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Immunology and Infection

पूर्व विवो लाइव सेल इमेजिंग के माध्यम से लार ग्रंथि में सेल सेल बातचीत पूछताछ

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65819
Automatic Translation
1, 1, 1
1The Centre for Regenerative Medicine, Institute for Regeneration and Repair, The University of Edinburgh

Summary

इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग समय में केवल एक स्नैपशॉट में जटिल, समय-निर्भर जैविक प्रक्रियाओं का निरीक्षण करने की क्षमता से विवश है। यह अध्ययन सटीक-कट माउस सबमांडिबुलर ग्रंथि स्लाइस पर आयोजित एक लाइव-इमेजिंग दृष्टिकोण की रूपरेखा तैयार करता है। यह दृष्टिकोण होमियोस्टेसिस के दौरान सेल-सेल इंटरैक्शन के वास्तविक समय के अवलोकन और पुनर्जनन और मरम्मत की प्रक्रियाओं की अनुमति देता है।

Abstract

लार ग्रंथि पुनर्जनन एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें विभिन्न सेल प्रकारों के बीच जटिल बातचीत शामिल है। हाल के अध्ययनों ने पुनर्योजी प्रतिक्रिया को चलाने में मैक्रोफेज द्वारा निभाई गई महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला है। हालांकि, इस महत्वपूर्ण भूमिका की हमारी समझ मुख्य रूप से निश्चित ऊतक बायोप्सी से प्राप्त स्थिर विचारों पर निर्भर है। इस सीमा को दूर करने और वास्तविक समय में इन इंटरैक्शन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, यह अध्ययन लार ग्रंथि ऊतक पूर्व विवो संवर्धन और सेल प्रवास की लाइव छवियों पर कब्जा करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है।

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: सबसे पहले, माउस सबमांडिबुलर लार ग्रंथि ऊतक को ध्यान से एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके कटा हुआ है और फिर एक वायु-तरल इंटरफ़ेस पर सुसंस्कृत किया जाता है। इन स्लाइस जानबूझकर घायल हो सकता है, उदाहरण के लिए, विकिरण के संपर्क के माध्यम से, सेलुलर क्षति प्रेरित करने और पुनर्योजी प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए. ब्याज की विशिष्ट कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए, वे अंतर्जात लेबल किया जा सकता है, इस तरह के आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से एकत्र लार ग्रंथि ऊतक का उपयोग करके जहां एक विशेष प्रोटीन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ चिह्नित है. वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंटली-संयुग्मित एंटीबॉडी को ब्याज के विशिष्ट सेल सतह मार्करों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को दागने के लिए नियोजित किया जा सकता है। एक बार तैयार होने के बाद, लार ग्रंथि स्लाइस 12 घंटे की अवधि में एक उच्च सामग्री confocal इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर लाइव इमेजिंग के अधीन हैं, छवियों 15 मिनट के अंतराल पर कब्जा कर लिया. परिणामी छवियों को तब एक फिल्म बनाने के लिए संकलित किया जाता है, जिसे बाद में मूल्यवान सेल व्यवहार मापदंडों को निकालने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। यह अभिनव विधि शोधकर्ताओं को चोट के बाद लार ग्रंथि के भीतर मैक्रोफेज इंटरैक्शन की जांच करने और बेहतर ढंग से समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है, जिससे इस गतिशील जैविक संदर्भ में खेलने पर पुनर्योजी प्रक्रियाओं के बारे में हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाया जा सके।

Introduction

मैक्रोफेज को पुनर्जनन और मरम्मत की प्रक्रियाओं में तेजी से महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है, जो उनके शास्त्रीय प्रतिरक्षा समारोह 1,2 से परे है। दरअसल, मैक्रोफेज पुनर्जनन से संबंधित प्रक्रियाओं की अधिकता में शामिल हैं, मरम्मत के सभी चरणों में महत्वपूर्ण नियामक गतिविधि का प्रदर्शन, साथ ही निशान गठन और फाइब्रोसिस 3,4. ऊतक-निवासी मैक्रोफेज विभिन्न सेलुलर फेनोटाइप चलाने वाले जटिल तंत्र के साथ अत्यधिक विषम सेल प्रकार हैं, और वे अंग विकास, कार्य और होमियोस्टेसिस में आवश्यक भूमिका निभाते हैं (जैसा कि5 में समीक्षा की गई है)। ऊतक-निवासी मैक्रोफेज शुरू में जर्दी थैली और भ्रूण यकृत में अग्रदूतों से उत्पन्न होते हैं, और बाद में उन्हें मौजूदा मैक्रोफेज की दीर्घायु और ऊतक या आला के आधार पर अलग-अलग दरों पर प्रसार या अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न रक्त मोनोसाइट्स द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जिसके भीतर वेरहते हैं 6,7.

महत्वपूर्ण रूप से, ऊतक-निवासी मैक्रोफेज सभी ऊतकों में फैले हुए हैं और विविध अंग कार्यों में योगदान करते हैं। वे विशिष्ट विशिष्ट कार्यों को करने के लिए अपने माइक्रोएन्वायरमेंट द्वारा विशिष्ट रूप से प्रोग्राम किए जाते हैं। इस कारण से, ऊतक के भीतर मैक्रोफेज का स्थानीयकरण उनके कार्य में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, फेफड़े, स्तन ग्रंथि, आंत, त्वचा और मांसपेशियों में देखी गई अद्वितीय आबादी के साथ 8,9,10. स्तन ग्रंथि के विकास के दौरान, डक्टल मैक्रोफेज अंतरंग डक्टल पेड़ के साथ जुड़े हुए हैं, और उनकी कमी के परिणामस्वरूप काफी कम शाखाओं में11. इसके अलावा, गर्भावस्था में यौवन और एल्वोलोजेनेसिस के दौरान मॉर्फोजेनेसिस के लिए मैक्रोफेज की आवश्यकता होती है, जहां वे सक्रिय रूप से उपकला की निगरानी करते हैं। मांसपेशियों की चोट में, मैक्रोफेज की एक विशिष्ट आबादी चोट स्थल के भीतर "रहती है", एक क्षणिक जगह प्रदान करती है जिसमें वे स्टेम सेल प्रसार के लिए आवश्यक प्रसार-प्रेरित संकेतों की आपूर्ति करते हैं। इस प्रकार, वे मरम्मत प्रक्रिया2 को नियंत्रित करने में विशिष्ट मैक्रोफेज आबादी की विशेष भूमिका प्रदर्शित करते हैं। फेफड़े में, एक समान घटना होती है जहां आईएल -1 बी 12 की रिहाई के माध्यम से क्षति से जुड़े क्षणिक पूर्वज में रूपांतरण के लिए अंतरालीय मैक्रोफेज प्राइम इंटरल्यूकिन (आईएल) -आर1-व्यक्त वायुकोशीय प्रकार II (एटी 2) कोशिकाएं। इसके अलावा, हाल के शोध से पता चला है कि मैक्रोफेज विकिरण चोट के बाद माउस submandibular लार ग्रंथि (एसएमजी) के उत्थान के लिए आवश्यक हैं, और उनकी अनुपस्थिति में, उपकला उत्थान13 बाधित है. एक साथ लिया गया, यह डेटा ऊतक की चोट के बाद क्षणिक भड़काऊ निशानों में मैक्रोफेज सक्रियण और कार्य के महत्व पर प्रकाश डालता है, साथ ही होमियोस्टेसिस के दौरान भी।

मैक्रोफेज सक्रिय कोशिकाएं हैं, और उनके कार्यों में प्रत्यक्ष सेल-सेल संपर्क14,15, साथ ही घुलनशील कारकों 2,16 के स्राव जैसे अधिक अप्रत्यक्ष तरीकों सहित विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों के साथ बातचीत शामिल है, जो आला विनियमन के लिए आवश्यक हैं। शास्त्रीय immunofluorescent इमेजिंग इन बातचीत को सुलझाना शुरू करने के लिए उपयोगी है, यह समय में केवल एक स्नैपशॉट चित्रण द्वारा सीमित है, जिससे एक अत्यधिक गतिशील पुनर्योजी प्रक्रिया17,18 के लिए महत्वपूर्ण कई timepoints छोड़ने. चूंकि समय का महत्व और उत्थान की विभिन्न तरंगों का उद्भव तेज ध्यान में आता है, इसलिए इन प्रक्रियाओं को अधिक विस्तार से विच्छेदित करना आवश्यक है।

रेडियोथेरेपी कैंसर से पीड़ित कई लोगों के लिए एक जीवन रक्षक उपचार है। जबकि अक्सर ट्यूमर (ओं) को सिकोड़ने या खत्म करने में प्रभावी होता है, रेडियोथेरेपी विकिरण क्षेत्र में पड़े स्वस्थ ऊतकों को भी नुकसान पहुंचा सकती है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकती है। विकिरण चोट तेजी से मैक्रोफेज भर्ती, और प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष immunomodulatory प्रतिक्रियाओं19,20 प्रेरित कर सकते हैं. लार ग्रंथियों अक्सर अनजाने में सिर और गर्दन के कैंसर21,22 के लिए उपचार के दौरान विकिरणित कर रहे हैं, उपकला क्षति, सेल शोष, और फाइब्रोसिस23,24, xerostomia या पुरानी शुष्क मुंह25 में जिसके परिणामस्वरूप.

लार ग्रंथि सेल प्रकार और संरचनाओं की अधिकता से बना है, जिसमें उपकला कोशिकाओं (लार-उत्पादक एसिनार कोशिकाओं और लार-परिवहन डक्टल कोशिकाओं दोनों), मायोपीथेलियल कोशिकाओं, उपकला पूर्वज कोशिकाओं, नसों, रक्त वाहिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) शामिल हैं, लेकिन इन्हीं तक सीमित नहीं हैं। पुनर्योजी प्रतिक्रिया में इन सेल प्रकारों में से कई की भूमिका और प्रतिक्रिया पहले 26,27,28,29,30 वर्णित की गई है। हालांकि, ये विभिन्न कोशिकाएं होमियोस्टैसिस और पुनर्जनन के दौरान कैसे बातचीत करती हैं, और विशेष रूप से मैक्रोफेज जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाएं कैसे व्यवहार करती हैं, इसका कम अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है। यह पांडुलिपि एसएमजी मैक्रोफेज और पूर्व विवो ऊतक में ब्याज की अन्य कोशिकाओं के बीच लाइव इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक नई स्थापित विधि का वर्णन करती है। एसएमजी को एक वाइब्रेटोम पर काटा जाता है, सतह मार्करों के लिए दाग दिया जाता है, और 12 घंटे तक इमेज किया जाता है। इस पद्धति का उपयोग करके, मैक्रोफेज द्वारा आसपास की कोशिकाओं के फागोसाइटोसिस को देखा जा सकता है, मैक्रोफेज माइग्रेशन कैनेटीक्स का अध्ययन किया जा सकता है, और मैक्रोफेज और उपकला कोशिकाओं के बीच प्रत्यक्ष सेल-सेल इंटरैक्शन का प्रदर्शन किया जा सकता है।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं को यूके होम ऑफिस द्वारा अनुमोदित किया गया था और पीपीएल PB5FC9BD2 और PP0330540 के तहत प्रदर्शन किया गया था। सभी प्रयोग ARRIVAL दिशानिर्देशों और एडिनबर्ग विश्वविद्यालय के उन लोगों के अनुरूप हैं।

जंगली प्रकार के चूहों को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें)। Krt14CreER; R26mTmG चूहों को R14mCreER/+ चूहों31 को R26mTmG/mTmG चूहों32 के साथ पार करके घर में प्रतिबंधित किया गया था। सभी प्रयोगों में, महिला 8-10 सप्ताह पुराने चूहों का इस्तेमाल किया गया.

1. SMG एकत्र करना और एम्बेड करना

  1. माउस / चूहों उन्हें कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) की बढ़ती एकाग्रता के लिए उजागर करके euthanize. बाद में, 70% इथेनॉल (ईटीओएच) के साथ चीरा क्षेत्र स्प्रे करें और आसपास के ऊतक(चित्रा 1ए)से एसएमजी (एस) को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करने के लिए कैंची और संदंश का उपयोग करें। संदंश का उपयोग कर किसी भी वसा और संयोजी ऊतक निकालें, और बर्फ ठंड हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS, सामग्री की तालिका) युक्त एक संग्रह ट्यूब में ग्रंथि जगह है.
  2. टुकड़ों में ग्रंथि को मापने लगभग 1 सेमी2 संदंश का उपयोग कर प्रत्येक अलग.
  3. 4% को 50 डिग्री सेल्सियस तक गरम करें, और फिर इसे सीधे 35 मिमी डिश में डालें।
  4. एक अलग डिश में पिघला हुआ 50 डिग्री सेल्सियस agarose की एक छोटी राशि डालो और अच्छी तरह से अतिरिक्त agarose में चारों ओर ले जाकर ग्रंथि कुल्ला.
    नोट: ग्रंथियों से अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए यह कदम आवश्यक है। तरल पदार्थों की अधिकता ग्रंथियों को अगारोज का ठीक से पालन करने से रोक सकती है।
  5. ग्रंथि के 4-6 टुकड़ों को एगरोज में रखें, यह सुनिश्चित करना कि वे सपाट हैं और एक ही विमान (चित्रा 1 ए) में हैं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि ग्रंथियां अगर की सतह या प्लेट के नीचे को न छुएं।
  6. ढक्कन को 35 मिमी डिश पर रखें और प्लेट को बर्फ से ढकते हुए इसे एक आइसबॉक्स में स्थानांतरित करें।
  7. अगरोज जमने के लिए 5-10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।

2. सेक्शनिंग

  1. ध्यान से ग्रंथि एम्बेडेड agarose ब्लॉक के आसपास कटौती करने के लिए एक स्केलपेल का प्रयोग करें, ब्लॉक डिश से ऊतक युक्त हटाने. लगभग 5 मिमी की सीमा छोड़ दें।
  2. सुपरग्लू की एक बूंद को लागू करके वाइब्रेटोम ( सामग्री की तालिकादेखें) के चरण में एगरोज ब्लॉक संलग्न करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ब्लॉक की पूरी निचली सतह सुपरग्लू के संपर्क में है।
  3. लगभग 5 मिनट के लिए सख्त करने के लिए superglue की अनुमति दें. फिर, वाइब्रेटोम कक्ष को बर्फ-ठंडे 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ भरें जिसमें 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) होता है।
  4. वाइब्रेटोम कक्ष के दोनों तरफ और नीचे बर्फ जोड़ें।
    नोट: बहुत ठंडा वातावरण बनाए रखें और आवश्यकतानुसार बर्फ को बदलें।
  5. किसी भी अतिरिक्त agarose बंद ट्रिम और एक स्केलपेल के साथ चीरों बनाने के द्वारा ग्रंथि के प्रत्येक टुकड़े के बीच 5 मिमी अंतराल बनाने. यह अलग-अलग स्लाइस देगा।
  6. एगारोज ब्लॉक के चेहरे के साथ वाइब्रेटोम ब्लेड को संरेखित करें और वांछित स्लाइस मोटाई प्राप्त करने के लिए वर्गों के प्रारंभ और अंत बिंदुओं को सेट करें।
  7. काटने की प्रक्रिया शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि ब्लेड ब्लॉक के संपर्क में नहीं है। यह एहतियात गलती से अगारोज के बड़े टुकड़ों को काटने और नमूने के कुछ हिस्सों को खोने से रोकेगा।
  8. कम गति और उच्च कंपन (जैसे, 3 की गति और प्रत्येक पैरामीटर के लिए 1-10 के पैमाने पर 8-10 की कंपन सेटिंग) पर 150 माइक्रोन की मोटाई के साथ वर्गों को काटें(चित्रा 1ए)।
  9. एक बार एक अनुभाग काट दिया है और आसपास पीबीएस में जारी किया जाता है, एक तूलिका का उपयोग कर वर्गों को इकट्ठा करने और पी / एस के साथ पूर्व गर्म रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) मीडिया युक्त एक डिश में उन्हें जगह है.

3. संवर्धन और एसएमजी स्लाइस के धुंधला हो जाना

  1. संवर्धन
    1. एक 0.4 माइक्रोन फिल्टर शामिल है कि एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए RPMI मीडिया के 1.5 एमएल जोड़ें. सुनिश्चित करें कि फिल्टर के नीचे कोई हवाई बुलबुले नहीं फंसे हैं।
    2. एक तूलिका का उपयोग कर प्रत्येक फिल्टर पर 1-6 स्लाइस स्थानांतरण, स्लाइस तोड़ने के लिए नहीं ख्याल रखना.
      नोट: सुनिश्चित करें कि स्लाइस मीडिया में डूबे नहीं हैं, लेकिन इसके बजाय फिल्टर पर तैर रहे हैं। यदि वे पूरी तरह से जलमग्न हो जाते हैं, तो संस्कृति के दौरान उनका दम घुट सकता है।
    3. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, और हर 3 दिनों (चित्रा 1 ए) मीडिया को बदलते हैं।
    4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विकिरण का उपयोग करके 10 Gy गामा विकिरण की एक खुराक के साथ प्रयोगात्मक प्लेटों को विकिरणित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। बाद में, उन्हें इनक्यूबेटर में लौटा दें।
  2. लाइव इमेजिंग के लिए धुंधला हो जाना
    1. एक तूलिका का प्रयोग, धीरे फिल्टर से स्लाइस लिफ्ट और स्लाइस जलमग्न हो जाएगा, जहां अच्छी तरह से प्रति संस्कृति मीडिया के 500 माइक्रोन युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली में उन्हें जगह है.
    2. प्रासंगिक संयुग्मित एंटीबॉडी और परमाणु दाग ( सामग्री की तालिका देखें) उचित सांद्रता27 पर मीडिया के लिए जोड़ें.
    3. कोमल आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एंटीबॉडी के साथ स्लाइस सेते हैं।
    4. उन्हें संस्कृति मीडिया में डूबे और कोमल आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट washes के 3 दौर के लिए धोने द्वारा स्लाइस धो लें.

4. बढ़ते और लाइव इमेजिंग

  1. संदंश का प्रयोग, एक दो तरफा इमेजिंग स्पेसर के एक तरफ से टेप को हटाने और यह पालन करें, चिपकने वाला पक्ष नीचे, एक गिलास नीचे 6 अच्छी तरह से थाली के नीचे करने के लिए.
  2. स्पेसर के केंद्र में अंतराल में मीडिया के पिपेट 50 माइक्रोन।
  3. एक तूलिका का उपयोग कर मीडिया में टुकड़ा रखें, सुनिश्चित करें कि यह किसी भी फंस हवा बुलबुले के बिना फ्लैट झूठ बोल.
  4. एक विंदुक का प्रयोग, ध्यान से अंतराल से मीडिया के 20 माइक्रोन हटा दें.
  5. संदंश का उपयोग स्पेसर के शीर्ष पक्ष से टेप निकालें और शीर्ष पर एक 25 मिमी परिपत्र coverslip जगह. स्पेसर के किनारे के चारों ओर दबाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कवरस्लिप मजबूती से जुड़ जाए, बहुत अधिक बल (चित्रा 1 ए) लागू करके कवरस्लिप को तोड़ने के लिए सतर्क न रहें।
  6. वांछित समय अवधि या अंतराल के लिए एक confocal माइक्रोस्कोप पर टुकड़ा छवि (उदाहरण के लिए, एक 20x पानी के उद्देश्य का उपयोग कर 12 घंटे के लिए हर 15 मिनट).

Representative Results

सबमांडिबुलर लार ग्रंथि में चोट के लिए मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया अज्ञात बनी हुई है। इसमें यह भी शामिल है कि क्या वे ग्रंथि के भीतर विशिष्ट संरचनाओं में स्थानीयकरण और माइग्रेट करते हैं, साथ ही साथ वह दूरी और गति जिस पर वे माइग्रेट करते हैं। यह स्थिर इमेजिंग दृष्टिकोण के माध्यम से निर्धारित करना मुश्किल हो गया है।

इसे संबोधित करने के लिए, वास्तविक समय में मैक्रोफेज-उपकला सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित किया गया है। स्लाइस के immunofluorescent धुंधला एक अंतर्जात लेबल वंश अनुरेखण माउस मॉडल (चित्रा 1 ए और चित्रा 2 ए) के साथ संयुक्त किया गया था. इस मॉडल में, स्लाइस विकिरण चोट प्रेरित करने के लिए गामा विकिरण के 10 Gy के संपर्क में थे और नियंत्रण के रूप में सेवारत गैर विकिरणित स्लाइस के साथ, 2 ज, 3 दिन, और 4 दिनों के बाद विकिरण (आईआर) पर imaged थे. डेटा चार चैनलों से प्राप्त किए गए थे: होचस्ट (फोटोटॉक्सिसिटी को कम करने के लिए लेजर 425 का उपयोग करके), जीएफपी (488), डीटोमैटो (561), और एलेक्सा 647 (640)। एक जेड-स्टैक का प्रदर्शन किया गया था, और हर 2-3 माइक्रोन पर एक छवि कैप्चर की गई थी, जिसमें कुल 30 से 40 विमान एकत्र किए गए थे, जिसके परिणामस्वरूप 80-90 माइक्रोन की कुल ऊंचाई थी।

इस तकनीक का उपयोग और झिल्ली-बाध्य टमाटर (एमटी) संकेत और कैस्पासे3/7 गतिविधि का विश्लेषण करते हुए, यह स्पष्ट हो गया कि ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस ने अपनी उपकला संरचना को बनाए रखा, संस्कृति में जीवित रहे, और न्यूनतम कोशिका मृत्यु का प्रदर्शन किया। आंकड़ों से पता चला है कि R26mTmG चूहों32 से सबमांडिबुलर ग्रंथि के गैर-विकिरणित स्लाइस, 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत, उनके एमटी सिग्नल और उपकला वास्तुकला(चित्रा 1बी)को बरकरार रखा। हालांकि, पूर्व विवो विकिरण के बाद 3 दिनों में, एसिनार और डक्टल सेल शोष स्पष्ट था (चित्रा 1 बी; एसीनी और डक्टल संरचनाएं क्रमशः धराशायी सफेद और हरे रंग की रेखाओं द्वारा हाइलाइट की गईं), विवो विकिरण चोट13 के अनुरूप थीं। गैर-विकिरणित स्लाइस में एपोप्टोसिस नगण्य था, लेकिन विवो चोट33,34 के समान 4 दिनों के बाद विकिरणित स्लाइस में कैस्पेज़ 3/7+ कोशिकाओं का सबूत था। इसके अलावा, विवो डीएनए क्षति34,35,36,37 में विकिरणित स्लाइस recapitulated, के रूप में ऊंचा γH2AX38 द्वारा संकेत दिया गैर विकिरणित नियंत्रण(चित्रा 1D,E)की तुलना में. इस प्रकार, organotypic लार ग्रंथि स्लाइस संस्कृति में अच्छी व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया और विकिरण के लिए विवो ऊतक में इसी तरह का जवाब दिया.

इसके बाद, वास्तविक समय सेल-सेल इंटरैक्शन की जांच की गई। मैक्रोफेज सीधे GFP लेबल उपकला पूर्वज कोशिकाओं (Krt14CreER-GFP) के साथ बातचीत आईआर (चित्रा 2A और वीडियो 1) के बाद 3 दिनों में एक 12 घंटे समय अवधि में मनाया गया. उल्लेखनीय रूप से, यह स्पष्ट था कि मैक्रोफेज घंटों तक उपकला पूर्वज कोशिकाओं के करीब निकटता में रहे, अक्सर पूरे 12 घंटे इमेजिंग अवधि के संपर्क में रहे। इसके अलावा, मैक्रोफेज द्वारा उपकला कोशिकाओं के वास्तविक समय फागोसाइटोसिस मनाया गया था, यह पुष्टि करते हुए कि मैक्रोफेज स्लाइस कल्चर मॉडल (चित्रा 2बी, वीडियो 2 और वीडियो 3) में अपने पारंपरिक कार्य को पूरा करते हैं। इस तकनीक ने यह भी पहचाना कि मैक्रोफेज होमियोस्टेसिस और विकिरण की चोट के बाद दोनों के दौरान अपेक्षाकृत स्थिर होते हैं, संभवतः ऊतक के भीतर उनके उच्च घनत्व के कारण। यह दर्शाता है, पहली बार, कि लार ग्रंथि मैक्रोफेज होमियोस्टेसिस के दौरान या विकिरण की चोट के बाद बड़े पैमाने पर पलायन नहीं करते हैं। हालांकि, जबकि मैक्रोफेज ने महत्वपूर्ण प्रवास नहीं दिखाया, आसपास के ऊतक ने विकिरण के बाद गतिशीलता में वृद्धि प्रदर्शित की, जिसमें कई मैक्रोफेज सक्रिय रूप से लेबल उपकला कोशिकाओं के समूहों के आसपास बातचीत कर रहे थे। इसके अतिरिक्त, पूरी तरह से परमाणु धुंधला हो जाना के आधार पर, इस तकनीक ने हमें समय के साथ स्लाइस के भीतर सेल आंदोलन की कल्पना करने की अनुमति दी, अक्सर ऊतक (वीडियो 4) के भीतर 'माइग्रेट करने' के लिए दिखाई देने वाले पूरे नलिकाओं के साथ। संवर्धन प्रक्रिया के दौरान समय के साथ, यह स्पष्ट हो गया कि स्लाइस एक फ्लैट से एक गोलाकार जैसी आकृति विज्ञान में स्थानांतरित हो गए, यह सुझाव देते हुए कि स्लाइस के भीतर सेल आंदोलन एक संभावित पुनर्गठन घटना जैसा दिखता है, एक गोले जैसी संरचना में उनके पुनर्व्यवस्था के कारण होने की संभावना है।

अंत में, इस परख द्वारा उत्पन्न लाइव इमेजिंग डेटा मात्रात्मक सेल व्यवहार, जैसे माइग्रेशन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. व्यक्तिगत कोशिकाओं का पता लगाया और खंडित (चित्रा 3 ए) किया जा सकता है, और माइग्रेशन एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री और वीडियो 5 की तालिकादेखें) का उपयोग कर मापा जा सकता है. इसके अलावा, निकटतम वस्तु विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या कोशिकाएं, इस मामले में, मैक्रोफेज, ब्याज की अन्य कोशिकाओं के करीब माइग्रेट करती हैं, इस मामले में, Krt14CreER-GFP + कोशिकाएं, और समय के साथ यह गतिशील कैसे बदलता है(चित्रा 3बी)।

Figure 1
चित्रा 1: सटीक-कट लार ग्रंथि ऊतक स्लाइस में विवो प्रतिक्रिया में पुनर्पूंजीकरण (ए) प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध. (बी) ताजा सबमांडिबुलर ग्रंथि (एसएमजी) ऊतक से प्राप्त झिल्ली-बाध्य टमाटर की प्रतिनिधि छवियां, 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत एसएमजी स्लाइस, या एसएमजी स्लाइस 3 या 7 दिन पहले 10 जी गामा विकिरण की एक खुराक के साथ विकिरणित होते हैं। धराशायी सफेद रेखाएं उदाहरण एसिनार संरचनाओं को इंगित करती हैं, और धराशायी हरी रेखाएं उदाहरण डक्टल संरचनाओं को इंगित करती हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (सी) कैस्पासे-3/7 अभिव्यक्ति की प्रतिनिधि छवियों को 10 जी गामा विकिरण 2 घंटे या 4 दिन पहले की एक खुराक के साथ विकिरणित अनियंत्रित एसएमजी स्लाइस या एसएमजी स्लाइस से प्राप्त किया गया था। हरे तीर के निशान सकारात्मक नाभिक का संकेत देते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (डी) γH2AX अभिव्यक्ति की प्रतिनिधि छवियों unmanipulated SMG स्लाइस या एसएमजी स्लाइस 10 Gy गामा विकिरण की एक खुराक के साथ विकिरणित से प्राप्त 3 दिन पहले. स्केल बार = 20 माइक्रोन। (ई) EpCAM+ उपकला कोशिकाओं में γH2AX की प्रतिनिधि अभिव्यक्ति 10 Gy गामा विकिरण 2 घंटे और 3 दिन पहले की एक खुराक के साथ विकिरणित unmanipulated SMG स्लाइस से। SSA = पार्श्व प्रकीर्ण क्षेत्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मैक्रोफेज-उपकला सेल इंटरैक्शन और फागोसाइटोसिस की लाइव इमेजिंग। (ए) KRT14 + पूर्वज कोशिकाओं और उनके संतान (Krt14CreER-GFP + कोशिकाओं) और विकिरण के बाद मैक्रोफेज के बीच बातचीत की अनुक्रमिक अभी भी छवियां। लाइव सेल इमेजिंग 90 मिनट की अवधि में सेलुलर गतिशीलता को कैप्चर करता है। स्केल बार = 20 माइक्रोन। संबंधित वीडियो वीडियो 1 है। (बी) एक मैक्रोफेज फागोसाइटोसिंग एक उपकला सेल की अनुक्रमिक अभी भी छवियां। लाइव सेल इमेजिंग 60 मिनट की अवधि में प्रक्रिया को दर्शाता है। सफेद तीर मैक्रोफेज की ओर इशारा करते हैं, और पीले तीर फागोसाइटोसिस से गुजरने वाली कोशिका के नाभिक को इंगित करते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। संबंधित वीडियो वीडियो 2 है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेलुलर गतिशीलता विश्लेषण के लिए लाइव इमेजिंग। (ए) छवि इस तरह के प्रवास ( वीडियो 5 देखें) के रूप में सेलुलर व्यवहार मापदंडों, का विश्लेषण करने के लिए व्यक्तिगत सेल पहचान और विभाजन सचित्र. कोशिकाओं को व्यक्तिगत सेल और ट्रैक भेद के लिए यादृच्छिक रूप से छद्म रंग दिया जाता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बी) व्यक्तिगत Krt14CreER-GFP + कोशिकाओं के निकटतम वस्तु की दूरी (माइक्रोन में) की मात्रा का ठहराव 10 समय बिंदुओं (छवियों हर 5 मिनट पर कब्जा कर लिया) से अधिक प्लॉट किया गया। डेटा प्रति अच्छी तरह से औसत मूल्य के रूप में प्रस्तुत किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: लाइव इमेजिंग विकिरण के बाद KRT14 + पूर्वज कोशिकाओं/संतान और मैक्रोफेज के बीच गतिशील बातचीत का खुलासा. स्लाइस लाइव इमेजिंग से पहले एक एकल 10 Gy गामा विकिरण खुराक के संपर्क में थे। Krt14CreER-GFP+ कोशिकाओं को हरे रंग में, मैक्रोफेज (F4/80+) लाल रंग में और सियान में नाभिक में दर्शाया जाता है। वीडियो में एक एकल जेड-स्टैक शामिल है, जो हर 15 मिनट में कैप्चर की गई छवियों के साथ 12 घंटे की संस्कृति अवधि में फैला हुआ है। कृपया वीडियो डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: लाइव इमेजिंग एक उपकला सेल engulfing एक मैक्रोफेज कैप्चर. मैक्रोफेज (F4/80+) को लाल रंग में दर्शाया गया है, और नाभिक को सियान में दिखाया गया है। वीडियो में एक एकल जेड-स्टैक होता है और हर 15 मिनट में ली गई छवियों के साथ 12 घंटे की संस्कृति अवधि तक फैला होता है।

वीडियो 3: अधिकतम प्रक्षेपण लाइव इमेजिंग एक उपकला सेल engulfing एक मैक्रोफेज दिखा रहा है. मैक्रोफेज (F4/80+) लाल रंग में प्रदर्शित होते हैं, और नाभिक सियान में दिखाए जाते हैं। वीडियो 80 माइक्रोन (एक एकल विमान वीडियो 2 में प्रस्तुत किया गया है) कुल जेड स्टैक छवियों की एक अधिकतम प्रक्षेपण सुविधाएँ और छवियों हर 15 मिनट लिया के साथ एक 12 घंटे संस्कृति अवधि फैला.

वीडियो 4: लाइव इमेजिंग विकिरण के बाद संस्कृति में लार ग्रंथि उपकला के गतिशील व्यवहार को दर्शाती है। स्लाइस लाइव इमेजिंग से पहले एक एकल 10 Gy गामा विकिरण खुराक के अधीन थे। मैक्रोफेज (F4/80+) को लाल रंग में, सियान में नाभिक में दर्शाया जाता है। वीडियो में एक एकल जेड-स्टैक शामिल है, जो हर 15 मिनट में कैप्चर की गई छवियों के साथ 12 घंटे की संस्कृति अवधि में फैला हुआ है।

वीडियो 5: समय के साथ मात्रात्मक सेल माइग्रेशन ट्रैकिंग। यह वीडियो लाइव इमेजिंग वीडियो से सेल पटरियों के व्यक्तिगत अनुरेखण को दर्शाता है. तीर सेल ट्रैक को इंगित करते हैं, और कोशिकाएं व्यक्तिगत रूप से छद्म रंग की होती हैं। वीडियो में एक एकल जेड-स्टैक होता है और हर 15 मिनट में ली गई छवियों के साथ 1 घंटे की संस्कृति अवधि तक फैला होता है।

Discussion

लार ग्रंथि ऊतक पूर्व विवो संस्कृति करने की क्षमता दोनों homeostasis और चोट प्रतिक्रिया के संदर्भ में सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रस्तुत करता है. हालांकि माउस submandibular ग्रंथि के intravital इमेजिंग39,40 संभव है, इस तकनीक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस मॉडल का उपयोग करने पर निर्भर करता है अंतर्जात ब्याज की कोशिकाओं लेबल और टर्मिनल संज्ञाहरण के तहत किया जाना चाहिए. यहाँ, संस्कृति submandibular ग्रंथि स्लाइस पूर्व vivo के लिए एक विधि का वर्णन किया है, सेलुलर वास्तुकला और सेल सेल बातचीत को बनाए रखने. यह दृष्टिकोण वर्तमान लाइव इमेजिंग तकनीकों को परिष्कृत करता है और इंट्राविटल इमेजिंग का विकल्प प्रदान करता है।

इस तकनीक का उपयोग ऊतक के दीर्घकालिक रखरखाव एक हवा तरल इंटरफेस पर संवर्धन स्लाइस पर निर्भर करता है. पिछले एक्सप्लांट मॉडल 26,41 ने केवल कुछ दिनों के लिए सफल संस्कृति हासिल की है क्योंकि वे मीडिया में डूबे हुए थे और अनिवार्य रूप से "घुटन" थे। इसके विपरीत, एक वायु-तरल इंटरफ़ेस संस्कृति प्रणाली का उपयोग एक विस्तारित अवधि के लिए ऊतक स्वास्थ्य और संरचना को बनाए रखता है, उच्च गुणवत्ता वाली इमेजिंग सुनिश्चित करता है। इमेजिंग से पहले एसएमजी स्लाइस बढ़ते की विधि, मीडिया की एक छोटी राशि के साथ और टुकड़ा फ्लैट रखने के लिए एक अंतरिक्ष प्रतिबंधित कक्ष के भीतर, तकनीक की सफलता के लिए अभिन्न अंग है. इस परख में कोशिकाओं के दृश्य अंतर्जात लेबल रिपोर्टर चूहों या fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी पर निर्भर करता है. ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस मॉडल और विशिष्ट सेल प्रकारों और सबसेट को लक्षित करने वाले संयुग्मित एंटीबॉडी की प्रचुरता इस विधि को विभिन्न सेल-विशिष्ट इंटरैक्शन की खोज के लिए उपयुक्त बनाती है।

जबकि यह विधि सीटू में ऊतक का एक अच्छा मॉडल प्रदान करती है और पूर्व विवो विकिरण चोट के परिणामस्वरूप एसिनार और डक्टल स्ट्रक्चर शोष होता है, जो विवो13 में होता है, कुछ तत्वों को पूर्व विवो में पुन: प्रस्तुत नहीं किया जा सकता है। इनमें कार्यशील वास्कुलचर और न्यूरोनल इनपुट की कमी, साथ ही घुसपैठ करने वाली भड़काऊ कोशिकाओं की अनुपस्थिति शामिल है। लार ग्रंथि homeostasis और उत्थान 26,42 में रक्त वाहिकाओं और नसों की अच्छी तरह से प्रलेखित भूमिका और लार ग्रंथि समारोह में टी और बी कोशिकाओं के रूप में टी और बी कोशिकाओं के रूप में प्रवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं43, के महत्व को देखते हुए, चोट प्रतिक्रिया, संक्रमण, और Sjögren सिंड्रोम (एसएस) रोगजनन (44 में समीक्षा के रूप में), इस परख कुछ महत्वपूर्ण सेलुलर बातचीत याद कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, बहुत तेजी से प्रवासी घटनाओं, जैसे प्राकृतिक हत्यारा (एनके) सेल45 और डेंड्राइटिक सेल (डीसी)46 आंदोलन, हर 15 मिनट इमेजिंग द्वारा याद किया जा सकता है। हालांकि, इमेजिंग अंतराल ब्याज की विशिष्ट सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और जेड ढेर के माध्यम से 3 आयामों में छवि करने की क्षमता 3 डी सेल आंदोलन के आकलन की अनुमति देता है. इमेजिंग के दौरान ऊतक को सुरक्षित रूप से बढ़ते हुए मात्रा का ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे सेल ट्रैकिंग माप। इसके अलावा, हालांकि इस अध्ययन माउस ऊतक का उपयोग किया, प्रोटोकॉल मानव लार ग्रंथियों में सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक व्यवहार्य विधि प्रदान करता है, अन्य तरीकों के माध्यम से अप्राप्य मूल्यवान अनुवाद संबंधी जानकारी उत्पन्न.

जबकि होमियोस्टेसिस और पुनर्जनन में ऊतक-निवासी मैक्रोफेज की भूमिका कई ऊतकों 2,10,11,12में प्रदर्शित की गई है, लार ग्रंथियों में उनकी भूमिका काफी हद तक अनुत्तरित है। हालांकि यह ज्ञात है कि मैक्रोफेज विकिरण चोट13 के बाद उपकला उत्थान के लिए आवश्यक हैं, इस प्रभाव अंतर्निहित सटीक तंत्र अज्ञात रहते हैं. लार ग्रंथि स्लाइस के लाइव इमेजिंग वास्तविक समय दृश्य और जटिल ऊतक गतिशीलता, जो अक्सर पारंपरिक फोकल इमेजिंग द्वारा याद किया जाता है के विश्लेषण सक्षम बनाता है. इसके अतिरिक्त, यह स्पष्ट है कि मैक्रोफेज विवो47,48,49 में विभिन्न कार्यों का प्रदर्शन करते हुए आकार में गतिशील परिवर्तन से गुजरते हैं, और यह प्रोटोकॉल संभवतः निश्चित ऊतक में एक विशिष्ट स्थिर दृश्य की तुलना में इन परिवर्तनों का बेहतर प्रतिनिधित्व प्रदान करता है। भविष्य के अध्ययन इस तकनीक का उपयोग यह जांचने के लिए कर सकते हैं कि होमियोस्टेसिस, चोट और पुनर्जनन / संकल्प के दौरान सेल-सेल संचार कैसे बदलता है। यह दृष्टिकोण प्रमुख सिग्नलिंग मार्गों और घटनाओं को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी होगा जो अंततः चिकित्सीय लाभ प्रदान कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एसई को वेलकम ट्रस्ट अनुदान 108906/जेड/15/जेड द्वारा वित्त पोषित किया जाता है; EE को UKRI/MRC अनुदान MR/S005544/1 और एडिनबर्ग विश्वविद्यालय से चांसलर फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। चित्रा 1 ए BioRender.com के साथ बनाया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc) Avantor/VWR 734-2240 Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm
24 well plate Corning 3524
35 mm dish Falcon 353001
6 well plate Corning 3516
Coverslips Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 111650 Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter 
Double-sided sticker Grace Bio-Labs 654004 SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD
EtOH Scientific Laboratories Supplies CHE1924 Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7%
F4/80 antibody Invitrogen 17-4801-82 F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience
Forceps Fine Science Tools 91113-10 Student Fine Forceps Straight Broad Shanks
Glass bottom 6 well plate Cellvis P06-1.5H-N 6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14025050 +calcium +magnesium, no phenol red
Hoechst Sigma Aldrich 14533 Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Ice box Fisher Scientific 11339623 Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid
Imaging and analysis software Harmony
Low Melting Agarose Merck  A9414-25G
Paintbrush Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 20012027
RPMI ThermoFisher 12634010 Gibco Advanced DMEM/F-12
Scalpel Swann-Morton Disposable scalpels, No. 11 blade
Scissors  Fine Science Tools 14088-10 Extra Narrow Scissors 10.5 cm
Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator JL Shepherd & Associates
Superglue Bostik Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong
Vibratome Leica Leica VT 1000 S
Vibratome blades Astra Superior Platinum Double Edge blade
Wild-type (C57BL/BJ) mice Charles River

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 201
<em>पूर्व विवो</em> लाइव सेल इमेजिंग के माध्यम से लार ग्रंथि में सेल सेल बातचीत पूछताछ
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Elder, S., Cholewa-Waclaw, J.,… More

Elder, S., Cholewa-Waclaw, J., Emmerson, E. Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging. J. Vis. Exp. (201), e65819, doi:10.3791/65819 (2023).

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