или замороженных клетках часто рекомендуется период покоя в инкубаторе (обычно на ночь) после выделения лимфоцитов, изоляции среды на основе среды или размораживания клеток.
5. Клеточная культура
- После выделения или размораживания культуральные клетки в течение ночи при 37 °C в 5% CO2/95% воздуха.
- Ресуспендировать клетки в 1 мл среды RPMI с добавлением 10% FBS, пеницилина 50 ЕД/мл, стрептомицина 50 ЕД/мл. Для дальнейшего использования существует множество возможностей, обрабатывать клетки по мере необходимости для анализов.
- Для общего хранения используют стерильные 6-луночные планшеты для клеточных культур и собирают клетки после периода покоя. Перелейте 1 мл клеточной суспензии пипеткой объемом 1 мл в лунку и добавьте 4 мл питательной среды для клеточной культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество выделенных PBMC сильно варьируется у разных людей, одной лунки с 5 мл клеточной питательной среды достаточно для каждых 8 мл выделенной крови. Однако при выделении МПМК из охристой оболочки количество МПМК значительно выше, чем в образцах цельной крови, поэтому клетки должны быть разделены на несколько лунок. - Дайте клеткам отдохнуть 24 часа во влажной атмосфере с добавлением 5%CO2 при 37 °C. Эта инкубация проводится как для свежевыделенных клеток, так и для криоконсервированных клеток.
6. Анализ на АТФ
- Ресуспендировать размороженные ПБМК в 1 мл среды RPMI с добавлением 10% FBS, пенициллина 50 Ед/мл, стрептомицина 50 Ед/мл.
- Возьмите пробу и определите количество клеток, а затем выполните различение живых и мертвых с помощью трипанового синего. Возьмите 10 мкл из ресуспендированных клеток и смешайте с 90 мкл клеточной питательной среды. Затем берут 10 мкл и смешивают с 10 мкл трипанового синего. Поместите ячейки либо в камеру для подсчета клеток, либо в автоматический счетчик клеток и определите количество живых/мертвых клеток.
- Планшет 100 мкл клеток плотностью 1 x 105 ячеек/100 мкл на лунку в 96-луночном белом полистирольном планшете.
- Дайте клеткам отдохнуть в течение 24 ч во влажной атмосфере с добавлением 5%CO2 при 37 °C.
- Определите концентрацию АТФ с помощью анализа АТФ.
- Используйте световое излучение, которое происходит при соединении АТФ с люциферином. Излучаемый свет можно оценить с помощью считывателя пластин. Снимите пластины, чтобы инкубатор остыл до комнатной температуры в течение 15 мин. Лизируйте клетки и оставьте их на 5 минут. Затем нанесите контрольный реагент на клетки и измерьте в соответствии с инструкциями производителя. Для определения уровня АТФ используется внутренний стандарт.
7. Респирометрия высокого разрешения
- Включите оксиграф высокого разрешения и дайте ему нагреться в течение 30 минут.
- Обрабатывайте клетки по протоколу, описанному на рисунке 1. Подготовьте все необходимые запасы, как указано в таблице 1.
- Пипетку 2,1 мл дыхательного буфера (Таблица 1) в обе камеры оксиграфа высокого разрешения и непрерывно перемешивайте буфер с помощью магнитной мешалки, присутствующей в камерах (750 об/мин) при 37 °C в течение 30 мин до получения стабильного сигнала кислородного потока полярографического датчика кислорода.
ПРИМЕЧАНИЕ: В камерах оксиграфа потребление кислорода в реальном времени (поток) и насыщение камеры кислородом измеряются с помощью полярографических кислородных электродов. Фоновую калибровку необходимо выполнять, чтобы избежать фонового шума и обеспечить надежные результаты. - Выполняют воздушную калибровку полярографического датчика кислорода в соответствии с протоколами изготовителя23.
- Ресуспендировать выделенные ПБМК в 1 мл митохондриальной дыхательной среды (MIR05, состав приведен в таблице 1) и разбавлять до 8 х 10,6 клеток/мл.
- После калибровки воздуха аспирируйте дыхательную среду из камеры оксиграфа и добавьте 2,1 мл клеточной суспензии в каждый прогиб респирометра. При необходимости во время измерения реоксигенировать камеры (см. Открыт в точке h на рисунке 2), насыщение камер кислородом не должно опускаться ниже 100 мкМ.
- Закройте камеры, вставив пробки, камеры рассчитаны на объем 2,0 мл. Аспирируют появляющуюся клеточную суспензию.
- Непрерывно перемешивайте клеточную суспензию при температуре 37 °C с помощью магнитной мешалки (750 об/мин), расположенной в камере. Подождите около 20 минут, пока не будет получен стабильный сигнал. Определите эндогенного дыхания ((а) на рисунке 2).
- Для определения различных сложных активностей дыхательной цепи вводят субстраты и ингибиторы митохондриального дыхания через титановые инъекционные порты пробок. Используйте следующую концентрацию в камере.
- Чтобы разрушить клеточные мембраны, добавьте 5 мкл 8,1 мМ дигитонина через титановое инъекционное отверстие пробки камеры, чтобы удалить наивные субстраты (b) на рисунке 2 , в то время как митохондриальные мембраны остаются нетронутыми.
- Добавьте субстраты 2 М глутамата и 800 мМ малата через инжекционное отверстие пробки камеры и запишите дыхание до достижения стабильного сигнала. Сигнал стабилизируется через 2-4 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать дополнительные субстраты, такие как пируват. - Добавьте 8 мкл 500 мМ аденозиндифосфата (АДФ) через инжекционное отверстие пробки камеры и записывайте дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал. Сигнал стабилизируется через 2-4 мин (d) на рисунке 2.
- Добавьте 20 мкл 1 М сукцината через инжекционное отверстие пробки камеры и записывайте дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал. Сигнал стабилизируется через 2-4 мин (e) на рисунке 2.
- Титрование 1 М карбонилцианида-трифторметоксифенилгидразона (FCCP) ступенчато при 0,5 мкл до точки, при которой не произойдет дальнейшего увеличения. Подождите 2-4 минуты, пока сигнал не стабилизируется (f) на рисунке 2. Когда дальнейшее учащение дыхания прекратится, переходите к следующему шагу.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при обращении с FCCP, так как он представляет опасность для здоровья людей. - Добавьте 5 мкл ротенона 0,1 мМ через инжекционное отверстие пробки камеры и записывайте дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал. Сигнал стабилизируется через 2-4 мин (g) на рисунке 2.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при обращении с ротеноном, так как он представляет опасность для здоровья человека. - Добавьте 1 мкл олигомицина 4 мг/мл через инжекционное отверстие пробки камеры и записывайте дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал. Сигнал стабилизируется через 2-4 мин (ч) на рисунке 2.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при обращении с олигомицином, так как это яд, представляющий опасность для здоровья человека. - Добавьте 1 мкл антимицина А 5 мМ через инжекционное отверстие пробки камеры и записывайте дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал. Сигнал стабилизируется через 2-4 мин (i) на рисунке 2.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при обращении с антимицином А, так как это яд, представляющий опасность для здоровья человека. - При оценке пробега для исключения потребления кислорода ферментами, не участвующими в окислительном фосфорилировании, вычитают значения антимицина А из всех других измеренных значений.
- Добавьте 200 мМ N,N,N',N'-тетраметил--фенилендиаминдигидрохлорид (TMPD; донатор электронов) и 800 мМ аскорбата, чтобы сохранить TMPD в восстановленном состоянии. Впрыскивайте субстраты через инжекционное отверстие пробки камеры и записывайте дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал. Сигнал стабилизируется через 2-4 мин (j) на рисунке 2.
- TMPD подвержена автоокислению, поэтому вычтите результирующий расход кислорода из измеренного значения в комплексе IV.
- Добавьте NaN3 ≥ 100 мМ через инжекторное отверстие пробки камеры и записывайте дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный сигнал. Сигнал стабилизируется через 2-4 мин для ингибирования комплексной активности ВВ, остается только автоокисление ТМПД.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при обращении с азидом натрия, так как это яд, представляющий опасность для здоровья человека.
Рисунок 2: Схематический ход потокаO2 . Показан схематический ход потока кислорода. Кривая разбивается на различные фазы после добавления ингибиторов и субстратов от a-k. а: эндогенное дыхание; b: пермеабилизированные клетки; в: несвязанное сложное дыхание I; d: сопряженное сложное дыхание I; e: ОКСФОС ; f: максимальная несвязанная активность CI и CII ; ж: несвязанное дыхание комплекса II; h: дыхание с утечкой; i: остаточное дыхание; j: CIV(U) несвязанное дыхание и аутокисление TMPD; k: автоокисление TMPD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
8. Активность цитратсинтазы
- Измеряйте активность цитратсинтазы как отдельный параметр и используйте его для нормализации измерений оксиграфа высокого разрешения.
- Суспендант выделенного PBMC в 1 мл митохондриальной дыхательной среды (MIR05) и разбавляют до 8 x 106 клеток/мл.
- Заморозьте в жидком азоте и храните при температуре −80 °C до проведения экспериментов или измерения свежих клеток.
- Приготовьте все необходимые растворы: 0,1 М триэтаноламин HCl буферный pH 8,0, 1,0 М Tris-HCl буферный pH=8,1, 10% Тритон X-100, 10 мМ оксалацетат в 0,1 М триэтаноламин HCl буфер pH 8,0, 1,01 мМ DTNB в 1,0 М буфер Tris-HCl pH=8,1, ацетил-КоА 12,2 мМ в двойной дистилляции H2O.
- Готовят реакционную среду (табл. 1), содержащую 5,5'-дитио-бис-(2-нитробезойную кислоту) (DTNB; 0,1 мМ), ацетилкоэнзим А (0,31 мМ), ЭДТА (50 мкМ), триэтаноламин HCl (5 мМ) и Tris HCl (0,1 М).
- Готовят исходный реагент (табл. 1) с 0,5 мМ оксалоацетата, растворенного в дважды дистиллированномН2О.
- Разморозьте образцы на льду, так как цитратсинтаза нестабильна при слишком быстром размораживании.
- Добавьте 40 мкл образцов в 96-луночный планшет на льду, а затем добавьте 110 мкл реакционной среды с помощью мультипипетки.
- Прогрейте реакционную среду и образец в инкубаторе до 30 °C в течение 5 мин. Подогрейте стартовый реагент на водяной бане до 30 °С в течение 5 мин.
- Добавьте в каждую лунку по 50 мкл стартового реагента с помощью мультипипетки. Измерение поглощения при 30 °C при длине волны 412 нм в течение 20 мин с помощью планшетного считывателя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Жизнеспособность и количество клеток
Для успешной изоляции и криоконсервации количество клеток и их жизнеспособность должны быть как можно выше. До и после криоконсервации клетки подсчитываются, и определяется их жизнеспособность, чтобы обеспечить здоровье и качество клеток. На рисунке 3 показана репрезентативная иллюстрация ПБМК до и после криоконсервации, количество клеток и жизнеспособность практически не отличаются. Это свидетельствует об успешном выделении и сохранении PBMC.
Рисунок 3: Влияние криоконсервации на количество и жизнеспособность клеток. Испытуемые группы разделены на контрольную группу со свежевыделенными ПБМК и ПБМК после 1 месяца криоконсервации. Подсчет клеток и определение их жизнеспособности проводили с помощью автоматизированного счетчика клеток. Для определения жизнеспособности использовали трипановый синий. Каждое измерение проводилось в виде тройного среднего значения, рассчитанного по результатам отдельных измерений. (А) Определение жизнеспособности клеток МПМК после свежего выделения и после криоконсервации в течение 1 месяца. Значения задаются как среднее значение ± SEM. Значимости определяли с помощью парного t-критерия. (Б) Определение количества клеток МПМК после свежего выделения и после криоконсервации в течение 1 месяца. Значения приведены в виде средних значений ± SEM. Значимости определяли с помощью парного t-критерия. Одна и та же форма и цвет показывают один и тот же образец до и после одного месяца криоконсервации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
АТФ представляет собой основной источник энергии для эукариотических клеток. АТФ определяется с помощью системы люминесцентного анализа. Если криоконсервация прошла успешно, АТФ между свежевыделенными и криоконсервированными клетками не должна отличаться. На рисунке 4 приведена репрезентативная иллюстрация КПМК до и после криоконсервации; Уровни АТФ аналогичны. Это свидетельствует об успешном выделении и сохранении PBMC.
Рисунок 4: Сравнение концентраций АТФ в разные периоды криоконсервации. Концентрация АТФ (мкМ / 100 000 клеток) в МПМК. Испытуемые группы разделены на контрольную группу со свежевыделенными ПБМК и ПБМК после 1 месяца криоконсервации. Образцы собирались в одно и то же время, а затем либо хранились в криокамере, либо измерялись после выделения. Для проверки значимых различий был проведен парный t-критерий; Результат показал, что различия были незначительными. Значения приведены в виде средних значений ± SEM (N = 13). Одна и та же форма и цвет показывают один и тот же образец до и после одного месяца криоконсервации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Цитратсинтаза (ЦС) является ключевым ферментом цитратного цикла, расположенным в митохондриях. Таким образом, активность CS представляет собой надежный маркер митохондриальной массы. Активность КС определяется на основе конвертации из ДТНБ в ТНБ. На рисунке 5 показано, что до и после криоконсервации значения КС в ПБМК не отличаются. Опять же, это указывает на успешную изоляцию и сохранение PBMC.
Рисунок 5: Влияние криоконсервации на активность цитратсинтазы. Активность цитратсинтазы в МПМК после 1 месяца криоконсервации по сравнению со свежеизмеренным контролем. Образцы собирались в одно и то же время, а затем либо хранились в криокамере, либо измерялись после выделения. Значения выражаются как среднее значение ± SEM (N = 8). Значимости определяли с помощью парного t-критерия. Одна и та же форма и цвет показывают один и тот же образец до и после одного месяца криоконсервации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Биоэнергетические профили МПМК могут быть определены с помощью полярографических датчиков кислорода, например, в оксиграфе высокого разрешения. Клеточное потребление кислорода измеряется в закрытой камере с очень высоким разрешением и чувствительностью в биологических образцах, например, интактных и пермеабилизированных клетках, тканях или изолированных митохондриях. Оксиграф высокого разрешения оснащен двумя камерами и использует полярографические датчики кислорода для измерения концентрации кислорода и расчета потребления кислорода в каждой камере. Нормы потребления кислорода рассчитываются с помощью программного обеспечения и выражаются в пикомолах на секунду на число клеток24. В каждой камере оксиграфа полярографические кислородные электроды измеряют концентрацию кислорода и рассчитывают потребление кислорода (поток) в каждой камере. Потребление и концентрация кислорода в камере отображаются в режиме реального времени (рисунок 6). При добавлении специфических ингибиторов и субстратов воздействуют на отдельные комплексы дыхательной цепи с целью измерения их активности. После анализа данные анализируются с помощью программного обеспечения. Значения потока нормировали по активности цитратсинтазы. Оксиграфия показала более низкие значения для комплекса IV из-за частично окисленного ТМПД. В серии тестов мы обнаружили, что используемая TMPD отклоняется в 1,8 раза. Этот коэффициент был использован для нормализации значений на рисунке 6.
Рисунок 6: Митохондриальное дыхание при ПБМКС после криоконсервации в сравнении со свежеизмеренным контролем. Раствор, содержащий 1,6 x 10,7 клеток/мл, использовали для измерения потребления кислорода клетками в оксиграфе. Дыхание измеряли через 1 месяц после криоконсервации. Для исследования активности комплексов в дыхательной цепи было добавлено несколько ингибиторов, субстратов и развязывателей. Добавление вещества производилось следующим образом: CI(L) = подтекающее дыхание комплекса I; CI(P) = сопряженное дыхание комплекса I; CI&CII(P) = физиологическое дыхание; CI&CII(U) = непарное дыхание, демонстрирующее максимальную активность I и II комплексов; CII(U) = несвязанное дыхание комплекса II; CII(L) = негерметичное дыхание комплекса II; CIV(U) = несвязанное дыхание. Для нормализации значений использовался коэффициент 1,8. Этот фактор был определен экспериментально для данной установки. Данные отображаются в виде средних значений ± SEM (N = 10). Статистическую значимость проверяли с помощью t-критерия Стьюдента (*p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Эндогенное дыхание определяют путем добавления в камеры 2 мл клеточной суспензии. Измеряется поток с эндогенными субстратами. Для дальнейшего различения комплексов добавляется дигитонин. Дигитонин пермеабилизирует плазматическую мембрану, в то время как митохондриальные мембраны остаются нетронутыми. Для компенсации утечки протона через мембрану добавляют субстраты глутамат и малат. Частота дыхания в этой точке иллюстрирует сложное I-управляемое дыхание при отсутствии сопряженного дыхания. Для определения способности к окислительному фосфорилированию (OXPHOS) комплекса I добавляется АДФ, дыхание теперь находится в связанном состоянии. Сопряженное дыхание КИ и КИИ достигается добавлением сукцината. Теперь дыхательная цепь работает на полную мощность. При титровании карбонилцианида-трифторметоксифенилгидразона (ФКХП) электронная транспортная цепь (ЭТК) разъединяется. При таком разъединении определяется максимальная несвязанная активность КИ и КИИ. Для дифференциации КИ и КИИ добавляют комплексный I-специфический ингибитор ротенон. При добавлении олигомицина определяют подтекающее дыхание КИИ. Для исключения потребления кислорода источниками, не участвующими в окислительном фосфорилировании, добавляют антибиотик антимицин А и это остаточное потребление кислорода вычитают из всех показаний, полученных в эксперименте. Донор электронов N,N,N',N'-тетраметил--фенилендиаминдигидрохлорид (TMPD; 0,5 мМ) является искусственным субстратом для CIV. Для поддержания ТМПД в восстановленном состоянии применяют аскорбат. Аскорбат и ТМПД используются для измерения максимального несвязанного дыхания при ЦИВ. Поскольку TMPD подвержен самоокислению, NaN3 добавляют после стабилизации флюса для ингибирования CIV. Оставшийся расход кислорода вычитается из исходных значений CIV. На рисунке 2 показана типичная кривая измерения.
Показанные параметры показывают успешность методики. Методика разработана для проведения биоэнергетических измерений после криоконсервации. Показанные результаты сравнивают клетки до и после измерения, так как статистически значимых различий не видно, можно предположить, что данный способ консервации пригоден для хранения более 1 месяца.
Таблица 1: Растворы, буферы и расходные материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает возможность выделения и криоконсервации мононуклеарных клеток периферической крови (МПКМ) из крови человека способом, подходящим для биоэнергетического анализа. Описанный метод позволяет мягко и в больших количествах выделять МПМК с высокой жизнеспособностью и достаточным количеством клеток для биоэнергетических измерений. Его недостаток заключается в том, что даже при минимальных перерывах происходят длительные изоляции, но последующая криоконсервация позволяет проводить независимые от времени измерения биоэнергетики. С помощью этого метода образцы могут быть собраны и измерены в более поздние моменты времени. Он также подходит для сбора образцов в многоцентровых исследованиях и одновременного измерения параметров в центральном месте.
Криоконсервация дает возможность хранить клетки в течение длительного периода времени, а затем измерять их. Выделение ПБМК занимает около 2-3 часов и позволяет отбирать только небольшое количество образцов за один раз. Один экспериментатор не может одновременно изолировать свежие КПМК от более чем 2 особей без потери качества. Необходимость проведения последующих экспериментов со свежими клетками усложняет процедуру и, таким образом, связана с дополнительным стрессом и цейтнотом. Отделение изоляции от выполнения экспериментов может упростить исследования и сделать тесты более стандартизированными. В частности, забор крови, выделение, криоконсервация коллектива образцов с последующим проведением специфических экспериментов. Образцы могут быть собраны из разных мест и в разное время, а затем измерены в одно и то же время в одном и том же месте.
Биоэнергетика играет важную роль в клеточном метаболизме, нарушение биоэнергетики, приводящее к митохондриальной дисфункции, вероятно, играет важную роль в старении и, следовательно, в нейродегенерации и других заболеваниях25,26. Методы, описанные выше, могут быть использованы в свежевыделенных и криоконсервированных МПМК для мониторинга изменений. Эти биоэнергетические измерения могут быть использованы в качестве основы для клинических исследований и исследований.
Существует несколько ограничивающих факторов для этого метода, и необходимо взвесить преимущества и недостатки нового измерения по сравнению с измерением после криоконсервации. Криоконсервация, как правило, очень требовательна к PBMC; Поэтому важно, чтобы количество стрессоров было как можно ниже. Время имеет существенное значение, так как клетки должны проводить как можно меньше времени в ДМСО, который токсичен для МПМК, каждый шаг должен быть подготовлен перед размораживанием или замораживанием клеток с ДМСО. Также для биоэнергетических измерений оказалось неэффективным хранение в морозильной камере при температуре -80 °C – образцы необходимо перевести в жидкий азот через 24 часа. Контролируемая скорость замораживания обязательна, если охлаждение происходит слишком быстро, вода, оставшаяся в клетках, замерзает и образует кристаллы, повреждая клеточные мембраны и компартменты. Слишком медленная скорость охлаждения приводит к длительному контакту с токсичным ДМСО. В морозильных камерах, использующих изопропанол, скорость замерзания составляет 1 °C/мин в морозильной камере с температурой -80 °C. Следует избегать размораживания и повторного замораживания КПБК.
Этот протокол описывает изоляцию и криоконсервацию ПБМК. С целью подтверждения работоспособности КПМК после сохранения для биоэнергетических измерений были проведены образцовые измерения биоэнергетики. Этот протокол был оптимизирован для измерения биоэнергетических факторов. Биоэнергетические факторы могут быть определены после криоконсервации, но также можно определить для других протоколов, возможны ли измерения после криоконсервации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Благодарим клиническую команду университетской клиники Гиссен-Марбург за сбор крови. Эта работа финансировалась Университетом Юстуса Либиха.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | - | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | - | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | - | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | - | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | - | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | - | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | - | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | - | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | - | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | - | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al.
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M.
