Summary
Immunofluorescerende beeldvorming wordt beperkt door het vermogen om complexe, tijdsafhankelijke biologische processen in slechts één momentopname in de tijd waar te nemen. Deze studie schetst een live-imaging-benadering die wordt uitgevoerd op nauwkeurig gesneden plakjes submandibulaire klier van muizen. Deze aanpak maakt de real-time observatie mogelijk van cel-cel interacties tijdens homeostase en de processen van regeneratie en herstel.
Abstract
Speekselklierregeneratie is een complex proces met ingewikkelde interacties tussen verschillende celtypen. Recente studies hebben licht geworpen op de cruciale rol die macrofagen spelen bij het aansturen van de regeneratieve respons. Ons begrip van deze cruciale rol is echter voornamelijk gebaseerd op statische weergaven die zijn verkregen uit vaste weefselbiopten. Om deze beperking te overwinnen en inzicht te krijgen in deze interacties in realtime, schetst deze studie een uitgebreid protocol voor het ex vivo kweken van speekselklierweefsel en het vastleggen van live beelden van celmigratie.
Het protocol omvat verschillende belangrijke stappen: eerst wordt het submandibulaire speekselklierweefsel van de muis zorgvuldig gesneden met behulp van een vibratoom en vervolgens gekweekt op een lucht-vloeistofinterface. Deze plakjes kunnen opzettelijk worden verwond, bijvoorbeeld door blootstelling aan straling, om cellulaire schade te veroorzaken en de regeneratieve reactie op gang te brengen. Om specifieke cellen van belang te volgen, kunnen ze endogeen worden gelabeld, bijvoorbeeld door gebruik te maken van speekselklierweefsel dat is verzameld van genetisch gemodificeerde muizen waarbij een bepaald eiwit is gemarkeerd met groen fluorescerend eiwit (GFP). Als alternatief kunnen fluorescerend geconjugeerde antilichamen worden gebruikt om cellen te kleuren die specifieke markers op het celoppervlak tot expressie brengen. Eenmaal geprepareerd, worden de plakjes speekselklier gedurende 12 uur onderworpen aan live beeldvorming met behulp van een confocaal beeldvormingssysteem met een hoog gehalte, waarbij beelden met tussenpozen van 15 minuten worden vastgelegd. De resulterende beelden worden vervolgens gecompileerd om een film te maken, die vervolgens kan worden geanalyseerd om waardevolle parameters voor celgedrag te extraheren. Deze innovatieve methode biedt onderzoekers een krachtig hulpmiddel om macrofaaginteracties in de speekselklier na letsel te onderzoeken en beter te begrijpen, waardoor onze kennis van de regeneratieve processen die in deze dynamische biologische context spelen, wordt vergroot.
Introduction
Van macrofagen is aangetoond dat ze een steeds belangrijkere rol spelen in de processen van regeneratie en herstel, die verder gaan dan hun klassieke immuunfunctie 1,2. Macrofagen zijn inderdaad betrokken bij een overvloed aan processen die verband houden met regeneratie en vertonen kritische regulerende activiteit in alle stadia van herstel, evenals littekenvorming en fibrose 3,4. Weefsel-residente macrofagen zijn zeer heterogene celtypen met complexe mechanismen die verschillende cellulaire fenotypes aansturen, en ze spelen een essentiële rol in de ontwikkeling, functie en homeostase van organen (zoals besproken in5). Macrofagen die in het weefsel leven, ontstaan in eerste instantie uit voorlopers in de dooierzak en de foetale lever, en worden vervolgens vervangen door proliferatie of door van beenmerg afgeleide bloedmonocyten met verschillende snelheden, afhankelijk van de levensduur van bestaande macrofagen en het weefsel of de niche waarin ze zich bevinden 6,7.
Belangrijk is dat in weefsel aanwezige macrofagen verspreid zijn over alle weefsels en bijdragen aan diverse orgaanfuncties. Ze zijn uniek geprogrammeerd door hun micro-omgeving om niche-specifieke functies uit te voeren. Om deze reden biedt de lokalisatie van macrofagen in het weefsel inzicht in hun functie, met unieke populaties waargenomen in de longen, borstklieren, darmen, huid en spieren 8,9,10. Tijdens de ontwikkeling van de borstklier zijn ductale macrofagen nauw verbonden met de ductale boom, en hun uitputting resulteert in aanzienlijk verminderde vertakkingen11. Verder zijn macrofagen nodig voor morfogenese tijdens de puberteit en alveologenese tijdens de zwangerschap, waarbij ze actief het epitheel monitoren. Bij spierletsel "woont" een specifieke populatie macrofagen op de plaats van de verwonding, waardoor een voorbijgaande niche ontstaat waarin ze proliferatie-geïnduceerde signalen leveren die nodig zijn voor stamcelproliferatie. Ze vertonen dus de gespecialiseerde rol van verschillende macrofaagpopulaties bij het beheersen van het herstelproces2. In de longen doet zich een soortgelijk fenomeen voor waarbij interstitiële macrofagen interleukine (IL)-R1-expressieve alveolaire type II (AT2)-cellen primen voor omzetting in schade-geassocieerde voorbijgaande voorlopercellen door de afgifte vanIL-1B 12. Bovendien heeft recent onderzoek aangetoond dat macrofagen essentieel zijn voor de regeneratie van de submandibulaire speekselklier (SMG) van muizen na bestralingsletsel, en bij afwezigheid daarvan wordt de epitheliale regeneratie verstoord13. Alles bij elkaar benadrukken deze gegevens het belang van activering en functie van macrofagen in voorbijgaande inflammatoire niches na weefselbeschadiging, evenals tijdens homeostase.
Macrofagen zijn actieve cellen en hun functies omvatten interacties met een verscheidenheid aan verschillende celtypen, waaronder direct cel-celcontact14,15, evenals meer indirecte methoden zoals de afscheiding van oplosbare factoren 2,16, die essentieel zijn voor nicheregulatie. Hoewel klassieke immunofluorescerende beeldvorming nuttig is om te beginnen met het ontrafelen van deze interacties, wordt het beperkt door slechts een enkele momentopname in de tijd weer te geven, waardoor talrijke tijdstippen worden weggelaten die cruciaal zijn voor een zeer dynamisch regeneratief proces17,18. Naarmate het belang van timing en het ontstaan van verschillende regeneratiegolven scherper in beeld komen, is het essentieel om deze processen in meer detail te ontleden.
Radiotherapie is een levensreddende behandeling voor veel mensen bij wie kanker is vastgesteld. Hoewel radiotherapie vaak effectief is bij het verkleinen of elimineren van de tumor(en), kan het ook gezonde weefsels beschadigen die in het stralingsveld liggen en een immuunrespons opwekken. Stralingsletsel kan leiden tot snelle rekrutering van macrofagen en directe en indirecte immunomodulerende reacties19,20. De speekselklieren worden vaak onbedoeld bestraald tijdens de behandeling van hoofd-halskanker21,22, wat leidt tot epitheelschade, celatrofie en fibrose23,24, resulterend in xerostomie of chronische droge mond25.
De speekselklier bestaat uit een overvloed aan celtypen en -structuren, inclusief maar niet beperkt tot epitheelcellen (zowel speekselproducerende acinaire cellen als speekseltransporterende ductale cellen), myoepitheelcellen, epitheliale voorlopercellen, zenuwen, bloedvaten, immuuncellen, fibroblasten en extracellulaire matrix (ECM). De rol en respons van veel van deze celtypen in de regeneratieve respons zijn eerder beschreven 26,27,28,29,30. Hoe deze verschillende cellen op elkaar inwerken tijdens homeostase en regeneratie, en in het bijzonder hoe immuuncellen zoals macrofagen zich gedragen, is echter minder goed bestudeerd. Dit manuscript beschrijft een nieuw ontwikkelde methode om de levende interacties tussen SMG-macrofagen en andere cellen van belang in ex vivo weefsel te bestuderen. De SMG wordt op een vibratoom gesneden, gekleurd voor oppervlaktemarkeringen en maximaal 12 uur in beeld gebracht. Met behulp van deze methode kan fagocytose van omringende cellen door macrofagen worden waargenomen, kan de kinetiek van macrofaagmigratie worden bestudeerd en kunnen directe cel-celinteracties tussen macrofagen en epitheelcellen worden aangetoond.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en uitgevoerd in het kader van PPL's PB5FC9BD2 en PP0330540. Alle experimenten zijn in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen en die van de Universiteit van Edinburgh.
Wildtype muizen werden commercieel verkregen (zie Tabel met materialen). Krt14CreER; R26mTmG-muizen werden in eigen huis gekweekt door Krt14CreER/+ muizen31 te kruisen met R26mTmG/mTmG-muizen 32. In alle experimenten werden vrouwelijke muizen van 8-10 weken oud gebruikt.
1. Verzamelen en inbedden van de SMG
- Euthanaseer de muis(en) door ze bloot te stellen aan een stijgende concentratie kooldioxide (CO2). Spuit daarna het incisiegebied in met 70% ethanol (EtOH) en gebruik een schaar en pincet om de SMG('s) voorzichtig uit het omringende weefsel te ontleden (Figuur 1A). Verwijder vet en bindweefsel met een pincet en plaats de klier in een opvangbuis met ijskoude Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, zie Materiaaltabel).
- Scheid de klier met een pincet in stukken van elk ongeveer 1cm2 .
- Verwarm 4% agarose tot 50 °C en giet het vervolgens direct in een schaal van 35 mm.
- Giet een kleine hoeveelheid gesmolten 50 °C agarose in een aparte schaal en spoel de wartel grondig af door deze in de overtollige agarose te bewegen.
NOTITIE: Deze stap is nodig om overtollige vloeistof uit de klieren te verwijderen. Een teveel aan vloeistoffen kan ervoor zorgen dat de klieren niet goed aan de agarose hechten. - Plaats 4-6 stukken van de klier in de agarose en zorg ervoor dat ze plat liggen en zich in hetzelfde vlak bevinden (Figuur 1A).
NOTITIE: Zorg ervoor dat de klieren het oppervlak van de agar of de bodem van de plaat niet raken. - Plaats het deksel op de schaal van 35 mm en breng deze over naar een koelbox, waarbij u de plaat met ijs bedekt.
- Wacht 5-10 minuten totdat de agarose is gestold.
2. Secties
- Gebruik een scalpel om voorzichtig rond het in klier ingebedde agaroseblok te snijden en verwijder het blok met het weefsel uit de schaal. Laat ongeveer een rand van 5 mm over.
- Bevestig het agaroseblok aan de tafel van het vibratoom (zie Materiaaltabel) door een druppel secondelijm aan te brengen en zorg ervoor dat de gehele onderkant van het blok in contact komt met de secondelijm.
- Laat de secondelijm ongeveer 5 minuten uitharden. Vul vervolgens de vibratoomkamer met ijskoude 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% penicilline-streptomycine (P/S).
- Voeg ijs toe aan zowel de zijkant als de bodem van de vibratomekamer.
NOTITIE: Zorg voor een zeer koude omgeving en vervang het ijs indien nodig. - Snijd overtollige agarose af en maak openingen van 5 mm tussen elk stuk klier door incisies te maken met een scalpel. Dit levert individuele plakjes op.
- Lijn het vibratoommes uit met het oppervlak van het agaroseblok en stel het begin- en eindpunt van de secties in om de gewenste plakdikte te bereiken.
- Voordat u met het snijproces begint, moet u ervoor zorgen dat het mes niet in contact komt met het blok. Deze voorzorgsmaatregel voorkomt dat per ongeluk grote stukken agarose worden afgesneden en delen van het monster verloren gaan.
- Snijd secties met een dikte van 150 μm bij een lage snelheid en hoge trillingen (bijv. een snelheid van 3 en een trillingsinstelling van 8-10 op een schaal van 1-10 voor elke parameter) (Figuur 1A).
- Zodra een sectie is gesneden en vrijgegeven in de omringende PBS, verzamelt u de secties met een penseel en plaatst u ze in een schaal met voorverwarmde Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-media met P/S.
3. Kweken en kleuren van SMG-plakken
- Cultiveren
- Voeg 1,5 ml RPMI-media toe aan elk putje van een plaat met 6 putjes die een filter van 0,4 μm bevat. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het filter zitten.
- Breng 1-6 plakjes over op elk filter met een penseel en zorg ervoor dat de plakjes niet breken.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de plakjes niet ondergedompeld zijn in media, maar in plaats daarvan op het filter drijven. Als ze volledig ondergedompeld zijn, kunnen ze tijdens de kweek stikken. - Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 en vervang de media om de 3 dagen (figuur 1A).
- Bestraal experimentele platen met een enkele dosis van 10 Gy gammastraling met behulp van een in de handel verkrijgbare bestralingsinstallatie (zie tabel met materialen). Breng ze daarna terug naar de couveuse.
- Kleuring voor live beeldvorming
- Til de plakjes voorzichtig met een penseel uit het filter en plaats ze in een plaat met 24 putjes met 500 μL kweekmedia per putje, waar de plakjes worden ondergedompeld.
- Voeg de relevante geconjugeerde antilichamen en nucleaire kleuring (zie materiaaltabel) toe aan de media in de juiste concentraties27.
- Incubeer de plakken met antilichamen gedurende 2 uur bij 37 °C met zachte beweging.
- Was de plakjes door ze onder te dompelen in kweekmedia en gedurende 3 rondes van 10 min wassen op 37 °C met zacht schudden.
4. Montage en live imaging
- Verwijder met een pincet de tape van één kant van een dubbelzijdige afstandhouder en plak deze met de zelfklevende kant naar beneden op de bodem van een plaat met 6 putjes met glazen bodem.
- Pipetteer 50 μL media in de opening in het midden van de afstandhouder.
- Plaats de plak met een penseel in het medium en zorg ervoor dat deze plat ligt zonder ingesloten luchtbellen.
- Verwijder met een pipet voorzichtig 20 μl media uit de opening.
- Verwijder de tape met een pincet van de bovenkant van de afstandhouder en plaats er een cirkelvormig dekglaasje van 25 mm op. Druk rond de rand van het afstandsstuk om ervoor te zorgen dat het dekglaasje stevig vastzit, en pas op dat u het dekglaasje niet breekt door te veel kracht uit te oefenen (Figuur 1A).
- Beeld de plak af op een confocale microscoop gedurende de gewenste tijdsperiode of intervallen (bijv. elke 15 minuten gedurende 12 uur met een 20x waterobjectief).
Representative Results
De reactie van macrofagen op letsel in de submandibulaire speekselklier blijft onbekend. Dit omvat of ze lokaliseren en migreren naar specifieke structuren in de klier, evenals de afstand en snelheid waarmee ze migreren. Dit was moeilijk te bepalen door middel van statische beeldvormingsbenaderingen.
Om dit aan te pakken, is een live beeldvormingsbenadering ontwikkeld om de interactie tussen macrofagen en epitheelcellen in realtime te bestuderen. Immunofluorescerende kleuring van plakjes werd gecombineerd met een endogeen gelabeld afstammingstraceringsmuismodel (Figuur 1A en Figuur 2A). In dit model werden plakjes blootgesteld aan 10 Gy gammastraling om bestralingsletsel te induceren en werden ze 2 uur, 3 dagen en 4 dagen na bestraling (IR) in beeld gebracht, waarbij niet-bestraalde plakjes als controles dienden. Gegevens werden verkregen van vier kanalen: Hoechst (met laser 425 om fototoxiciteit te minimaliseren), GFP (488), dTomato (561) en Alexa 647 (640). Er werd een z-stack uitgevoerd en elke 2-3 μm werd een beeld vastgelegd, waarbij in totaal 30 tot 40 vlakken werden verzameld, wat resulteerde in een totale hoogte van 80-90 μm.
Met behulp van deze techniek en het analyseren van het membraangebonden tomatensignaal (mT) en de activiteit van Caspase3/7, werd het duidelijk dat organotypische plakjes hun epitheliale structuur behielden, overleefden in kweek en minimale celdood vertoonden. De gegevens toonden aan dat niet-bestraalde plakjes van de submandibulaire klier van R26mTmG-muizen 32, gekweekt gedurende 7 dagen, hun mT-signaal en epitheliale architectuur behielden (Figuur 1B). Echter, 3 dagen na ex vivo bestraling was atrofie van acinaire en ductale cellen duidelijk (figuur 1B; acini en ductale structuren gemarkeerd door respectievelijk gestippelde witte en groene lijnen), consistent met in vivo stralingsletsel13. Apoptose was verwaarloosbaar in de niet-bestraalde plakjes, maar er waren aanwijzingen voor Caspase 3/7+ cellen in de doorstraalde plakjes 4 dagen na doorstraling (Figuur 1C; groene pijlen), vergelijkbaar met in vivo letsel33,34. Bovendien recapituleerden doorstraalde plakjes in vivo DNA-schade 34,35,36,37, zoals aangegeven door een verhoogde γH2AX38 in vergelijking met niet-bestraalde controles (Figuur 1D,E). Organotypische plakjes speekselklier vertoonden dus een goede levensvatbaarheid in kweek en reageerden op dezelfde manier als in vivo weefsel op doorstraling.
Hierna werden real-time cel-cel interacties onderzocht. Macrofagen die rechtstreeks interageerden met GFP-gelabelde epitheliale voorlopercellen (Krt14,CreER-GFP) werden waargenomen gedurende een periode van 12 uur 3 dagen na IR (Figuur 2A en Video 1). Opmerkelijk was dat het duidelijk was dat macrofagen urenlang in de buurt van epitheliale voorlopercellen bleven en vaak gedurende de gehele beeldvormingsperiode van 12 uur in contact bleven. Verder werd real-time fagocytose van epitheelcellen door macrofagen waargenomen, wat bevestigt dat macrofagen hun traditionele functie vervullen in het slice culture-model (Figuur 2B, video's 2 en video 3). Deze techniek identificeerde ook dat macrofagen relatief stationair zijn tijdens zowel homeostase als na bestralingsschade, waarschijnlijk vanwege hun hoge dichtheid in het weefsel. Dit toont voor het eerst aan dat speekselkliermacrofagen niet uitgebreid migreren tijdens homeostase of na bestralingsschade. Hoewel macrofagen geen significante migratie vertoonden, vertoonde het omringende weefsel een verhoogde dynamiek na bestraling, waarbij meerdere macrofagen actief interageerden rond clusters van gelabelde epitheelcellen. Bovendien stelde deze techniek, uitsluitend gebaseerd op nucleaire kleuring, ons in staat om de celbeweging in de plak in de loop van de tijd te visualiseren, waarbij vaak hele kanalen in het weefsel lijken te 'migreren' (video 4). In de loop van de tijd tijdens het kweekproces werd het duidelijk dat plakjes verschoven van een platte naar een sferoïde-achtige morfologie, wat suggereert dat celbeweging binnen het plakje waarschijnlijk te wijten is aan hun herschikking in een bolachtige structuur, die lijkt op een mogelijke reorganisatiegebeurtenis.
Ten slotte kunnen de live beeldvormingsgegevens die door deze test worden gegenereerd, worden gebruikt om het gedrag van cellen, zoals migratie, kwantitatief te meten. Individuele cellen kunnen worden gedetecteerd en gesegmenteerd (Figuur 3A), en migratie kan worden gemeten met behulp van in de handel verkrijgbare beeldvormings- en analysesoftware (zie Tabel met materialen en video 5). Bovendien kan een analyse van het dichtstbijzijnde object worden uitgevoerd om te bepalen of cellen, in dit geval macrofagen, dichter bij andere cellen van belang migreren, in dit geval Krt14CreER-GFP+-cellen, en hoe deze dynamiek in de loop van de tijd verandert (Figuur 3B).
Figuur 1: Recapitulatie van in vivo respons in nauwkeurig gesneden plakjes speekselklierweefsel. (A) Schema van het experimentele protocol. (B) Representatieve beelden van membraangebonden tomaat verkregen uit vers submandibulaire klierweefsel (SMG), niet-gemanipuleerde SMG-plakjes die gedurende 7 dagen zijn gekweekt, of SMG-plakjes die 3 of 7 dagen eerder zijn doorstraald met een enkele dosis van 10 Gy gammastraling. Witte stippellijnen geven voorbeelden van acinaire structuren aan en groene stippellijnen geven voorbeelden van ductale structuren aan. Schaalbalk = 50 μm. (C) Representatieve beelden van Caspase-3/7-expressie verkregen uit niet-gemanipuleerde SMG-plakken of SMG-plakken die 2 uur of 4 dagen eerder zijn doorstraald met een enkele dosis van 10 Gy gammastraling. Groene pijlpunten geven positieve kernen aan. Schaalbalk = 50 μm. (D) Representatieve beelden van γH2AX-expressie verkregen uit niet-gemanipuleerde SMG-plakken of SMG-plakken die 3 dagen eerder zijn bestraald met een enkele dosis van 10 Gy gammastraling. Schaalbalk = 20 μm. (E) Representatieve expressie van γH2AX in EpCAM+- epitheelcellen van niet-gemanipuleerde SMG-plakjes of SMG-plakjes die 2 uur en 3 dagen eerder zijn bestraald met een enkele dosis van 10 Gy gamma-bestraling. SSA = verstrooiingsgebied aan de zijkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Live beeldvorming van macrofaag-epitheelcelinteracties en fagocytose. (A) Sequentiële stilstaande beelden van interacties tussen KRT14+-voorlopercellen en hun nakomelingen (Krt14CreER-GFP+-cellen) en macrofagen na bestraling. Live cell imaging legt de cellulaire dynamiek vast over een periode van 90 minuten. Schaalbalk = 20 μm. Bijbehorende video is Video 1. (B) Sequentiële stilstaande beelden van een macrofaag die een epitheelcel fagocyteert. Live cell imaging toont het proces gedurende een periode van 60 minuten. Witte pijlen wijzen naar de macrofaag en gele pijlen geven de kern aan van de cel die fagocytose ondergaat. Schaalbalk = 50 μm. Bijbehorende video is Video 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Live beeldvorming voor analyse van cellulaire dynamica. (A) Afbeelding ter illustratie van individuele celidentificatie en segmentatie voor het analyseren van cellulaire gedragsparameters, zoals migratie (zie video 5). Cellen worden willekeurig pseudogekleurd voor het onderscheid tussen individuele cellen en sporen. Schaalbalk = 100 μm. (B) Kwantificering van de afstand (in μm) van het dichtstbijzijnde object tot individuele Krt14CreER-GFP+-cellen, uitgezet over 10 tijdstippen (beelden die elke 5 minuten worden vastgelegd). Gegevens gepresenteerd als de gemiddelde waarde per put. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Live beeldvorming die dynamische interacties tussen KRT14+ voorlopercellen/nakomelingen en macrofagen na bestraling aantoont. Plakjes werden blootgesteld aan een enkele gammastralingsdosis van 10 Gy vóór live-beeldvorming. Krt14CreER-GFP+-cellen worden weergegeven in groen, macrofagen (F4/80+) in rood en kernen in cyaan. De video bestaat uit een enkele z-stack, die een kweekperiode van 12 uur beslaat met beelden die elke 15 minuten worden vastgelegd. Klik hier om de video te downloaden.
Video 2: Live beeldvorming van een macrofaag die een epitheelcel overspoelt. Macrofagen (F4/80+) worden in rood afgebeeld en kernen worden in cyaan weergegeven. De video bestaat uit een enkele z-stack en beslaat een kweekperiode van 12 uur met beelden die elke 15 minuten worden gemaakt. Klik hier om de video te downloaden.
Video 3: Maximale projectie live beeldvorming van een macrofaag die een epitheelcel overspoelt. Macrofagen (F4/80+) worden in rood weergegeven en kernen worden weergegeven in cyaan. De video bevat een maximale projectie van z-stack-beelden van in totaal 80 μm (een enkel vlak wordt gepresenteerd in video 2) en beslaat een kweekperiode van 12 uur met beelden die elke 15 minuten worden gemaakt.
Video 4: Live beeldvorming ter illustratie van het dynamische gedrag van speekselklierepitheel in kweek na bestraling. Plakjes werden onderworpen aan een enkele gammastralingsdosis van 10 Gy vóór live beeldvorming. Macrofagen (F4/80+) zijn weergegeven in rood, kernen in cyaan. De video bestaat uit een enkele z-stack, die een kweekperiode van 12 uur beslaat met beelden die elke 15 minuten worden vastgelegd. Klik hier om de video te downloaden.
Video 5: Kwantitatieve celmigratie volgen in de loop van de tijd. Deze video demonstreert het individueel traceren van celsporen op basis van live beeldvormingsvideo's. Pijlen geven celsporen aan en cellen zijn afzonderlijk pseudo-gekleurd. De video bestaat uit een enkele z-stack en beslaat een kweekperiode van 1 uur met beelden die elke 15 minuten worden gemaakt. Klik hier om de video te downloaden.
Discussion
De mogelijkheid om speekselklierweefsel ex vivo te kweken, biedt een uitstekende gelegenheid om cel-celinteracties te bestuderen in de context van zowel homeostase als letselrespons. Hoewel intravitale beeldvorming van de submandibulaire klier van de muis haalbaar is39,40, is deze techniek afhankelijk van het gebruik van fluorescerende reportermuismodellen om cellen van belang endogeen te labelen en moet deze worden uitgevoerd onder terminale anesthesie. Hier wordt een methode beschreven om plakjes submandibulaire klier ex vivo te kweken, met behoud van cellulaire architectuur en cel-cel interacties. Deze aanpak verfijnt de huidige live beeldvormingstechnieken en biedt een alternatief voor intravitale beeldvorming.
Het onderhoud van weefsel op lange termijn met behulp van deze techniek is afhankelijk van het kweken van plakjes op een lucht-vloeistofgrensvlak. Eerdere explantatiemodellen 26,41 hebben waarschijnlijk slechts een paar dagen een succesvolle cultuur bereikt omdat ze werden ondergedompeld in media en in wezen 'stikten'. Het gebruik van een lucht-vloeistof interface-kweeksysteem daarentegen handhaaft de gezondheid en structuur van het weefsel gedurende een langere periode, waardoor beeldvorming van hoge kwaliteit wordt gegarandeerd. De methode om SMG-plakjes vóór de beeldvorming te monteren, met een kleine hoeveelheid media en in een kamer met beperkte ruimte om de plak plat te houden, is een integraal onderdeel van het succes van de techniek. Visualisatie van cellen in deze test hangt af van endogeen gelabelde reportermuizen of fluorescerend geconjugeerde antilichamen. De overvloed aan transgene fluorescerende reportermuismodellen en geconjugeerde antilichamen gericht op specifieke celtypen en subsets maakt deze methode geschikt voor het onderzoeken van verschillende celspecifieke interacties.
Hoewel deze methode een goed model biedt van weefsel in situ en ex vivo bestralingsletsel resulteert in atrofie van de acinaire en ductale structuur, vergelijkbaar met wat er gebeurt in vivo13, kunnen sommige elementen niet ex vivo worden gerecapituleerd. Deze omvatten het gebrek aan functionerende vasculatuur en neuronale input, evenals de afwezigheid van infiltrerende ontstekingscellen. Gezien de goed gedocumenteerde rol van bloedvaten en zenuwen bij de homeostase en regeneratie van de speekselklier26,42 en het belang van migrerende immuuncellen43, zoals T- en B-cellen, in de speekselklierfunctie, letselrespons, infectie en de pathogenese van het syndroom van Sjögren (SS) (zoals besproken in44), kan deze test enkele belangrijke cellulaire interacties missen. Bovendien kunnen zeer snelle migratiegebeurtenissen, zoals Natural Killer (NK)-cel45 en Dendritische Cel (DC)46-beweging, worden gemist door elke 15 minuten beeldvorming te maken. Beeldvormingsintervallen kunnen echter worden geoptimaliseerd om de specifieke cel-celinteracties van belang te bestuderen, en de mogelijkheid om in 3 dimensies af te beelden via z-stacks maakt de beoordeling van 3D-celbeweging mogelijk. Het veilig monteren van het weefsel tijdens beeldvorming is cruciaal voor kwantificering, zoals celvolgmetingen. Bovendien, hoewel deze studie muizenweefsel gebruikte, biedt het protocol een levensvatbare methode voor het bestuderen van cel-celinteracties in menselijke speekselklieren, waardoor waardevolle translationele informatie wordt gegenereerd die met andere methoden onbereikbaar is.
Hoewel de rol van in het weefsel aanwezige macrofagen bij homeostase en regeneratie in verschillende weefsels is aangetoond 2,10,11,12, blijft hun rol in de speekselklieren grotendeels onbeantwoord. Hoewel bekend is dat macrofagen essentieel zijn voor de regeneratie van het epitheel na bestralingsletsel13, blijven de precieze mechanismen die aan dit effect ten grondslag liggen onbekend. Live beeldvorming van plakjes speekselklier maakt real-time visualisatie en analyse van complexe weefseldynamiek mogelijk, die vaak wordt gemist door traditionele confocale beeldvorming. Bovendien is het duidelijk dat macrofagen dynamische vormveranderingen ondergaan tijdens het uitvoeren van verschillende functies in vivo 47,48,49, en dit protocol biedt waarschijnlijk een betere weergave van deze veranderingen dan een typische statische weergave in vast weefsel. Toekomstige studies kunnen deze techniek gebruiken om te onderzoeken hoe cel-cel communicatie verandert in de loop van homeostase, letsel en regeneratie / resolutie. Deze benadering zal nuttig zijn voor het ophelderen van belangrijke signaalroutes en gebeurtenissen die uiteindelijk therapeutische voordelen kunnen bieden.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
SE wordt gefinancierd door Wellcome Trust-subsidie 108906/Z/15/Z; EE wordt gefinancierd door UKRI/MRC-subsidie MR/S005544/1 en door een Chancellor's Fellowship van de Universiteit van Edinburgh. Figuur 1A is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc) | Avantor/VWR | 734-2240 | Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 35 mm dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Coverslips | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111650 | Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter |
| Double-sided sticker | Grace Bio-Labs | 654004 | SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD |
| EtOH | Scientific Laboratories Supplies | CHE1924 | Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7% |
| F4/80 antibody | Invitrogen | 17-4801-82 | F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience |
| Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Student Fine Forceps Straight Broad Shanks |
| Glass bottom 6 well plate | Cellvis | P06-1.5H-N | 6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025050 | +calcium +magnesium, no phenol red |
| Hoechst | Sigma Aldrich | 14533 | Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Ice box | Fisher Scientific | 11339623 | Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid |
| Imaging and analysis software | Harmony | ||
| Low Melting Agarose | Merck | A9414-25G | |
| Paintbrush | Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 20012027 | |
| RPMI | ThermoFisher | 12634010 | Gibco Advanced DMEM/F-12 |
| Scalpel | Swann-Morton | Disposable scalpels, No. 11 blade | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Extra Narrow Scissors 10.5 cm |
| Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator | JL Shepherd & Associates | ||
| Superglue | Bostik | Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1000 S | |
| Vibratome blades | Astra | Superior Platinum Double Edge blade | |
| Wild-type (C57BL/BJ) mice | Charles River |
References
- Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
- Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
- Lucas, T., et al. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. J Immunol. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Duffield, J. S., et al. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J Clin Invest. 115 (1), 56-65 (2005).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Mass, E., Nimmerjahn, F., Kierdorf, K., Schlitzer, A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 23 (9), 563-579 (2023).
- Dick, S. A., et al. Three tissue resident macrophage subsets coexist across organs with conserved origins and life cycles. Sci Immunol. 7 (67), (2022).
- Hassel, C., Gausserès, B., Guzylack-Piriou, L., Foucras, G. Ductal macrophages predominate in the immune landscape of the lactating mammary gland. Front Immunol. 12, 754661 (2021).
- Kolter, J., et al. A subset of skin macrophages contributes to the surveillance and regeneration of local nerves. Immunity. 50 (6), 1482-1497 (2019).
- Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nat Cell Biol. 22 (5), 546-558 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- McKendrick, J. G., et al. CSF1R-dependent macrophages in the salivary gland are essential for epithelial regeneration after radiation-induced injury. Sci Immunol. 8 (89), doi:10.1126/sciimmunol.add4374 eadd4374 (2023).
- Muntjewerff, E. M., Meesters, L. D., vanden Bogaart, G.
- Bissonnette, E. Y., Lauzon-Joset, J. F., Debley, J. S., Ziegler, S. F. Cross-talk between alveolar macrophages and lung epithelial cells is essential to maintain lung homeostasis. Front Immunol. 11, 583042 (2020).
- Xue, Q., et al. Analysis of single-cell cytokine secretion reveals a role for paracrine signaling in coordinating macrophage responses to TLR4 stimulation. Sci Signal. 8 (381), (2015).
- McArdle, S., Mikulski, Z., Ley, K. Live cell imaging to understand monocyte, macrophage, and dendritic cell function in atherosclerosis. J Exp Med. 213 (7), 1117-1131 (2016).
- Gurevich, D. B., et al. Live imaging of wound angiogenesis reveals macrophage orchestrated vessel sprouting and regression. Embo j. 37 (13), (2018).
- Meziani, L., et al. CSF1R inhibition prevents radiation pulmonary fibrosis by depletion of interstitial macrophages. Eur Respir J. 51 (3), (2018).
- Bickelhaupt, S., et al. Effects of CTGF blockade on attenuation and reversal of radiation-induced pulmonary fibrosis. J Natl Cancer Inst. 109 (8), (2017).
- Formenti, S. C., Demaria, S.
- Chambers, M. S., Garden, A. S., Kies, M. S., Martin, J. W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: pathogenesis, impact on quality of life, and management. Head Neck. 26 (9), 796-807 (2004).
- Radfar, L., Sirois, D. A. Structural and functional injury in minipig salivary glands following fractionated exposure to 70 Gy of ionizing radiation: an animal model for human radiation-induced salivary gland injury. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 96 (3), 267-274 (2003).
- Grehn, A. L., Gustafsson, H., Franzén, L., Thornell, L. E., Henriksson, R. Ultrastructural morphometry of parotid acinar cells following fractionated irradiation. Oral Oncol. 33 (1), 23-28 (1997).
- Rocchi, C., Emmerson, E. Mouth-watering results: clinical need, current approaches, and future directions for salivary gland regeneration. Trends Mol Med. 26 (7), 649-669 (2020).
- Emmerson, E., et al. Salivary glands regenerate after radiation injury through SOX2-mediated secretory cell replacement. EMBO Mol Med. 10 (3), 8051 (2018).
- May, A. J., et al. Diverse progenitor cells preserve salivary gland ductal architecture after radiation-induced damage. Development. 145 (21), (2018).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nat Commun. 4, 1494 (2013).
- Mizrachi, A., et al. Radiation-induced microvascular injury as a mechanism of salivary gland hypofunction and potential target for radioprotectors. Radiat Res. 186 (2), 189-195 (2016).
- Friedrich, R. E., Bartel-Friedrich, S., Holzhausen, H. J., Lautenschläger, C. The effect of external fractionated irradiation on the distribution pattern of extracellular matrix proteins in submandibular salivary glands of the rat. J Craniomaxillofac Surg. 30 (4), 246-254 (2002).
- Vasioukhin, V., Degenstein, L., Wise, B., Fuchs, E. The magical touch: genome targeting in epidermal stem cells induced by tamoxifen application to mouse skin. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8551-8556 (1999).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Gilman, K. E., et al. P2X7 receptor deletion suppresses γ-radiation-induced hyposalivation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 316 (5), R687-R696 (2019).
- Ren, J., et al. Radioprotective effects and mechanism of HL-003 on radiation-induced salivary gland damage in mice. Sci Rep. 12 (1), 8419 (2022).
- Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL6 modulation. Cancer Res. 76 (5), 1170-1180 (2016).
- Chang, S., et al. Inorganic nitrate alleviates total body irradiation-induced systemic damage by decreasing reactive oxygen species levels. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 103 (4), 945-957 (2019).
- Varghese, J. J., et al. Localized delivery of amifostine enhances salivary gland radioprotection. J Dent Res. 97 (11), 1252-1259 (2018).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. gammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).
- Takano, T., et al. Highly localized intracellular Ca(2+) signals promote optimal salivary gland fluid secretion. Elife. 10, (2021).
- Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy. J Vis Exp. 135, (2018).
- O'Dell, N. L., Sharawy, M. H., Schuster, G. S. Effects of in vivo single and multiple isoproterenol injections on subsequently explanted submandibular glands. Acta Anat (Basel. 105 (4), 431-438 (1979).
- Lombaert, I. M., et al. Cytokine treatment improves parenchymal and vascular damage of salivary glands after irradiation). Clin Cancer Res. 14 (23), 7741-7750 (2008).
- Stolp, B., et al. Salivary gland macrophages and tissue-resident CD8(+) T cells cooperate for homeostatic organ surveillance. Sci Immunol. 5 (46), 4371 (2020).
- Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary Sjögren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
- Vanherberghen, B., et al. Microwell-based live cell imaging of NK cell dynamics to assess heterogeneity in motility and cytotoxic response. Methods Mol Biol. 1441, 87-106 (2016).
- de Winde, C. M., Munday, C., Acton, S. E. Molecular mechanisms of dendritic cell migration in immunity and cancer. Med Microbiol Immunol. 209 (4), 515-529 (2020).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Paterson, N., Lämmermann, T. Macrophage network dynamics depend on haptokinesis for optimal local surveillance. Elife. 11, (2022).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
