Summary
Las células mononucleares aisladas de sangre periférica se pueden utilizar para el análisis de funciones y trastornos inmunitarios, enfermedades metabólicas o funciones mitocondriales. En este trabajo se describe un método estandarizado para la preparación de PBMCs a partir de sangre total y su posterior criopreservación. La criopreservación hace que este tiempo y lugar sean independientes.
Abstract
Las funciones fisiológicas de las células eucariotas dependen de la energía proporcionada principalmente por las mitocondrias. La disfunción mitocondrial está relacionada con las enfermedades metabólicas y el envejecimiento. La fosforilación oxidativa juega un papel decisivo, ya que es crucial para el mantenimiento de la homeostasis energética. Las PBMC se han identificado como una muestra mínimamente invasiva para medir la función mitocondrial y se ha demostrado que reflejan las condiciones de la enfermedad. Sin embargo, la medición de la función bioenergética mitocondrial puede estar limitada por varios factores en muestras humanas. Las limitaciones son la cantidad de muestras tomadas, el tiempo de muestreo, que a menudo se extiende a lo largo de varios días, y las ubicaciones. La criopreservación de las muestras recogidas puede garantizar la recogida y medición coherentes de las muestras. Se debe tener cuidado de garantizar que los parámetros medidos sean comparables entre las células criopreservadas y las recién preparadas. Aquí, describimos métodos para aislar y criopreservar PBMC de muestras de sangre humana para analizar la función bioenergética de las mitocondrias en estas células. Las PBMC criopreservadas de acuerdo con el protocolo descrito aquí muestran solo diferencias menores en el número y viabilidad de las células, los niveles de trifosfato de adenosina y la actividad de la cadena respiratoria medida en comparación con las células recién recolectadas. Solo se necesitan 8-24 ml de sangre humana para las preparaciones descritas, lo que permite recolectar muestras durante los estudios clínicos de forma multicentralizada y determinar su bioenergética en el sitio.
Introduction
Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se utilizan para diversas aplicaciones en muchos campos científicos, incluido el estudio de cuestiones inmunológicas y bioenergéticas, como las relacionadas con los procesos de envejecimiento o las enfermedades degenerativas 1,2. Las PBMC son de composición heterogénea y están formadas por linfocitos (células B, células T y células NK), monocitos y células dendríticas. Las células a veces muestran grandes diferencias y variaciones individuales dentro de un sujeto, por lo que se requieren procedimientos estandarizados para el manejo de estas células. Parámetros importantes como la viabilidad y la pureza del aislamiento son los requisitos básicos para su manejo y además están influenciados por factores ambientales como el momento de la recolección, el nivel de melatonina, si el sujeto está en ayunas, entre otros 3,4.
Basándonos en estudios sobre la bioenergética de las PBMC, describimos aquí un método para el aislamiento, la criopreservación y el cultivo de PBMC que también es adecuado para otros métodos. Si bien la biopsia muscular se considera el estándar de oro para el metabolismo energético mitocondrial5, el examen de las células sanguíneas es un procedimiento rápido y mínimamente invasivo. Además de esto, cada vez más estudios sugieren que los cambios en la función mitocondrial en el envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer (EA) ocurren no solo en el cerebro sino también en la periferia 6,7,8,9,10. El método también permite investigar otras afecciones y enfermedades, como la diabetes mellitus y la obesidad 11,12,13. Se pueden analizar los patrones de expresión génica en pacientes con esclerosis múltiple, o la función inmune y sus influencias en general 14,15,16.
Las PBMC generalmente se basan en la fosforilación oxidativa (OXPHOS) para generar trifosfato de adenosina (ATP)17,18. Por lo tanto, los PBMC cubren una amplia gama de aplicaciones como sustitutos. En informes anteriores, el metabolismo energético de las PBMC se ha utilizado para abordar las disfunciones orgánicas, como en la insuficiencia cardíaca temprana19, el shock séptico20 o las diferencias asociadas al sexo4 en la función mitocondrial. Un método generalizado para el aislamiento de criopreservación y el cultivo de PBMC tendría ventajas en la comparabilidad de los resultados obtenidos en diferentes institutos. Existe una gran variación en los protocolos para cada paso21,22, el objetivo de este método es proporcionar una guía para las mediciones bioenergéticas en PBMC.
En este artículo describimos un método para medir parámetros bioenergéticos en PBMCs. Explicamos los métodos para aislar, criopreservar y medir la bioenergética de PBMCs de sangre humana. Este método se puede utilizar para determinar parámetros bioenergéticos en pacientes y evaluarlos en un contexto clínico. Para aplicar estas mediciones, los investigadores necesitan acceso a una población de pacientes de la que se puedan obtener muestras de sangre fresca.
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Protocol
Todos los protocolos descritos en este manuscrito para la extracción, el aislamiento y el análisis de sangre han sido revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Giessen, Alemania. Se obtuvo el consentimiento de los pacientes para incluir sus muestras en el estudio. Todos los pasos para el aislamiento y el cultivo celular se llevan a cabo bajo una cabina de seguridad biológica.
1. Venopunción
- Prepare todo el equipo necesario para la extracción de sangre, incluido el aerosol desinfectante, el hisopo estéril, la cánula de extracción de sangre con tubo de 80 mm y adaptador múltiple, torniquete/manguito de presión arterial, Monovette 9 mL de litio-heparina.
NOTA: El EDTA como anticoagulante también es eficaz. - Recolectar sangre de la vena del brazo más apropiada, generalmente vena mediana cubiti o vena cefálica.
- Aplique un torniquete/manguito de presión arterial con una ligera presión, alrededor de 80 mm/Hg.
- Desinfecte los guantes y el sitio de la punción con un aerosol desinfectante que contenga alcohol. Deje que el sitio de punción desinfectado se seque al aire.
- Las venas sobresalen debido a la presión del manguito de presión. Inserte la aguja (diámetro de la cánula (exterior) 21G / 0,8 mm, longitud 19 mm) en un ángulo de 15°-20° de la vena tratando de evitar traumatismos y minimizando el sondaje.
- Tome sangre con el sistema apropiado, 4 tubos que contengan 9 ml de sangre (más de 7-8 tubos son problemáticos para que un experimentador los aísle correctamente).
- Después de la extracción de sangre, coloque los tubos de recolección en la oscuridad durante 5 minutos para garantizar una anticoagulación uniforme.
2. Aislamiento de PBMC
- Prepare todas las soluciones necesarias como se describe a continuación.
- Llevar la solución salina equilibrada de Dulbecco (DPBS; concentración 1x) y el medio de aislamiento de linfocitos (1,077 g/ml) a temperatura ambiente (20-25 °C).
- Prepare el suero fetal bovino (FBS) a temperatura ambiente y mantenga un tubo cónico estéril de 50 ml con FBS en hielo. Para cada muestra de sangre, se requieren 2 mL de FBS.
- Almacene el recipiente de congelación a 4 °C y preenfríe los criotubos a 4 °C.
- Medio de cultivo celular caliente a 37 °C, el medio consiste en RPMI 1640 con 50 mL de FBS y penicilina 50 U/mL estreptomicina 50 U/mL. Esta solución se puede almacenar a 3 °C durante un máximo de 2 meses.
- Agregue 8 ml de DPBS en tubos cónicos estériles de 50 ml. Agregue 15 mL de medio de aislamiento de linfocitos en un tubo cónico estéril de 50 mL (el medio es sensible a la luz, agréguelo antes de comenzar el aislamiento).
- Agregue 8 ml de sangre a 8 ml de DPBS y mezcle con cuidado con una pipeta Pasteur de plástico de 3 ml.
- Coloque suavemente la mezcla de sangre/DPBS con una pipeta Pasteur de plástico de 3 ml sobre el medio de aislamiento de linfocitos. Para aplicar la primera capa al medio, incline el tubo de 20° a 30°, lo que dará como resultado una menor penetración de la mezcla de sangre y PBS en la capa media.
- Coloque cuidadosamente la mezcla de sangre y PBS sobre la pared lateral del tubo sobre el medio de aislamiento de linfocitos. Use una velocidad constante para mantener constante el flujo sanguíneo.
- En el siguiente paso, lleve el tubo lentamente a una posición vertical, la sangre restante se coloca cuidadosamente sobre la pared lateral del tubo sobre la capa de sangre.
- Centrifugar durante 10 min a 1000 x g a temperatura ambiente en una centrífuga con rotor de cangilón basculante con frenos apagados. Después de la centrifugación, la mezcla de sangre y PBMC se separa en cuatro capas. La capa superior está formada por plasma y plaquetas, la segunda capa es la capa PBMC, seguida de una capa media de aislamiento de linfocitos y, finalmente, eritrocitos y granulocitos en la capa inferior. Las diferentes capas se muestran en la Figura 1.
- Retire 2/3 de la capa de plasma con una pipeta Pasteur de plástico.
- Con una pipeta de 1 ml, recoja las PBMC en la capa de medio de aislamiento de linfocitos teniendo cuidado de que no quede ningún medio en la muestra.
- Coloque la punta 1 mm por encima de la capa PBMC. La capa de PBMC no debe perforarse, de lo contrario el medio fluirá sobre las células. La succión de la pipeta tira de los PBMC hasta este punto para que puedan recogerse varias veces en este punto.
NOTA: Para maximizar el número de PBMC recolectados, al final del procedimiento busque el resto en la superficie e intente recolectar las células allí también. Para estabilizar el procedimiento, el tubo se puede colocar sobre una superficie. - Transfiera los PBMC paso a paso a un nuevo tubo de 50 ml hasta que la capa esté completamente cosechada. Agregue DPBS hasta la marca de 25 ml, elimine el medio de aislamiento de linfocitos y otros residuos.
- Centrifugar durante 10 min a 100 x g a temperatura ambiente con los frenos puestos. Retire el sobrenadante con una bomba de vacío o similar, tenga cuidado de no dañar el gránulo celular.
- Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de DPBS y agregue DPBS hasta la marca de 25 ml. Repita el lavado una vez más y luego vuelva a suspender en un medio apropiado para los siguientes pasos.
Figura 1: Representación esquemática de una centrifugación en gradiente de densidad para ilustrar las diferentes capas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Criopreservación
- Enfríe un recipiente de congelación a 4 ° C, enfríe FBS en hielo.
- Vuelva a suspender el gránulo de PBMC en 1 ml de FBS con una pipeta de 1 ml, el FBS debe estar a temperatura ambiente.
- Mezcle DMSO con FBS preenfriado en hielo 1:5, concentración final 20% DMSO y luego vuelva a poner la mezcla FBS: DMSO en hielo. Prepare siempre la solución fresca.
- Transfiera la suspensión celular de PBMC en FBS a criotubos de 2 ml bien etiquetados. Utilice un criotubo por tubo de recolección. Ajuste el número de células entre 1 x 107 y 5 x 107 por ml. Utilice un contador de células automatizado para determinar el recuento de células y la viabilidad.
- Agregue 1 ml de mezcla de FBS: DMSO gota a gota con una pipeta de 1 ml, aproximadamente 1-2 gotas por segundo, en el tubo. La adición gota a gota conduce a una mezcla continua y consistente.
- Coloque los tubos en el recipiente de congelación preenfriado. Coloque el recipiente de congelación en un congelador a -80 °C durante 24 h. El recipiente de congelación proporciona un enfriamiento controlado de -1 °C por minuto.
- Retire los tubos del congelador a -80 °C. Después de sacarlos del congelador, almacene los tubos en la fase gaseosa de nitrógeno líquido. Documente el lugar de cada muestra.
4. Descongelación
- Preparar todas las soluciones necesarias: Medio de cultivo celular RPMI 1640 con 50 mL de FBS y penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 U/mL. Esta solución se puede almacenar a 3 °C durante un máximo de 2 meses.
- Precalentar el medio de cultivo celular a 37 °C. Añadir 3 mL de medio de cultivo celular precalentado en tubos cónicos estériles de 50 mL.
- Retire la muestra del tanque de nitrógeno líquido. Descongele las muestras en un baño de agua a 37 °C durante aprox. 3,5 min, retírelas del baño de agua tan pronto como se derrita el último hielo. Un pedazo de hielo del tamaño de la cabeza de un alfiler aún debe ser visible en el tubo.
NOTA: El DMSO es perjudicial para que las PBMC funcionen lo más rápido posible. - Retire la mezcla de células:FBS:DMSO con una pipeta de 1 ml del criotubo. Mezcle las muestras de PBMC con el medio de cultivo celular en los tubos de 50 ml preparados. Lave los tubos con 5 ml de medio de cultivo en tres pasos de 2 ml, 2 ml y 1 ml.
- Transfiera el medio a los tubos. Esto se realiza para transferir posibles residuos celulares. Centrifugar durante 10 min a 100 x g a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante y agregue 1 mL de medio apropiado para el uso planificado. Las células están listas para experimentos posteriores.
NOTA: Sin embargo, con las pruebas funcionales en células frescas o congeladas, a menudo se recomienda un período de reposo en una incubadora (generalmente durante la noche) después del aislamiento de linfocitos basado en el medio o la descongelación celular.
5. Cultivo celular
- Después del aislamiento o descongelación de las células de cultivo durante la noche a 37 °C en aire al 5% de CO2/95%.
- Resuspender las células en 1 mL de medio RPMI suplementado con FBS al 10%, penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 U/mL. Para su uso posterior hay muchas posibilidades, trate las células según sea necesario para los ensayos.
- Para el almacenamiento general, use placas de cultivo celular estériles de 6 pocillos y recoja las células después del período de reposo. Transfiera 1 mL de suspensión celular con una pipeta de 1 mL a un pocillo y agregue 4 mL de medio de cultivo celular.
NOTA: La cantidad de PBMC aisladas varía mucho entre individuos, un pocillo con 5 mL de medio de cultivo celular es suficiente por cada 8 mL de sangre aislada. Sin embargo, cuando se aíslan las PBMC de las capas leucocitarias, la cantidad de PBMC es significativamente mayor que en las muestras de sangre total y, por lo tanto, las células deben dividirse en varios pocillos. - Dejar reposar las células 24 h en una atmósfera humidificada suplementada con 5% de CO2 a 37 °C. Esta incubación se realiza para células recién aisladas, así como para células criopreservadas.
6. Ensayo de ATP
- Resuspender las PBMC descongeladas en 1 mL de medio RPMI suplementado con FBS al 10%, penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 U/mL.
- Tome una muestra y determine el recuento de células, luego realice una discriminación de vivos y muertos con azul de tripán. Tomar 10 μL de las células resuspendidas y mezclar con 90 μL de medio de cultivo celular. A continuación, tomar 10 μL y mezclar con 10 μL de azul de tripano. Coloque las células en una cámara de recuento de células o en un contador automático de células y determine el número de células vivas/muertas.
- Placa de 100 μL de células a una densidad de 1 x 105 células/100 μL por pocillo en una placa de poliestireno blanco de 96 pocillos.
- Dejar reposar las células durante 24 h en una atmósfera humidificada suplementada con 5% de CO2 a 37 °C.
- Determine las concentraciones de ATP con un ensayo de ATP.
- Utilice la emisión de luz que se produce cuando el ATP se combina con luciferina. La luz emitida se puede evaluar con un lector de placas. Retire las placas para que la incubadora se enfríe a temperatura ambiente durante 15 minutos. Lisar las células y dejarlas actuar durante 5 min. A continuación, aplique el reactivo de monitorización a las células y mida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utiliza un estándar interno para determinar el nivel de ATP.
7. Respirometría de alta resolución
- Encienda el oxígrafo de alta resolución y deje que se caliente durante 30 minutos.
- Trate las células de acuerdo con un protocolo descrito en la Figura 1. Prepare todas las existencias necesarias como se indica en la Tabla 1.
- Pipetear 2,1 mL de tampón respiratorio (Tabla 1) en ambas cámaras de oxígrafo de alta resolución y agitar el tampón continuamente utilizando una barra de agitación magnética presente en las cámaras (750 rpm) a 37 °C durante 30 min hasta obtener una señal de flujo de oxígeno estable del sensor de oxígeno polarográfico.
NOTA: En las cámaras del oxígrafo, el consumo de oxígeno en tiempo real (flujo) y la saturación de oxígeno de la cámara se miden con la ayuda de electrodos polarográficos de oxígeno. La calibración de fondo debe realizarse para evitar el ruido de fondo y garantizar resultados fiables. - Realice una calibración de aire del sensor polarográfico de oxígeno de acuerdo con los protocolos del fabricante23.
- Resuspender las PBMC aisladas en 1 mL de medio respiratorio mitocondrial (MIR05, la composición se muestra en la Tabla 1) y diluir a 8 x 106 células/mL.
- Después de la calibración del aire, aspire el medio respiratorio de la cámara del oxígrafo y agregue 2,1 ml de suspensión celular en cada inclinación del respirómetro. Si es necesario reoxigenar las cámaras durante la medición (ver Abrir en el punto h de la Figura 2), la saturación de oxígeno de las cámaras no debe caer por debajo de 100 μM.
- Cierre las cámaras insertando los tapones, las cámaras están diseñadas para contener un volumen de 2,0 ml. Aspirar la suspensión celular emergente.
- Mezcle continuamente la suspensión de la celda a 37 °C con un agitador magnético (750 rpm) ubicado en la cámara. Espere unos 20 minutos hasta que se obtenga una señal estable. Determinar la respiración endógena ((a) en la Figura 2).
- Para determinar las diferentes actividades complejas de la cadena respiratoria, inyecte los sustratos e inhibidores para la respiración mitocondrial a través de los puertos de inyección de titanio de los tapones. Utilice la siguiente concentración final en la cámara.
- Para alterar las membranas celulares, agregue 5 μL de digitonina de 8,1 mM, a través del puerto de inyección de titanio del tapón de la cámara, para eliminar los sustratos vírgenes (b) en la Figura 2 mientras las membranas mitocondriales permanecen intactas.
- Añadir sustratos 2 M de glutamato y 800 mM de malato a través del puerto de inyección del tapón de la cámara y registrar la respiración hasta conseguir una señal estable. La señal se estabiliza después de 2-4 minutos.
NOTA: También es posible utilizar sustratos adicionales como el piruvato. - Añadir 8 μL de 500 mM de difosfato de adenosina (ADP) a través del puerto de inyección del tapón de la cámara y registrar la respiración hasta que se logre una señal estable. La señal se estabiliza después de 2-4 min (d) en la Figura 2.
- Añadir 20 μL de succinato 1 M a través del puerto de inyección del tapón de la cámara y registrar la respiración hasta conseguir una señal estable. La señal se estabiliza después de 2-4 min (e) en la Figura 2.
- Ajuste de la dosis de cianuro de carbonilo 1 M p-trifluorometoxi fenilhidrazona (FCCP) de forma escalonada a 0,5 μL hasta el punto en que no se produzca ningún aumento adicional. Espere de 2 a 4 minutos hasta que la señal se estabilice (f) en la Figura 2. Cuando no haya más aumento en la respiración, continúe con el siguiente paso.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manipular FCCP, ya que tiene riesgos para la salud de los seres humanos. - Añadir 5 μL de 0,1 mM de rotenona a través del puerto de inyección del tapón de la cámara y registrar la respiración hasta conseguir una señal estable. La señal se estabiliza después de 2-4 min (g) en la Figura 2.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manipular rotenona, ya que tiene riesgos para la salud de los seres humanos. - Añadir 1 μL de 4 mg/mL de oligomicina a través del puerto de inyección del tapón de la cámara y registrar la respiración hasta que se logre una señal estable. La señal se estabiliza después de 2-4 min (h) en la Figura 2.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manipular oligomicina, ya que es un veneno que representa riesgos para la salud de los seres humanos. - Añadir 1 μL de 5 mM de antimicina A a través del puerto de inyección del tapón de la cámara y registrar la respiración hasta que se logre una señal estable. La señal se estabiliza después de 2-4 min (i) en la Figura 2.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manipular la antimicina A, ya que es un veneno que representa riesgos para la salud de los seres humanos. - Al evaluar el corrido para excluir el consumo de oxígeno de enzimas no involucradas en la fosforilación oxidativa, reste los valores de antimicina A de todos los demás valores medidos.
- Agregue 200 mM N,N,N',N'-dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD; donante de electrones) y 800 mM de ascorbato para mantener TMPD en un estado reducido. Inyecte los sustratos a través del puerto de inyección del tapón de la cámara y registre la respiración hasta lograr una señal estable. La señal se estabiliza después de 2-4 min (j) en la Figura 2.
- TMPD está sujeto a autooxidación, por lo que reste el consumo de oxígeno resultante del valor medido en el Complejo IV.
- Agregue NaN3 ≥ 100 mM a través del puerto de inyección del tapón de la cámara y registre la respiración hasta lograr una señal estable. La señal se estabiliza después de 2-4 minutos para inhibir la actividad del complejo IV, solo queda la autooxidación de TMPD.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manipular azida sódica, ya que es un veneno que representa riesgos para la salud de los seres humanos.
Figura 2: Curso esquemático del flujo deO2 . Se muestra el curso esquemático del flujo de oxígeno. La curva se divide en las diferentes fases después de la adición de inhibidores y sustratos de a-k. a: respiración endógena; b: células permeabilizadas; c: respiración desacoplada del complejo I; d: respiración acoplada del complejo I; e: OXPHOS ; f: actividad desacoplada máxima de IC y CII; g: respiración desacoplada del complejo II; h: respiración por fugas; i: respiración residual; j: respiración desacoplada CIV(U) y autooxidación de TMPD; k: autooxidación de TMPD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
8. Actividad de la citrato sintasa
- Mida la actividad de la citrato sintasa como un parámetro separado y utilícelo para normalizar las mediciones del oxígrafo de alta resolución.
- Resuspender PBMC aislada en 1 mL de medio respiratorio mitocondrial (MIR05) y diluir a 8 x 106 células/mL.
- Congelar en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C hasta que se realicen experimentos o para medir células frescas.
- Prepare todas las soluciones necesarias: tampón de trietanolamina HCl 0,1 M pH 8,0, tampón Tris-HCl 1,0 M pH = 8,1, 10% Triton X-100, 10 mM de oxalacetato en tampón HCl de trietanolamina 0,1 M pH 8,0, DTNB 1,01 mM en tampón Tris-HCl 1,0 M pH = 8,1, acetil-CoA 12,2 mM en H2O de doble destilación.
- Prepare un medio de reacción (Tabla 1) que contenga 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobezoico) (DTNB; 0,1 mM), acetil coenzima A (0,31 mM), EDTA (50 μM), trietanolamina HCl (5 mM) y Tris HCl (0,1 M).
- Preparar el reactivo de partida (Tabla 1) con 0,5 mM de oxaloacetato disuelto en H2O de doble destilación.
- Descongele las muestras en hielo, ya que la citrato sintasa es inestable si se descongela demasiado rápido.
- Agregue 40 μL de las muestras a una placa de 96 pocillos en hielo antes de agregar 110 μL de medio de reacción con una multipipeta.
- Calentar el medio de reacción y la muestra en una incubadora a 30 °C durante 5 min. Calentar el reactivo de arranque en un baño de agua a 30 °C durante 5 min.
- Añadir 50 μL del reactivo de partida con una multipipeta a cada pocillo. Mida la absorbancia a 30 °C a una longitud de onda de 412 nm durante 20 minutos a través del lector de placas.
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Representative Results
Viabilidad y número de células
Para lograr un aislamiento y una criopreservación exitosos, el recuento de células y la viabilidad deben ser lo más altos posible. Antes y después de la criopreservación, se cuentan las células y se determina su viabilidad para garantizar la salud y la calidad de las células. La Figura 3 es una ilustración representativa de las PBMC antes y después de la criopreservación, el recuento de células y la viabilidad apenas difieren. Esto indica que el aislamiento y la preservación exitosos de las PBMC se han llevado a cabo.
Figura 3: Efecto de la criopreservación sobre el número de células y la viabilidad. Los grupos de prueba se dividen en el grupo de control con PBMC recién aislados y PBMC después de 1 mes de criopreservación. El recuento de las células y la determinación de su viabilidad se llevó a cabo con un contador de células automatizado. Se utilizó azul de tripano para determinar la viabilidad. Cada medición se llevó a cabo como un triplicado del valor medio que se calculó a partir de los resultados de las mediciones individuales. (A) Determinación de la viabilidad celular de las PBMC después de un nuevo aislamiento y después de 1 mes de criopreservación. Los valores se expresan como media ± SEM y las significancias se determinaron con una prueba t pareada. (B) Determinación del número de células de PBMC después de un nuevo aislamiento y después de 1 mes de criopreservación. Los valores se dan como medias ± SEM. Las significancias se determinaron con una prueba t pareada. La misma forma y color muestran la misma muestra antes y después de un mes de criopreservación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El ATP representa la principal fuente de energía para las células eucariotas. El ATP se determina mediante un sistema de ensayo de luminiscencia. Si la criopreservación tiene éxito, el ATP entre las células recién aisladas y las células criopreservadas no debería diferir. La Figura 4 es una ilustración representativa de las PBMC antes y después de la criopreservación; Los niveles de ATP son similares. Esto indica que el aislamiento y la preservación exitosos de las PBMC se han llevado a cabo.
Figura 4: Comparación de la concentración de ATP en diferentes períodos de criopreservación. Concentración de ATP (μM / 100.000 células) en PBMCs. Los grupos de prueba se dividen en el grupo de control con PBMC recién aislados y PBMC después de 1 mes de criopreservación. Las muestras se recogieron al mismo tiempo y luego se crioalmacenaron o se midieron después del aislamiento. Se realizó una prueba t pareada para comprobar las diferencias significativas; El resultado mostró que las diferencias no fueron significativas. Los valores se dan como valores medios ± SEM (N = 13). La misma forma y color muestran la misma muestra antes y después de un mes de criopreservación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La citrato sintasa (CS) es una enzima clave del ciclo del citrato, ubicada en las mitocondrias. Por lo tanto, la actividad del CS representa un marcador robusto de la masa mitocondrial. La actividad de CS se determina sobre la base de la conversión de DTNB a TNB. La Figura 5 muestra que antes y después de la criopreservación, los valores de CS no difieren en las PBMC. Una vez más, esto indica un aislamiento y preservación exitosos de las PBMC.
Figura 5: Efecto de la criopreservación sobre la actividad de la citrato sintasa. Actividad de la citrato sintasa en PBMC después de 1 mes de criopreservación en comparación con el control recién medido. Las muestras se recogieron al mismo tiempo y luego se crioalmacenaron o se midieron después del aislamiento. Los valores se expresan como media ± SEM (N = 8). Las significaciones se determinaron con una prueba t pareada. La misma forma y color muestran la misma muestra antes y después de un mes de criopreservación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los perfiles bioenergéticos de las PBMC se pueden determinar utilizando sensores polarográficos de oxígeno, por ejemplo, en oxígrafo de alta resolución. El consumo de oxígeno celular se mide en un sistema de cámara cerrada con muy alta resolución y sensibilidad en muestras biológicas, por ejemplo, células intactas y permeabilizadas, tejidos o mitocondrias aisladas. El dispositivo de oxígrafo de alta resolución está equipado con dos cámaras y utiliza sensores polarográficos de oxígeno para medir la concentración de oxígeno y calcular el consumo de oxígeno dentro de cada cámara. Las tasas de consumo de oxígeno se calculan mediante software y se expresan como picomoles por s por número de células24. Dentro de cada cámara de oxígrafo, los electrodos polarográficos de oxígeno miden la concentración de oxígeno y calculan el consumo de oxígeno (flujo) dentro de cada cámara. El consumo y la concentración de oxígeno en la cámara se muestran en tiempo real (Figura 6). Con la adición de inhibidores y sustratos específicos, los complejos individuales de la cadena respiratoria se dirigen para medir su actividad. Después del ensayo, los datos se analizan con el software. Los valores de flujo se normalizaron a actividad citrato sintasa. La oxigrafía proporcionó valores más bajos para el complejo IV debido a la TMPD parcialmente oxidada. En una serie de pruebas, encontramos que el TMPD utilizado se desvió en un factor de 1,8. Este factor se utilizó para normalizar los valores de la Figura 6.
Figura 6: Respiración mitocondrial en PBMCS después de la criopreservación en comparación con el control recién medido. Se utilizó una solución que contenía 1,6 x 107 células/ml para medir el consumo de oxígeno de las células en un oxígrafo. La respiración se midió 1 mes después de la criopreservación. Para investigar la actividad de los complejos en la cadena respiratoria se añadieron varios inhibidores, sustratos y desacopladores. La adición de una sustancia se realizó de la siguiente manera: CI(L) = respiración por fuga del complejo I; IC(P) = respiración acoplada del complejo I; IC&CII(P) = respiración fisiológica; IC&CII(U) = respiración desacoplada que muestra la máxima actividad de los complejos I y II; CII(U) = respiración desacoplada del complejo II; CII(L) = respiración por fuga del complejo II; CIV(U) = respiración desacoplada. Se utilizó un factor de 1,8 para normalizar los valores. Este factor se determinó experimentalmente para la configuración actual. Los datos se muestran como medios ± SEM (N = 10). La significación estadística se comprobó mediante la prueba t de Student (*p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La respiración endógena se determina mediante la adición de 2 mL de suspensión celular en las cámaras. Se mide el flujo con sustratos endógenos. Para distinguir aún más entre complejos, se agrega digitonina. La digitonina permeabiliza la membrana plasmática mientras que las membranas mitocondriales permanecen intactas. Para compensar la fuga de protones a través de la membrana, se añaden sustratos de glutamato y malato. Las tasas de respiración en este punto ilustran la respiración compleja impulsada por I en ausencia de respiración acoplada. Para detectar la capacidad de fosforilación oxidativa (OXPHOS) del complejo I ADP, la respiración se encuentra ahora en un estado acoplado. La respiración acoplada de IC y CII se logra mediante la adición de succinato. Ahora la cadena respiratoria funciona a su máxima capacidad. Con la titulación de cianuro de carbonilo, p-trifluorometoxi fenilhidrazona (FCCP), la cadena de transporte de electrones (ETC) se desacopla. Con este desacoplamiento se determina la actividad máxima desacoplada de IC y CII. Para diferenciar entre IC y CII se añade rotenona, inhibidor específico del complejo I. Mediante la adición de oligomicina, se determina la respiración por fuga de CII. Para excluir el consumo de oxígeno por fuentes no implicadas en la fosforilación oxidativa, se añade el antibiótico antimicina A y este consumo de oxígeno residual se resta de todas las lecturas obtenidas en el experimento. El donante de electrones N,N,N',N'-dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD; 0,5 mM) es un sustrato artificial para la CIV. Para mantener la TMPD en un estado reducido, se utiliza ascorbato. El ascorbato y la TMPD se utilizan para medir la respiración máxima desacoplada de la CIV. Dado que TMPD está sujeto a autooxidación, se agrega NaN3 después de la estabilización del flujo para inhibir el CIV. El consumo de oxígeno restante se resta de los valores brutos de CIV. La figura 2 muestra una curva de medición típica.
Los parámetros mostrados muestran el éxito de la técnica. La técnica fue desarrollada para realizar mediciones bioenergéticas después de la criopreservación. Los resultados mostrados comparan las células antes y después de la medición, ya que no se observan diferencias estadísticamente significativas, se puede suponer que este método de conservación es apto para su almacenamiento durante más de 1 mes.
Tabla 1: Soluciones, tampones y consumibles. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Este protocolo proporciona un medio para aislar y criopreservar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre humana de una manera adecuada para análisis bioenergéticos. El método descrito ofrece la posibilidad de aislar PBMCs suavemente y en grandes cantidades, con alta viabilidad y suficientes células para mediciones bioenergéticas. Tiene la desventaja de que, incluso con interrupciones mínimas, se producen aislamientos prolongados, pero la criopreservación posterior permite una medición de la bioenergética independiente del tiempo. Con este método, las muestras se pueden recolectar y medir en puntos de tiempo posteriores. También es adecuado para recoger muestras en ensayos multicéntricos y medir parámetros al mismo tiempo en una ubicación central.
La criopreservación ofrece la posibilidad de almacenar células durante un largo período de tiempo y medirlas posteriormente. El aislamiento de las PBMC es un proceso que requiere mucho tiempo, de unas 2-3 horas, y solo permite tomar un pequeño número de muestras a la vez. No es posible que un solo experimentador aísle PBMC frescas de más de 2 individuos simultáneamente sin pérdida de calidad. La necesidad de realizar experimentos de seguimiento con células frescas complica el procedimiento y, por lo tanto, se asocia con estrés adicional y problemas de tiempo. Separar el aislamiento de la realización de los experimentos puede simplificar los estudios y hacer que las pruebas sean más estandarizadas. En concreto, la extracción de sangre, el aislamiento, la criopreservación de una muestra colectiva, seguida de la realización de experimentos específicos. Las muestras se pueden recolectar en diferentes lugares y en diferentes momentos y luego medirse al mismo tiempo en el mismo lugar.
La bioenergética desempeña un papel esencial en el metabolismo celular, es probable que la bioenergética alterada que conduce a la disfunción mitocondrial desempeñe un papel importante en el envejecimiento y, posteriormente, en la neurodegeneración y otras enfermedades25,26. Los métodos descritos anteriormente se pueden utilizar en PBMC recién aisladas y criopreservadas para monitorear los cambios. Estas mediciones bioenergéticas pueden utilizarse como base para estudios clínicos e investigaciones.
Hay varios factores limitantes para esta técnica y se deben sopesar las ventajas y desventajas de la medición fresca frente a la medición después de la criopreservación. La criopreservación es generalmente muy exigente para los PBMC; Por lo tanto, es importante mantener el número de factores estresantes lo más bajo posible. El tiempo es esencial, ya que las células deben pasar el menor tiempo posible en DMSO, que es tóxico para las PBMC, cada paso debe prepararse antes de descongelar o congelar las células con DMSO. Además, para las mediciones bioenergéticas, el almacenamiento en un congelador a -80 °C resultó ineficaz: las muestras deben transferirse a nitrógeno líquido después de 24 h. Una velocidad de congelación controlada es obligatoria si el enfriamiento es demasiado rápido, el agua que queda en las células se congela y forma cristales que dañan las membranas y compartimentos celulares. Una velocidad de enfriamiento demasiado lenta conduce a un contacto prolongado con el tóxico DMSO. Los congeladores celulares que utilizan isopropanol pueden alcanzar una velocidad de congelación de 1 °C/min en un congelador de -80 °C. Debe evitarse la descongelación y la recongelación de las PBMC.
Este protocolo describe el aislamiento y la criopreservación de PBMCs. Con el fin de confirmar la funcionalidad de los PBMC después de la preservación para mediciones bioenergéticas, se llevaron a cabo mediciones ejemplares de bioenergética. Este protocolo ha sido optimizado para la medición de factores bioenergéticos. Los factores bioenergéticos se pueden determinar después de la criopreservación, pero también se puede determinar para otros protocolos si las mediciones son posibles después de la criopreservación.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al equipo clínico del Hospital Universitario de Giessen-Marburg por la extracción de sangre. Este trabajo fue financiado por la universidad Justus Liebig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | - | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | - | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | - | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | - | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | - | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | - | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | - | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | - | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | - | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | - | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al.
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M.
