Summary
Immunofluorescerende billeddannelse er begrænset af evnen til at observere komplekse, tidsafhængige biologiske processer i blot et enkelt øjebliksbillede i tide. Denne undersøgelse skitserer en live-imaging tilgang udført på præcisionskårne mus submandibulære kirtel skiver. Denne tilgang giver mulighed for realtidsobservation af celle-celle-interaktioner under homeostase og processerne for regenerering og reparation.
Abstract
Regenerering af spytkirtlen er en kompleks proces, der involverer indviklede interaktioner mellem forskellige celletyper. Nylige undersøgelser har kastet lys over den centrale rolle, som makrofager spiller i at drive det regenerative respons. Vores forståelse af denne kritiske rolle har dog primært været afhængig af statiske synspunkter opnået fra faste vævsbiopsier. For at overvinde denne begrænsning og få indsigt i disse interaktioner i realtid skitserer denne undersøgelse en omfattende protokol til dyrkning af spytkirtelvæv ex vivo og optagelse af levende billeder af cellemigration.
Protokollen involverer flere vigtige trin: Først skæres musens submandibulære spytkirtelvæv omhyggeligt ved hjælp af et vibratomt og dyrkes derefter ved en luft-væske-grænseflade. Disse skiver kan forsætligt skades, for eksempel gennem udsættelse for stråling, for at fremkalde cellulær skade og udløse det regenerative respons. For at spore specifikke celler af interesse kan de mærkes endogent, såsom ved at bruge spytkirtelvæv indsamlet fra genetisk modificerede mus, hvor et bestemt protein er markeret med grønt fluorescerende protein (GFP). Alternativt kan fluorescerende konjugerede antistoffer anvendes til at plette celler, der udtrykker specifikke celleoverflademarkører af interesse. Når spytkirtelskiverne er tilberedt, udsættes de for levende billeddannelse ved hjælp af et konfokal billeddannelsessystem med højt indhold over en varighed på 12 timer med billeder taget med 15 minutters intervaller. De resulterende billeder kompileres derefter for at skabe en film, som efterfølgende kan analyseres for at udtrække værdifulde celleadfærdsparametre. Denne innovative metode giver forskere et stærkt værktøj til at undersøge og bedre forstå makrofaginteraktioner i spytkirtlen efter skade og derved fremme vores viden om de regenerative processer, der er på spil i denne dynamiske biologiske kontekst.
Introduction
Makrofager har vist sig at spille stadig vigtigere roller i regenererings- og reparationsprocesserne, der strækker sig ud over deres klassiske immunfunktion 1,2. Faktisk er makrofager involveret i en overflod af processer relateret til regenerering, der udviser kritisk regulatorisk aktivitet i alle stadier af reparation samt ardannelse og fibrose 3,4. Vævsresidente makrofager er meget heterogene celletyper med komplekse mekanismer, der driver forskellige cellulære fænotyper, og de spiller væsentlige roller i organudvikling, funktion og homeostase (som gennemgået i5). Vævsresidente makrofager opstår oprindeligt fra forstadier i æggeblommesækken og føtal lever, og de erstattes efterfølgende af proliferation eller af knoglemarvsafledte blodmonocytter med varierende hastigheder afhængigt af levetiden for eksisterende makrofager og vævet eller nichen, inden for hvilket de befinder sig 6,7.
Det er vigtigt, at vævsresidente makrofager spredes gennem alle væv og bidrager til forskellige organfunktioner. De er unikt programmeret af deres mikromiljø til at udføre nichespecifikke funktioner. Af denne grund giver lokaliseringen af makrofager i vævet indsigt i deres funktion med unikke populationer observeret i lungen, brystkirtlen, tarmen, huden og musklerne 8,9,10. Under brystkirteludvikling er duktale makrofager tæt forbundet med duktaltræet, og deres udtømning resulterer i signifikant reduceret forgrening11. Desuden kræves makrofager til morfogenese under puberteten og alveologenese under graviditet, hvor de aktivt overvåger epitelet. Ved muskelskade "bor" en bestemt population af makrofager inden for skadestedet, hvilket giver en forbigående niche, hvor de leverer proliferationsinducerede signaler, der kræves til stamcelleproliferation. Således udviser de den specialiserede rolle, som forskellige makrofagpopulationer spiller i styringen af reparationsprocessen2. I lungen forekommer et lignende fænomen, hvor interstitielle makrofager primer interleukin (IL)-R1-ekspressive alveolære type II (AT2) celler til omdannelse til skadeassocierede forbigående forfædre gennem frigivelse af IL-1B12. Desuden har nyere forskning vist, at makrofager er afgørende for regenerering af musens submandibulære spytkirtel (SMG) efter bestrålingsskade, og i deres fravær forstyrres epitelregenerering13. Samlet set fremhæver disse data vigtigheden af makrofagaktivering og funktion i forbigående inflammatoriske nicher efter vævsskade såvel som under homeostase.
Makrofager er aktive celler, og deres funktioner involverer interaktioner med en række forskellige celletyper, herunder direkte celle-cellekontakt14,15, samt mere indirekte metoder såsom sekretion af opløselige faktorer 2,16, som er afgørende for nicheregulering. Mens klassisk immunfluorescerende billeddannelse er nyttig til at begynde at optrævle disse interaktioner, er den begrænset ved kun at skildre et enkelt øjebliksbillede i tid og derved udelade adskillige tidspunkter, der er kritiske for en meget dynamisk regenerativ proces17,18. Da vigtigheden af timing og fremkomsten af forskellige bølger af regenerering kommer i skarpere fokus, er det vigtigt at dissekere disse processer mere detaljeret.
Strålebehandling er en livreddende behandling for mange mennesker diagnosticeret med kræft. Selvom det ofte er effektivt til at krympe eller eliminere tumoren (e), kan strålebehandling også skade sunde væv, der ligger i strålingsfeltet og fremkalde et immunrespons. Strålingsskade kan fremkalde hurtig makrofagrekruttering og direkte og indirekte immunmodulerende reaktioner19,20. Spytkirtlerne bestråles ofte utilsigtet under behandling for hoved- og halskræft21,22, hvilket fører til epitelskader, celleatrofi og fibrose23,24, hvilket resulterer i xerostomi eller kronisk mundtørhed25.
Spytkirtlen består af en overflod af celletyper og strukturer, herunder men ikke begrænset til epitelceller (både spytproducerende acinarceller og spyttransporterende duktale celler), myoepitelceller, epitelstamceller, nerver, blodkar, immunceller, fibroblaster og ekstracellulær matrix (ECM). Mange af disse celletypers rolle og respons i det regenerative respons er tidligere beskrevet 26,27,28,29,30. Men hvordan disse forskellige celler interagerer under homeostase og regenerering, og især hvordan immunceller som makrofager opfører sig, er mindre godt undersøgt. Dette manuskript beskriver en nyetableret metode til at studere de levende interaktioner mellem SMG-makrofager og andre celler af interesse i ex vivo-væv. SMG skæres på et vibraatom, farves til overflademarkører og afbildes i op til 12 timer. Ved hjælp af denne metode kan fagocytose af omgivende celler ved makrofager observeres, makrofagmigrationskinetik kan studeres, og direkte celle-celleinteraktioner mellem makrofager og epitelceller kan demonstreres.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af det britiske indenrigsministerium og udført i henhold til PPL'erne PB5FC9BD2 og PP0330540. Alle eksperimenter er i overensstemmelse med ARRIVE-retningslinjerne og dem fra University of Edinburgh.
Vildtypemus blev kommercielt fremstillet (se materialetabel). Krt14CreER; R26mTmG-mus blev opdrættet i huset ved at krydse Krt14CreER/+ mus31 med R26mTmG/ mTmG-mus 32. I alle forsøg blev der brugt 8-10 uger gamle hunmus.
1. Indsamling og indlejring af SMG
- Aflive musen/musene ved at udsætte dem for en stigende koncentration af kuldioxid (CO2). Derefter sprøjtes snitområdet med 70% ethanol (EtOH) og brug saks og tang til omhyggeligt at dissekere SMG (s) fra det omgivende væv (figur 1A). Fjern fedt og bindevæv ved hjælp af pincet, og læg kirtlen i et opsamlingsrør, der indeholder iskold Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, se materialetabel).
- Kirtlen adskilles i stykker, der måler ca. 1 cm2 hver ved hjælp af pincet.
- 4% agarose opvarmes til 50 °C, og hældes derefter direkte i en 35 mm skål.
- Hæld en lille mængde smeltet 50 °C agarose i en separat skål og skyl kirtlen grundigt ved at flytte den rundt i overskydende agarose.
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at fjerne overskydende væske fra kirtlerne. Et overskud af væsker kan forhindre kirtlerne i at klæbe ordentligt til agarose. - Placer 4-6 stykker af kirtlen i agarose, og sørg for, at de ligger fladt og er i samme plan (figur 1A).
BEMÆRK: Sørg for, at kirtlerne ikke berører agarens overflade eller bunden af pladen. - Placer låget på 35 mm skålen og overfør den til en iskasse, der dækker pladen med is.
- Vent i 5-10 minutter på, at agaroseen størkner.
2. Sektionering
- Brug en skalpel til omhyggeligt at skære rundt om den kirtelindlejrede agaroseblok, og fjern blokken, der indeholder vævet fra skålen. Efterlad ca. en 5 mm kant.
- Fastgør agaroseblokken til vibratomets stadium (se materialetabel) ved at påføre en dråbe superlim, og sørg for, at hele bundfladen af blokken er i kontakt med superlimen.
- Lad superlimen hærde i ca. 5 min. Fyld derefter vibratomkammeret med iskold 1x fosfatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1% Penicillin-Streptomycin (P/S).
- Tilsæt is til både siden og bunden af vibratomkammeret.
BEMÆRK: Oprethold et meget koldt miljø og udskift isen efter behov. - Trim overskydende agarose af og skab 5 mm mellemrum mellem hvert stykke kirtel ved at lave snit med en skalpel. Dette vil give individuelle skiver.
- Juster vibratombladet med agaroseblokkens overflade, og indstil start- og slutpunkterne for sektionerne for at opnå den ønskede skivetykkelse.
- Før du starter skæreprocessen, skal du sikre dig, at bladet ikke er i kontakt med blokken. Denne forholdsregel forhindrer utilsigtet at skære store stykker agarose og miste dele af prøven.
- Skær sektioner med en tykkelse på 150 μm ved lav hastighed og høj vibration (f.eks. en hastighed på 3 og en vibrationsindstilling på 8-10 på en skala fra 1-10 for hver parameter) (figur 1A).
- Når en sektion er skåret og frigivet i den omgivende PBS, samles sektionerne ved hjælp af en pensel og placeres i en skål, der indeholder forvarmede Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medier med P / S.
3. Dyrkning og farvning af SMG-skiver
- Dyrkning
- Tilsæt 1,5 ml RPMI-medier til hvert hul i en 6-brønds plade, der indeholder et 0,4 μm filter. Sørg for, at der ikke er luftbobler fanget under filteret.
- Overfør 1-6 skiver til hvert filter ved hjælp af en pensel, og pas på ikke at bryde skiverne.
BEMÆRK: Sørg for, at udsnittene ikke er nedsænket i medier, men i stedet flyder på filteret. Hvis de er helt nedsænket, kan de kvæle under kultur. - Der inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2, og mediet udskiftes hver 3. dag (figur 1A).
- Bestråle forsøgsplader med en enkelt dosis på 10 Gy gammastråling ved hjælp af en kommercielt tilgængelig bestrålingslampe (se materialetabel). Derefter returneres dem til inkubatoren.
- Farvning til levende billedbehandling
- Brug en pensel til forsigtigt at løfte skiverne fra filteret og læg dem i en plade med 24 brønde indeholdende 500 μL kulturmedier pr. hul, hvor skiverne nedsænkes.
- De relevante konjugerede antistoffer og kernepletter (se materialetabellen) tilsættes mediet i passende koncentrationer27.
- Skiverne inkuberes med antistoffer i 2 timer ved 37 °C under forsigtig omrystning.
- Skiverne vaskes ved at nedsænke dem i kulturmedier og vaskes i 3 runder á 10 min. vask ved 37 °C under forsigtig omrystning.
4. Montering og levende billedbehandling
- Brug tang til at fjerne tapen fra den ene side af en dobbeltsidet billedafstandsstykke og fastgør den med klæbende side nedad til bunden af en plade med 6 brønde med glasbund.
- Pipette 50 μL medier ind i mellemrummet i midten af afstandsstykket.
- Placer skiven i mediet ved hjælp af en pensel, og sørg for, at den ligger fladt uden fangede luftbobler.
- Fjern forsigtigt 20 μL medier fra mellemrummet ved hjælp af en pipette.
- Fjern tapen fra oversiden af afstandsstykket med pincet, og læg et 25 mm cirkulært dæksel ovenpå. Tryk rundt om kanten af afstandsstykket for at sikre, at dækslet sidder godt fast, og pas på ikke at bryde dækslet ved at anvende for meget kraft (figur 1A).
- Afbild skiven på et konfokalmikroskop for den ønskede tidsperiode eller intervaller (f.eks. Hvert 15. minut i 12 timer ved hjælp af et 20x vandmål).
Representative Results
Makrofagernes respons på skade i den submandibulære spytkirtel forbliver ukendt. Dette omfatter, om de lokaliserer og migrerer til specifikke strukturer i kirtlen, samt afstanden og hastigheden, hvormed de migrerer. Dette har været vanskeligt at bestemme gennem statiske billeddannelsesmetoder.
For at løse dette er der udviklet en levende billeddannelsesmetode til at studere makrofag-epitelcelleinteraktion i realtid. Immunofluorescerende farvning af skiver blev kombineret med en endogent mærket afstamningssporingsmusemodel (figur 1A og figur 2A). I denne model blev skiverne udsat for 10 Gy gammabestråling for at fremkalde bestrålingsskade og blev afbildet 2 timer, 3 dage og 4 dage efter bestråling (IR), hvor ikke-bestrålede skiver fungerede som kontrol. Data blev indhentet fra fire kanaler: Hoechst (med laser 425 for at minimere fototoksicitet), GFP (488), dTomato (561) og Alexa 647 (640). En z-stack blev udført, og et billede blev taget hver 2-3 μm, med i alt 30 til 40 fly samlet, hvilket resulterede i en samlet højde på 80-90 μm.
Ved hjælp af denne teknik og analyse af membranbundet tomat (mT) signal og Caspase3/7 aktivitet blev det tydeligt, at organotypiske skiver bevarede deres epitelstruktur, overlevede i kultur og udviste minimal celledød. Dataene viste, at ikke-bestrålede skiver af den submandibulære kirtel fra R26mTmG-mus 32, dyrket i 7 dage, bevarede deres mT-signal og epitelarkitektur (figur 1B). 3 dage efter ex vivo-bestråling var acinar- og duktalcelleatrofi imidlertid tydelig (figur 1B; acinin- og kanalstrukturer fremhævet med henholdsvis stiplede hvide og grønne linjer), i overensstemmelse med in vivo-strålingsskade 13. Apoptose var ubetydelig i de ikke-bestrålede skiver, men der var tegn på Caspase 3/7+ celler i de bestrålede skiver 4 dage efter bestråling (figur 1C; grønne pile), svarende til in vivo skade33,34. Desuden har bestrålede skiver rekapituleret in vivo DNA-beskadigelse 34,35,36,37, som angivet ved forhøjet γH2AX38 sammenlignet med ikke-bestrålede kontroller (figur 1D,E). Således udviste organotypiske spytkirtelskiver god levedygtighed i kultur og reagerede på samme måde som in vivo-væv på bestråling.
Efter dette blev celle-celle-interaktioner i realtid undersøgt. Makrofager, der interagerer direkte med GFP-mærkede epitelstamceller (Krt14CreER-GFP) blev observeret over en periode på 12 timer 3 dage efter IR (figur 2A og video 1). Bemærkelsesværdigt var det tydeligt, at makrofager forblev tæt på epitelstamceller i timevis og ofte holdt kontakten i hele 12 timers billeddannelsesperiode. Desuden blev der observeret fagocytose i realtid af epitelceller ved makrofager, hvilket bekræfter, at makrofager udfører deres traditionelle funktion i skivekulturmodellen (figur 2B, videoer 2 og video 3). Denne teknik identificerede også, at makrofager er relativt stationære under både homeostase og efter bestrålingsskade, sandsynligvis på grund af deres høje densitet i vævet. Dette viser for første gang, at spytkirtelmakrofager ikke migrerer meget under homeostase eller efter bestrålingsskade. Mens makrofager ikke viste signifikant migration, viste det omgivende væv øget dynamik efter bestråling, hvor flere makrofager aktivt interagerede omkring klynger af mærkede epitelceller. Derudover tillod denne teknik, der udelukkende var baseret på nuklear farvning, os at visualisere cellebevægelse i skiven over tid, ofte med hele kanaler, der ser ud til at 'migrere' i vævet (video 4). Over tid under dyrkningsprocessen blev det tydeligt, at skiver skiftede fra en flad til en sfærisk-lignende morfologi, hvilket tyder på, at cellebevægelse inden for skiven sandsynligvis skyldes deres omlejring til en kuglelignende struktur, der ligner en potentiel reorganiseringsbegivenhed.
Endelig kan de levende billeddata, der genereres af dette assay, bruges til kvantitativt at måle celleadfærd, såsom migration. Individuelle celler kan detekteres og segmenteres (figur 3A), og migration kan måles ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt billedbehandlings- og analysesoftware (se materialetabel og video 5). Desuden kan nærmeste objektanalyse udføres for at bestemme, om celler, i dette tilfælde makrofager, migrerer tættere på andre celler af interesse, i dette tilfælde Krt14CreER-GFP + celler, og hvordan denne dynamik ændrer sig over tid (figur 3B).
Figur 1: Rekapitulation af in vivo-respons i præcisionsskårne spytkirtelvævsskiver. (A) Skematisk oversigt over forsøgsprotokollen. (B) Repræsentative billeder af membranbundet tomat fremstillet af frisk submandibulært kirtelvæv (SMG), umanipulerede SMG-skiver dyrket i 7 dage eller SMG-skiver bestrålet med en enkelt dosis på 10 Gy gammabestråling 3 eller 7 dage tidligere. Stiplede hvide linjer angiver eksempler på acinarstrukturer, og stiplede grønne linjer angiver eksempler på kanalstrukturer. Skalabjælke = 50 μm. (C) Repræsentative billeder af Caspase-3/7-ekspression opnået fra umanipulerede SMG-skiver eller SMG-skiver bestrålet med en enkelt dosis på 10 Gy gammabestråling 2 timer eller 4 dage tidligere. Grønne pilespidser angiver positive kerner. Skalabjælke = 50 μm. (D) Repræsentative billeder af γH2AX-ekspression opnået fra umanipulerede SMG-skiver eller SMG-skiver bestrålet med en enkelt dosis på 10 Gy gammabestråling 3 dage tidligere. Skalabjælke = 20 μm. (E) Repræsentativ ekspression af γH2AX i EpCAM+ epitelceller fra umanipulerede SMG-skiver eller SMG-skiver bestrålet med en enkelt dosis 10 Gy gammabestråling 2 timer og 3 dage tidligere. SSA = sidespredningsområde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Live billeddannelse af makrofag-epitelcelleinteraktioner og fagocytose. (A) Sekventielle stillbilleder af interaktioner mellem KRT14+ stamceller og deres afkom (Krt14CreER-GFP+ celler) og makrofager efter bestråling. Live cellebilleddannelse fanger cellulær dynamik over en periode på 90 minutter. Skalabjælke = 20 μm. Tilknyttet video er Video 1. (B) Sekventielle stillbilleder af en makrofagfag, der foretager en epitelcelle. Live cellebilleddannelse viser processen over en periode på 60 minutter. Hvide pile peger på makrofagen, og gule pile angiver kernen i cellen, der gennemgår fagocytose. Skalabjælke = 50 μm. Tilknyttet video er Video 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Live imaging til cellulær dynamikanalyse. (A) Billede, der illustrerer individuel celleidentifikation og segmentering til analyse af cellulære adfærdsparametre, såsom migration (se video 5). Celler er pseudofarvede tilfældigt for individuel celle og sporskelnen. Skalabjælke = 100 μm. (B) Kvantificering af afstanden (i μm) fra det nærmeste objekt til individuelle Krt14CreER-GFP+ celler plottet over 10 tidspunkter (billeder taget hvert 5. minut). Data præsenteret som middelværdien pr. brønd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Live billeddannelse, der afslører dynamiske interaktioner mellem KRT14+ stamceller/afkom og makrofager efter bestråling. Skiverne blev udsat for en enkelt 10 Gy gamma bestrålingsdosis før levende billeddannelse. Krt14CreER-GFP+ celler er repræsenteret i grønt, makrofager (F4/80+) i rødt og kerner i cyan. Videoen består af en enkelt z-stack, der spænder over en 12 timers kulturperiode med billeder taget hvert 15. minut. Klik her for at downloade videoen.
Video 2: Live billeddannelse, der fanger en makrofag, der opsluger en epitelcelle. Makrofager (F4/80+) er afbildet med rødt, og kerner er vist i cyan. Videoen består af en enkelt z-stack og spænder over en 12 timers kulturperiode med billeder taget hvert 15. minut.
Video 3: Maksimal projektion live billeddannelse, der viser en makrofag, der opsluger en epitelcelle. Makrofager (F4/80+) vises med rødt, og kerner vises med cyan. Videoen har en maksimal projektion af z-stack-billeder på i alt 80 μm (et enkelt plan præsenteres i video 2) og spænder over en 12 timers kulturperiode med billeder taget hvert 15. minut.
Video 4: Live billeddannelse, der illustrerer spytkirtelets dynamiske opførsel i kultur efter bestråling. Skiverne blev udsat for en enkelt 10 Gy gamma bestrålingsdosis før levende billeddannelse. Makrofager (F4/80+) er repræsenteret i rødt, kerner i cyan. Videoen består af en enkelt z-stack, der spænder over en 12 timers kulturperiode med billeder taget hvert 15. minut.
Video 5: Sporing af kvantitativ celleoverførsel over tid. Denne video demonstrerer den individuelle sporing af cellespor fra live billedvideoer. Pile angiver cellespor, og celler er pseudofarvede individuelt. Videoen består af en enkelt z-stack og spænder over en 1 times kulturperiode med billeder taget hvert 15. minut.
Discussion
Evnen til at dyrke spytkirtelvæv ex vivo giver en glimrende mulighed for at studere celle-celle-interaktioner i forbindelse med både homeostase og skaderespons. Selvom intravital billeddannelse af musens submandibulære kirtel er mulig 39,40, afhænger denne teknik af at bruge fluorescerende reportermusemodeller til endogent at mærke celler af interesse og skal udføres under terminal anæstesi. Her beskrives en metode til dyrkning af submandibulære kirtelskiver ex vivo, opretholdelse af cellulær arkitektur og celle-celle-interaktioner. Denne tilgang forfiner nuværende live imaging teknikker og giver et alternativ til intravital billeddannelse.
Den langsigtede vedligeholdelse af væv ved hjælp af denne teknik er afhængig af dyrkning af skiver ved en luft-væske-grænseflade. Tidligere explant-modeller 26,41 har sandsynligvis kun opnået vellykket kultur i et par dage, fordi de blev nedsænket i medier og i det væsentlige "kvalt". I modsætning hertil opretholder brugen af et luft-væske-grænsefladekultursystem vævets sundhed og struktur i en længere periode, hvilket sikrer billeddannelse af høj kvalitet. Metoden til montering af SMG-skiver før billeddannelse, med en lille mængde medier og i et rumbegrænset kammer for at holde skiven flad, er integreret i teknikkens succes. Visualisering af celler i dette assay afhænger af endogent mærkede reportermus eller fluorescerende konjugerede antistoffer. Overfloden af transgene fluorescerende reportermusemodeller og konjugerede antistoffer rettet mod specifikke celletyper og undergrupper gør denne metode velegnet til at udforske forskellige cellespecifikke interaktioner.
Mens denne metode giver en god model af væv in situ og ex vivo bestrålingsskade resulterer i acinar og ductal struktur atrofi, svarende til hvad der forekommer i vivo13, kan nogle elementer ikke rekapituleres ex vivo. Disse omfatter manglen på fungerende vaskulatur og neuronal input samt fraværet af infiltrerende inflammatoriske celler. I betragtning af den veldokumenterede rolle, som blodkar og nerver spiller i spytkirtelhomeostase og regenerering26,42 og betydningen af migrerende immunceller43, såsom T- og B-celler, i spytkirtelfunktion, skaderespons, infektion og Sjögrens syndrom (SS) patogenese (som gennemgået i44), kan dette assay gå glip af nogle vigtige cellulære interaktioner. Derudover kan meget hurtige migrationshændelser, såsom Natural Killer (NK) celle45 og dendritisk celle (DC) 46 bevægelse, gå glip af billeddannelse hvert 15. minut. Imidlertid kan billeddannelsesintervaller optimeres til at studere de specifikke celle-celleinteraktioner af interesse, og evnen til at afbilde i 3 dimensioner gennem z-stakke muliggør vurdering af 3D-cellebevægelse. Sikker montering af vævet under billeddannelse er afgørende for kvantificering, såsom cellesporingsmålinger. Selvom denne undersøgelse udnyttede musevæv, giver protokollen desuden en levedygtig metode til at studere celle-celle-interaktioner i humane spytkirtler, hvilket genererer værdifuld translationel information, der ikke kan opnås gennem andre metoder.
Mens rollen som vævsresidente makrofager i homeostase og regenerering er blevet demonstreret i flere væv 2,10,11,12, forbliver deres rolle i spytkirtlerne stort set ubesvaret. Selv om det er kendt, at makrofager er afgørende for epitelregenerering efter bestrålingsskade13, er de præcise mekanismer, der ligger til grund for denne virkning, stadig ukendte. Live billeddannelse af spytkirtelskiver muliggør visualisering og analyse i realtid af kompleks vævsdynamik, som ofte savnes af traditionel konfokal billeddannelse. Derudover er det tydeligt, at makrofager gennemgår dynamiske ændringer i form, mens de udfører forskellige funktioner in vivo 47,48,49, og denne protokol giver sandsynligvis en bedre repræsentation af disse ændringer end en typisk statisk visning i fast væv. Fremtidige undersøgelser kan udnytte denne teknik til at undersøge, hvordan celle-celle kommunikation ændrer sig i løbet af homeostase, skade og regenerering / opløsning. Denne tilgang vil være nyttig til belysning af vigtige signalveje og begivenheder, der i sidste ende kan tilbyde terapeutiske fordele.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
SE finansieres af Wellcome Trust-tilskud 108906/Z/15/Z; EE finansieres af UKRI/MRC-bevilling MR/S005544/1 og af et kanslerstipendium fra University of Edinburgh. Figur 1A oprettes med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc) | Avantor/VWR | 734-2240 | Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 35 mm dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Coverslips | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111650 | Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter |
| Double-sided sticker | Grace Bio-Labs | 654004 | SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD |
| EtOH | Scientific Laboratories Supplies | CHE1924 | Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7% |
| F4/80 antibody | Invitrogen | 17-4801-82 | F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience |
| Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Student Fine Forceps Straight Broad Shanks |
| Glass bottom 6 well plate | Cellvis | P06-1.5H-N | 6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025050 | +calcium +magnesium, no phenol red |
| Hoechst | Sigma Aldrich | 14533 | Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Ice box | Fisher Scientific | 11339623 | Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid |
| Imaging and analysis software | Harmony | ||
| Low Melting Agarose | Merck | A9414-25G | |
| Paintbrush | Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 20012027 | |
| RPMI | ThermoFisher | 12634010 | Gibco Advanced DMEM/F-12 |
| Scalpel | Swann-Morton | Disposable scalpels, No. 11 blade | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Extra Narrow Scissors 10.5 cm |
| Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator | JL Shepherd & Associates | ||
| Superglue | Bostik | Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1000 S | |
| Vibratome blades | Astra | Superior Platinum Double Edge blade | |
| Wild-type (C57BL/BJ) mice | Charles River |
References
- Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
- Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
- Lucas, T., et al. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. J Immunol. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Duffield, J. S., et al. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J Clin Invest. 115 (1), 56-65 (2005).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Mass, E., Nimmerjahn, F., Kierdorf, K., Schlitzer, A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 23 (9), 563-579 (2023).
- Dick, S. A., et al. Three tissue resident macrophage subsets coexist across organs with conserved origins and life cycles. Sci Immunol. 7 (67), (2022).
- Hassel, C., Gausserès, B., Guzylack-Piriou, L., Foucras, G. Ductal macrophages predominate in the immune landscape of the lactating mammary gland. Front Immunol. 12, 754661 (2021).
- Kolter, J., et al. A subset of skin macrophages contributes to the surveillance and regeneration of local nerves. Immunity. 50 (6), 1482-1497 (2019).
- Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nat Cell Biol. 22 (5), 546-558 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- McKendrick, J. G., et al. CSF1R-dependent macrophages in the salivary gland are essential for epithelial regeneration after radiation-induced injury. Sci Immunol. 8 (89), doi:10.1126/sciimmunol.add4374 eadd4374 (2023).
- Muntjewerff, E. M., Meesters, L. D., vanden Bogaart, G.
- Bissonnette, E. Y., Lauzon-Joset, J. F., Debley, J. S., Ziegler, S. F. Cross-talk between alveolar macrophages and lung epithelial cells is essential to maintain lung homeostasis. Front Immunol. 11, 583042 (2020).
- Xue, Q., et al. Analysis of single-cell cytokine secretion reveals a role for paracrine signaling in coordinating macrophage responses to TLR4 stimulation. Sci Signal. 8 (381), (2015).
- McArdle, S., Mikulski, Z., Ley, K. Live cell imaging to understand monocyte, macrophage, and dendritic cell function in atherosclerosis. J Exp Med. 213 (7), 1117-1131 (2016).
- Gurevich, D. B., et al. Live imaging of wound angiogenesis reveals macrophage orchestrated vessel sprouting and regression. Embo j. 37 (13), (2018).
- Meziani, L., et al. CSF1R inhibition prevents radiation pulmonary fibrosis by depletion of interstitial macrophages. Eur Respir J. 51 (3), (2018).
- Bickelhaupt, S., et al. Effects of CTGF blockade on attenuation and reversal of radiation-induced pulmonary fibrosis. J Natl Cancer Inst. 109 (8), (2017).
- Formenti, S. C., Demaria, S.
- Chambers, M. S., Garden, A. S., Kies, M. S., Martin, J. W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: pathogenesis, impact on quality of life, and management. Head Neck. 26 (9), 796-807 (2004).
- Radfar, L., Sirois, D. A. Structural and functional injury in minipig salivary glands following fractionated exposure to 70 Gy of ionizing radiation: an animal model for human radiation-induced salivary gland injury. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 96 (3), 267-274 (2003).
- Grehn, A. L., Gustafsson, H., Franzén, L., Thornell, L. E., Henriksson, R. Ultrastructural morphometry of parotid acinar cells following fractionated irradiation. Oral Oncol. 33 (1), 23-28 (1997).
- Rocchi, C., Emmerson, E. Mouth-watering results: clinical need, current approaches, and future directions for salivary gland regeneration. Trends Mol Med. 26 (7), 649-669 (2020).
- Emmerson, E., et al. Salivary glands regenerate after radiation injury through SOX2-mediated secretory cell replacement. EMBO Mol Med. 10 (3), 8051 (2018).
- May, A. J., et al. Diverse progenitor cells preserve salivary gland ductal architecture after radiation-induced damage. Development. 145 (21), (2018).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nat Commun. 4, 1494 (2013).
- Mizrachi, A., et al. Radiation-induced microvascular injury as a mechanism of salivary gland hypofunction and potential target for radioprotectors. Radiat Res. 186 (2), 189-195 (2016).
- Friedrich, R. E., Bartel-Friedrich, S., Holzhausen, H. J., Lautenschläger, C. The effect of external fractionated irradiation on the distribution pattern of extracellular matrix proteins in submandibular salivary glands of the rat. J Craniomaxillofac Surg. 30 (4), 246-254 (2002).
- Vasioukhin, V., Degenstein, L., Wise, B., Fuchs, E. The magical touch: genome targeting in epidermal stem cells induced by tamoxifen application to mouse skin. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8551-8556 (1999).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Gilman, K. E., et al. P2X7 receptor deletion suppresses γ-radiation-induced hyposalivation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 316 (5), R687-R696 (2019).
- Ren, J., et al. Radioprotective effects and mechanism of HL-003 on radiation-induced salivary gland damage in mice. Sci Rep. 12 (1), 8419 (2022).
- Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL6 modulation. Cancer Res. 76 (5), 1170-1180 (2016).
- Chang, S., et al. Inorganic nitrate alleviates total body irradiation-induced systemic damage by decreasing reactive oxygen species levels. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 103 (4), 945-957 (2019).
- Varghese, J. J., et al. Localized delivery of amifostine enhances salivary gland radioprotection. J Dent Res. 97 (11), 1252-1259 (2018).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. gammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).
- Takano, T., et al. Highly localized intracellular Ca(2+) signals promote optimal salivary gland fluid secretion. Elife. 10, (2021).
- Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy. J Vis Exp. 135, (2018).
- O'Dell, N. L., Sharawy, M. H., Schuster, G. S. Effects of in vivo single and multiple isoproterenol injections on subsequently explanted submandibular glands. Acta Anat (Basel. 105 (4), 431-438 (1979).
- Lombaert, I. M., et al. Cytokine treatment improves parenchymal and vascular damage of salivary glands after irradiation). Clin Cancer Res. 14 (23), 7741-7750 (2008).
- Stolp, B., et al. Salivary gland macrophages and tissue-resident CD8(+) T cells cooperate for homeostatic organ surveillance. Sci Immunol. 5 (46), 4371 (2020).
- Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary Sjögren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
- Vanherberghen, B., et al. Microwell-based live cell imaging of NK cell dynamics to assess heterogeneity in motility and cytotoxic response. Methods Mol Biol. 1441, 87-106 (2016).
- de Winde, C. M., Munday, C., Acton, S. E. Molecular mechanisms of dendritic cell migration in immunity and cancer. Med Microbiol Immunol. 209 (4), 515-529 (2020).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Paterson, N., Lämmermann, T. Macrophage network dynamics depend on haptokinesis for optimal local surveillance. Elife. 11, (2022).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
