Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Undersøke celle-celle-interaksjoner i spyttkjertelen via ex vivo levende celleavbildning

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65819
Automatic Translation
1, 1, 1
1The Centre for Regenerative Medicine, Institute for Regeneration and Repair, The University of Edinburgh

Summary

Immunfluorescerende avbildning er begrenset av evnen til å observere komplekse, tidsavhengige biologiske prosesser i bare et enkelt øyeblikksbilde i tid. Denne studien skisserer en live-imaging tilnærming utført på presisjonskutt mus submandibulære kjertelskiver. Denne tilnærmingen muliggjør sanntidsobservasjon av celle-celle-interaksjoner under homeostase og prosessene for regenerering og reparasjon.

Abstract

Spyttkjertel regenerering er en kompleks prosess som involverer intrikate interaksjoner mellom ulike celletyper. Nylige studier har kastet lys over makrofagenes sentrale rolle i å drive den regenerative responsen. Vår forståelse av denne kritiske rollen har imidlertid først og fremst basert seg på statiske synspunkter hentet fra faste vevsbiopsier. For å overvinne denne begrensningen og få innsikt i disse interaksjonene i sanntid, skisserer denne studien en omfattende protokoll for dyrking av spyttkjertelvev ex vivo og fange levende bilder av cellemigrasjon.

Protokollen innebærer flere viktige trinn: Først blir musens submandibulære spyttkjertelvev forsiktig skåret ved hjelp av en vibratome og deretter dyrket ved en luft-væske-grensesnitt. Disse skivene kan bli skadet med vilje, for eksempel gjennom eksponering for stråling, for å indusere cellulær skade og utløse den regenerative responsen. For å spore spesifikke celler av interesse, kan de bli endogent merket, for eksempel ved å benytte spyttkjertelvev samlet fra genetisk modifiserte mus hvor et bestemt protein er merket med grønt fluorescerende protein (GFP). Alternativt kan fluorescerende konjugerte antistoffer brukes til å flekke celler som uttrykker spesifikke celleoverflatemarkører av interesse. Når de er forberedt, blir spyttkjertelskivene utsatt for levende avbildning ved hjelp av et konfokalbildesystem med høyt innhold over en varighet på 12 timer, med bilder tatt med 15 minutters intervaller. De resulterende bildene blir deretter samlet for å lage en film, som deretter kan analyseres for å trekke ut verdifulle celleadferdsparametere. Denne innovative metoden gir forskere et kraftig verktøy for å undersøke og bedre forstå makrofaginteraksjoner i spyttkjertelen etter skade, og dermed fremme vår kunnskap om de regenerative prosessene som spilles i denne dynamiske biologiske konteksten.

Introduction

Makrofager har vist seg å spille stadig viktigere roller i prosessene for regenerering og reparasjon, som strekker seg utover deres klassiske immunfunksjon 1,2. Faktisk er makrofager involvert i en mengde prosesser relatert til regenerering, som viser kritisk regulatorisk aktivitet i alle stadier av reparasjon, samt arrdannelse og fibrose 3,4. Vevsbosatte makrofager er svært heterogene celletyper med komplekse mekanismer som driver forskjellige cellulære fenotyper, og de spiller viktige roller i organutvikling, funksjon og homeostase (som gjennomgått i5). Vevsbosatte makrofager oppstår opprinnelig fra forløpere i eggeplommesekken og fosterleveren, og de erstattes deretter av spredning eller av benmargsavledede blodmonocytter i varierende hastighet, avhengig av levetiden til eksisterende makrofager og vevet eller nisjen derde bor 6,7.

Det er viktig at vevsbosatte makrofager spres gjennom alle vev og bidrar til ulike organfunksjoner. De er unikt programmert av deres mikromiljø for å utføre nisjespesifikke funksjoner. Av denne grunn gir lokaliseringen av makrofager i vevet innsikt i deres funksjon, med unike populasjoner observert i lunge, brystkjertel, tarm, hud og muskel 8,9,10. Under brystkjertelutvikling er duktale makrofager nært forbundet med duktaltreet, og deres uttømming resulterer i betydelig redusert forgrening11. Videre kreves makrofager for morfogenese under puberteten og alveologenese i svangerskapet, hvor de aktivt overvåker epitelet. Ved muskelskade "bor" en spesifikk populasjon av makrofager på skadestedet, og gir en forbigående nisje der de leverer proliferasjonsinduserte signaler som kreves for stamcelleproliferasjon. Dermed viser de den spesialiserte rollen som distinkte makrofagpopulasjoner i styringen av reparasjonsprosessen2. I lungen oppstår et lignende fenomen der interstitielle makrofager primer interleukin (IL)-R1-uttrykkende alveolære type II (AT2) celler for konvertering til skadeassosierte forbigående progenitorer gjennom frigjøring avIL-1B 12. Videre har nyere forskning vist at makrofager er essensielle for regenerering av musens submandibulære spyttkjertel (SMG) etter bestrålingsskade, og i deres fravær forstyrres epitelregenerering13. Samlet sett fremhever disse dataene betydningen av makrofagaktivering og funksjon i forbigående inflammatoriske nisjer etter vevsskade, samt under homeostase.

Makrofager er aktive celler, og deres funksjoner involverer interaksjoner med en rekke forskjellige celletyper, inkludert direkte celle-cellekontakt14,15, samt mer indirekte metoder som sekresjon av løselige faktorer 2,16, som er essensielle for nisjeregulering. Mens klassisk immunfluorescerende avbildning er nyttig for å begynne å avdekke disse interaksjonene, er den begrenset ved å skildre bare et enkelt øyeblikksbilde i tid, og dermed utelate mange tidspunkter som er kritiske for en svært dynamisk regenerativ prosess17,18. Som betydningen av timing og fremveksten av forskjellige bølger av regenerering kommer i skarpere fokus, er det viktig å dissekere disse prosessene i større detalj.

Strålebehandling er en livreddende behandling for mange mennesker diagnostisert med kreft. Mens ofte effektiv på å krympe eller eliminere svulsten (e), kan strålebehandling også skade sunt vev som ligger i strålingsfeltet og fremkalle en immunrespons. Stråleskade kan indusere rask makrofagrekruttering, og direkte og indirekte immunmodulerende responser19,20. Spyttkjertlene blir ofte utilsiktet bestrålt under behandling for hode- og nakkekreft21,22, noe som fører til epitelskade, celleatrofi og fibrose23,24, noe som resulterer i xerostomi eller kronisk munntørrhet25.

Spyttkjertelen består av en mengde celletyper og strukturer, inkludert men ikke begrenset til epitelceller (både spyttproduserende acinarceller og spytttransporterende duktale celler), myoepitelceller, epiteliale stamceller, nerver, blodkar, immunceller, fibroblaster og ekstracellulær matrise (ECM). Rollen og responsen til mange av disse celletypene i den regenerative responsen er tidligere beskrevet 26,27,28,29,30. Men hvordan disse forskjellige cellene samhandler under homeostase og regenerering, og spesielt hvordan immunceller som makrofager oppfører seg, er mindre godt studert. Dette manuskriptet beskriver en nyetablert metode for å studere levende interaksjoner mellom SMG-makrofager og andre celler av interesse i ex vivo-vev. SMG er skåret på en vibratom, farget for overflatemarkører og avbildet i opptil 12 timer. Ved hjelp av denne metoden kan fagocytose av omgivende celler ved makrofager observeres, makrofagmigrasjonskinetikk kan studeres, og direkte celle-celle-interaksjoner mellom makrofager og epitelceller kan demonstreres.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av det britiske innenriksdepartementet og utført under PPLs PB5FC9BD2 og PP0330540. Alle eksperimenter samsvarer med ARRIVE-retningslinjene og de fra University of Edinburgh.

Villtypemus ble kommersielt innhentet (se materialfortegnelse). Krt14CreER; R26mTmG-mus ble avlet i hus ved å krysse Krt14CreER/+ mus31 med R26mTmG/ mTmG-mus 32. I alle eksperimenter ble kvinnelige 8-10 uker gamle mus brukt.

1. Innsamling og innebygging av SMG

  1. Avlive musen/musene ved å utsette dem for en økende konsentrasjon av karbondioksid (CO2). Spray deretter snittområdet med 70 % etanol (EtOH) og bruk saks og tang for å dissekere SMG(ene) forsiktig fra det omkringliggende vevet (figur 1A). Fjern fett og bindevev ved hjelp av tang, og legg kjertelen i et oppsamlingsrør som inneholder iskald Hanks balansert saltløsning (HBSS, se materialtabell).
  2. Skill kjertelen i stykker som måler ca 1 cm2 hver ved hjelp av tang.
  3. Varm opp 4 % agarose til 50 °C, og hell den deretter direkte i en 35 mm tallerken.
  4. Hell en liten mengde smeltet 50 °C agarose i en egen tallerken og skyll kjertelen grundig ved å flytte den rundt i overflødig agarose.
    MERK: Dette trinnet er nødvendig for å fjerne overflødig væske fra kjertlene. Et overskudd av væsker kan forhindre at kjertlene fester seg ordentlig til agarose.
  5. Plasser 4-6 stykker av kjertelen i agarose, slik at de ligger flatt og er i samme plan (figur 1A).
    NOTAT: Forsikre deg om at kjertlene ikke berører overflaten av agar eller bunnen av platen.
  6. Legg lokket på 35 mm-fatet og overfør det til en isboks, som dekker tallerkenen med is.
  7. Vent i 5-10 min til agarose stivner.

2. Seksjonering

  1. Bruk en skalpell til å forsiktig kutte rundt den kjertelinnebygde agaroseblokken, og fjern blokken som inneholder vevet fra parabolen. La det være igjen ca. 5 mm kant.
  2. Fest agaroseblokken til vibratomets stadium (se materialfortegnelse) ved å påføre en dråpe superlim, slik at hele blokkens bunnflate er i kontakt med superlimet.
  3. La superlimet herde i ca. 5 min. Fyll deretter vibratomkammeret med iskaldt 1x fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 1% penicillin-streptomycin (P/S).
  4. Tilsett is på både siden og bunnen av vibratomkammeret.
    MERK: Oppretthold et veldig kaldt miljø og bytt ut isen etter behov.
  5. Trim av overflødig agarose og lag 5 mm mellomrom mellom hvert stykke kjertel ved å lage snitt med en skalpell. Dette vil gi individuelle skiver.
  6. Juster vibratombladet med forsiden av agaroseblokken og sett start- og sluttpunktene til seksjonene for å oppnå ønsket skivetykkelse.
  7. Før du starter skjæreprosessen, må du forsikre deg om at bladet ikke er i kontakt med blokken. Denne forholdsregelen vil forhindre at store biter av agarose ved et uhell kuttes og mister deler av prøven.
  8. Skjær seksjoner med en tykkelse på 150 μm ved lav hastighet og høy vibrasjon (f.eks. en hastighet på 3 og en vibrasjonsinnstilling på 8-10 på en skala fra 1-10 for hver parameter) (figur 1A).
  9. Når en seksjon er kuttet og sluppet ut i den omkringliggende PBS, samle seksjonene ved hjelp av en pensel og legg dem i en tallerken som inneholder forvarmede Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medier med P / S.

3. Dyrking og farging av SMG-skiver

  1. Dyrking
    1. Legg til 1,5 ml RPMI-medier til hver brønn i en 6-brønnsplate som inneholder et 0,4 μm filter. Forsikre deg om at det ikke er noen luftbobler fanget under filteret.
    2. Overfør 1-6 skiver til hvert filter med en pensel, og pass på at du ikke knekker skivene.
      MERK: Kontroller at stykkene ikke er nedsenket i media, men i stedet flyter på filteret. Hvis de er helt nedsenket, kan de kveles under kultur.
    3. Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2, og skift medium hver 3. dag (figur 1A).
    4. Bestråle forsøksplater med en enkeltdose 10 Gy gammastråling ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig bestråler (se materialfortegnelse). Etterpå, returner dem til inkubatoren.
  2. Farging for levende bildebehandling
    1. Bruk en pensel, løft skivene forsiktig fra filteret og legg dem i en 24-brønns plate som inneholder 500 μL kulturmedier per brønn, hvor skivene blir nedsenket.
    2. Tilsett relevante konjugerte antistoffer og nukleær flekk (se materialfortegnelse) til mediet ved passende konsentrasjoner27.
    3. Inkuber skivene med antistoffer i 2 timer ved 37 °C ved forsiktig omrøring.
    4. Vask skivene ved å senke dem i kulturmedier og vaske i 3 runder à 10 min vask ved 37 °C med forsiktig omrøring.

4. Montering og live bildebehandling

  1. Bruk tang, fjern tapen fra den ene siden av en dobbeltsidig bildeavstandsstykke og fest den, med limsiden ned, til bunnen av en glassbunn 6-brønnsplate.
  2. Pipette 50 μL media inn i gapet i midten av avstandsstykket.
  3. Plasser skiven i mediet med en pensel, og sørg for at den ligger flatt uten luftbobler som er fanget.
  4. Bruk en pipette til å fjerne 20 μL medier forsiktig fra gapet.
  5. Fjern tapen fra oversiden av avstandsstykket med tang og legg et 25 mm sirkulært deksel på toppen. Trykk rundt kanten av avstandsstykket for å sikre at dekselet festes godt, og vær forsiktig så du ikke bryter dekselet ved å bruke for mye kraft (figur 1A).
  6. Bilde skiven på et konfokalmikroskop for ønsket tidsperiode eller intervaller (f.eks. hvert 15. minutt i 12 timer ved hjelp av et 20x vannmål).

Representative Results

Makrofagenes respons på skade i den submandibulære spyttkjertelen er fortsatt ukjent. Dette inkluderer om de lokaliserer og migrerer til bestemte strukturer i kjertelen, samt avstanden og hastigheten de migrerer med. Dette har vært vanskelig å bestemme gjennom statiske bildebehandlingsmetoder.

For å løse dette er det utviklet en levende bildebehandlingsmetode for å studere makrofag-epitelcelleinteraksjon i sanntid. Immunfluorescerende farging av skiver ble kombinert med en endogent merket avstamningssporende musemodell (figur 1A og figur 2A). I denne modellen ble skiver utsatt for 10 Gy gammabestråling for å indusere bestrålingsskade og ble avbildet ved 2 timer, 3 dager og 4 dager etter bestråling (IR), med ikke-bestrålte skiver som fungerte som kontroller. Data ble samlet inn fra fire kanaler: Hoechst (ved bruk av laser 425 for å minimere fototoksisitet), GFP (488), dTomato (561) og Alexa 647 (640). En z-stack ble utført, og et bilde ble tatt hver 2-3 μm, med totalt 30 til 40 fly samlet, noe som resulterte i en total høyde på 80-90 μm.

Ved å bruke denne teknikken og analysere membranbundet tomatsignal (mT) og Caspase3/7-aktivitet, ble det tydelig at organotypiske skiver beholdt epitelstrukturen, overlevde i kultur og viste minimal celledød. Dataene viste at ikke-bestrålte skiver av submandibulær kjertel fra R26mTmG-mus 32, dyrket i 7 dager, beholdt sitt mT-signal og epitelarkitektur (figur 1B). 3 dager etter ex vivo-bestråling ble det imidlertid påvist acinar- og duktalcelleatrofi (figur 1B; acini og duktale strukturer markert med henholdsvis stiplede hvite og grønne linjer), forenlig med in vivo strålingsskade13. Apoptose var ubetydelig i de ikke-bestrålte skivene, men det var holdepunkter for caspase 3/7+ celler i de bestrålte skivene 4 dager etter bestrålingen (figur 1C; grønne piler), tilsvarende in vivo-skade 33,34. Videre rekapitulerte bestrålte skiver in vivo DNA-skade 34,35,36,37, som indikert ved forhøyet γH2AX 38 sammenlignet med ikke-bestrålte kontroller (figur 1D,E). Dermed viste organotypiske spyttkjertelskiver god levedyktighet i kultur og reagerte på samme måte som in vivo vev til bestråling.

Etter dette ble sanntids celle-celle-interaksjoner undersøkt. Makrofager som interagerer direkte med GFP-merkede epiteliale stamceller (Krt14CreER-GFP) ble observert over en 12-timers tidsperiode 3 dager etter IR (figur 2A og Video 1). Bemerkelsesverdig nok var det tydelig at makrofager forble i nærheten av epiteliale stamceller i flere timer, og ofte holdt kontakten i hele 12 timers bildeperioden. Videre ble det observert sanntidsfagocytose av epitelceller fra makrofager, noe som bekreftet at makrofager utfører sin tradisjonelle funksjon i skivekulturmodellen (figur 2B, video 2 og video 3). Denne teknikken identifiserte også at makrofager er relativt stasjonære både under homeostase og etter bestrålingsskade, sannsynligvis på grunn av deres høye tetthet i vevet. Dette demonstrerer for første gang at spyttkjertelmakrofager ikke migrerer mye under homeostase eller etter bestrålingsskade. Imidlertid, mens makrofager ikke viste signifikant migrasjon, viste det omkringliggende vevet økt dynamikk etter bestråling, med flere makrofager som aktivt interagerte rundt klynger av merkede epitelceller. I tillegg, basert utelukkende på kjernefysisk farging, tillot denne teknikken oss å visualisere cellebevegelser i skiven over tid, ofte med hele kanaler som ser ut til å "migrere" i vevet (Video 4). Over tid under dyrkingsprosessen ble det tydelig at skiver skiftet fra en flat til en sfæroidlignende morfologi, noe som tyder på at cellebevegelse i skiven sannsynligvis skyldes deres omorganisering til en sfærelignende struktur, som ligner en potensiell omorganiseringshendelse.

Endelig kan live imaging data generert av denne analysen brukes til å kvantitativt måle celleadferd, for eksempel migrasjon. Individuelle celler kan detekteres og segmenteres (figur 3A), og migrasjon kan måles ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig bilde- og analyseprogram (se materialfortegnelse og video 5). Videre kan nærmeste objektanalyse utføres for å avgjøre om celler, i dette tilfellet makrofager, migrerer nærmere andre celler av interesse, i dette tilfellet Krt14CreER-GFP + -celler, og hvordan denne dynamikken endres over tid (figur 3B).

Figure 1
Figur 1: Rekapitulering av in vivo respons i presisjonskuttede spyttkjertelskiver. (A) Skjematisk av den eksperimentelle protokollen. (B) Representative bilder av membranbundet tomat hentet fra fersk submandibulær kjertel (SMG) vev, umanipulerte SMG-skiver dyrket i 7 dager, eller SMG-skiver bestrålt med en enkeltdose på 10 Gy gammabestråling 3 eller 7 dager tidligere. Stiplede hvite linjer indikerer eksempler på acinarstrukturer, og stiplede grønne linjer indikerer eksempler på duktalestrukturer. Skala bar = 50 μm. (C) Representative bilder av Caspase-3/7 uttrykk hentet fra umanipulerte SMG-skiver eller SMG-skiver bestrålt med en enkeltdose på 10 Gy gammabestråling 2 timer eller 4 dager tidligere. Grønne pilspisser indikerer positive kjerner. Skala bar = 50 μm. (D) Representative bilder av γH2AX uttrykk hentet fra umanipulerte SMG-skiver eller SMG-skiver bestrålt med en enkeltdose på 10 Gy gammabestråling 3 dager tidligere. Skala bar = 20 μm. (E) Representativt uttrykk for γH2AX i EpCAM+ epitelceller fra umanipulerte SMG-skiver eller SMG-skiver bestrålt med en enkeltdose på 10 Gy gammabestråling 2 timer og 3 dager tidligere. SSA = spredningsområde på siden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Levende avbildning av makrofag-epitelcelleinteraksjoner og fagocytose. (A) Sekvensielle stillbilder av interaksjoner mellom KRT14+ stamceller og deres avkom (Krt14CreER-GFP+ celler) og makrofager etter bestråling. Levende celleavbildning fanger cellulær dynamikk over en periode på 90 minutter. Skala bar = 20 μm. Tilknyttet video er Video 1. (B) Sekvensielle stillbilder av en makrofagfagocytoserende epitelcelle. Levende cellebilder viser prosessen over en periode på 60 minutter. Hvite piler peker på makrofagen, og gule piler indikerer kjernen til cellen som gjennomgår fagocytose. Skala bar = 50 μm. Tilknyttet video er Video 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Live imaging for cellulær dynamikkanalyse. (A) Bilde som illustrerer individuell celleidentifikasjon og segmentering for analyse av cellulære atferdsparametere, for eksempel migrasjon (se Video 5). Celler er pseudofarget tilfeldig for individuelle celle- og sporforskjeller. Skala bar = 100 μm. (B) Kvantifisering av avstanden (i μm) til nærmeste objekt til individuelle Krt14CreER-GFP + celler plottet over 10 tidspunkter (bilder tatt hvert 5. minutt). Data presentert som middelverdi per brønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Live imaging avslører dynamiske interaksjoner mellom KRT14+ stamceller/avkom og makrofager etter bestråling. Skiver ble utsatt for en enkelt 10 Gy gammabestrålingsdose før levende avbildning. Krt14CreER-GFP+-celler er representert i grønt, makrofager (F4/80+) i rødt og kjerner i cyan. Videoen består av en enkelt z-stack, som spenner over en 12 timers kulturperiode med bilder tatt hvert 15. minutt. Klikk her for å laste ned videoen.

Video 2: Live imaging fange en makrofag oppslukende en epitelcelle. Makrofager (F4/80+) er avbildet i rødt, og kjerner er vist i cyan. Videoen består av en enkelt z-stack og spenner over en 12 timers kulturperiode med bilder tatt hvert 15.

Video 3: Maksimal projeksjon live imaging viser en makrofag som sluker en epitelcelle. Makrofager (F4/80+) vises i rødt, og kjerner vises i cyan. Videoen har en maksimal projeksjon av z-stack bilder på totalt 80 μm (et enkelt plan er presentert i Video 2) og spenner over en 12 timers kultur periode med bilder tatt hver 15 min.Please Klikk her for å laste ned videoen.

Video 4: Live imaging som illustrerer den dynamiske oppførselen til spyttkjertelepitel i kultur etter bestråling. Skivene ble utsatt for en enkelt 10 Gy gammabestrålingsdose før levende avbildning. Makrofager (F4/80+) er representert i rødt, kjerner i cyan. Videoen består av en enkelt z-stack, som spenner over en 12 timers kulturperiode med bilder tatt hvert 15. minutt.Klikk her for å laste ned videoen.

Video 5: Sporing av kvantitativ cellemigrasjon over tid. Denne videoen demonstrerer individuell sporing av cellespor fra live bildevideoer. Piler indikerer cellespor, og celler er pseudofarget individuelt. Videoen består av en enkelt z-stack og spenner over en 1 timers kulturperiode med bilder tatt hvert 15.

Discussion

Evnen til å dyrke spyttkjertelvev ex vivo gir en utmerket mulighet til å studere celle-celle-interaksjoner i sammenheng med både homeostase og skaderespons. Selv om intravital avbildning av musens submandibulære kjertel er mulig39,40, avhenger denne teknikken av å bruke fluorescerende reportermusemodeller for endogent å merke celler av interesse og må utføres under terminal anestesi. Her beskrives en metode for å dyrke submandibulære kjertelskiver ex vivo, som opprettholder cellulær arkitektur og celle-celle-interaksjoner. Denne tilnærmingen foredler dagens levende bildebehandlingsteknikker og gir et alternativ til intravital bildebehandling.

Det langsiktige vedlikeholdet av vev ved hjelp av denne teknikken er avhengig av dyrking av skiver ved en luft-væske-grensesnitt. Tidligere eksplant-modeller 26,41 har sannsynligvis oppnådd vellykket kultur i bare noen få dager fordi de var nedsenket i media og i hovedsak "kvalt". I motsetning til dette opprettholder bruken av et luft-væskegrensesnittkultursystem vevshelse og struktur i en lengre periode, noe som sikrer bildebehandling av høy kvalitet. Metoden med å montere SMG-skiver før avbildning, med en liten mengde media og i et plassbegrenset kammer for å holde skiven flat, er integrert i teknikkens suksess. Visualisering av celler i denne analysen avhenger av endogent merkede reportermus eller fluorescerende konjugerte antistoffer. Overfloden av transgene fluorescerende reportermusemodeller og konjugerte antistoffer rettet mot spesifikke celletyper og undergrupper gjør denne metoden egnet for å utforske forskjellige cellespesifikke interaksjoner.

Selv om denne metoden gir en god modell av vev in situ og ex vivo bestrålingsskader resulterer i acinar og duktal strukturatrofi, lik det som forekommer in vivo13, kan noen elementer ikke rekapituleres ex vivo. Disse inkluderer mangel på fungerende vaskulatur og nevroninngang, samt fravær av infiltrerende inflammatoriske celler. Gitt den veldokumenterte rollen som blodkar og nerver i spyttkjertelhomeostase og regenerering26,42 og betydningen av migrerende immunceller43, som T- og B-celler, i spyttkjertelfunksjon, skaderespons, infeksjon og Sjögrens syndrom (SS) patogenese (som gjennomgått i44), kan denne analysen gå glipp av noen viktige cellulære interaksjoner. I tillegg kan svært raske migrerende hendelser, som Natural Killer (NK) celle45 og Dendritic Cell (DC) 46 bevegelse, bli savnet ved avbildning hvert 15. minutt. Imidlertid kan bildeintervaller optimaliseres for å studere de spesifikke celle-celle-interaksjonene av interesse, og evnen til å avbilde i 3 dimensjoner gjennom z-stakker tillater vurdering av 3D-cellebevegelse. Sikker montering av vevet under avbildning er avgjørende for kvantifisering, for eksempel cellesporingsmålinger. Videre, selv om denne studien benyttet musevev, gir protokollen en levedyktig metode for å studere celle-celle-interaksjoner i menneskelige spyttkjertler, og genererer verdifull translasjonsinformasjon som er uoppnåelig gjennom andre metoder.

Mens rollen til vevsbosatte makrofager i homeostase og regenerering har blitt demonstrert i flere vev 2,10,11,12, forblir deres rolle i spyttkjertlene stort sett ubesvart. Selv om det er kjent at makrofager er essensielle for epitelial regenerering etter bestrålingsskade13, er de nøyaktige mekanismene bak denne effekten fortsatt ukjente. Live imaging av spyttkjertelskiver muliggjør sanntidsvisualisering og analyse av kompleks vevsdynamikk, som ofte savnes av tradisjonell konfokal avbildning. I tillegg er det tydelig at makrofager gjennomgår dynamiske endringer i form mens de utfører forskjellige funksjoner in vivo 47,48,49, og denne protokollen gir sannsynligvis en bedre representasjon av disse endringene enn et typisk statisk syn i fast vev. Fremtidige studier kan bruke denne teknikken til å undersøke hvordan cellekommunikasjon endres i løpet av homeostase, skade og regenerering / oppløsning. Denne tilnærmingen vil være nyttig for å belyse viktige signalveier og hendelser som til slutt kan gi terapeutiske fordeler.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

SE er finansiert av Wellcome Trust grant 108906/Z/15/Z; EE er finansiert av UKRI / MRC grant MR / S005544 / 1 og av et kanslerstipend fra University of Edinburgh. Figur 1A er laget med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc) Avantor/VWR 734-2240 Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm
24 well plate Corning 3524
35 mm dish Falcon 353001
6 well plate Corning 3516
Coverslips Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 111650 Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter 
Double-sided sticker Grace Bio-Labs 654004 SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD
EtOH Scientific Laboratories Supplies CHE1924 Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7%
F4/80 antibody Invitrogen 17-4801-82 F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience
Forceps Fine Science Tools 91113-10 Student Fine Forceps Straight Broad Shanks
Glass bottom 6 well plate Cellvis P06-1.5H-N 6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14025050 +calcium +magnesium, no phenol red
Hoechst Sigma Aldrich 14533 Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Ice box Fisher Scientific 11339623 Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid
Imaging and analysis software Harmony
Low Melting Agarose Merck  A9414-25G
Paintbrush Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 20012027
RPMI ThermoFisher 12634010 Gibco Advanced DMEM/F-12
Scalpel Swann-Morton Disposable scalpels, No. 11 blade
Scissors  Fine Science Tools 14088-10 Extra Narrow Scissors 10.5 cm
Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator JL Shepherd & Associates
Superglue Bostik Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong
Vibratome Leica Leica VT 1000 S
Vibratome blades Astra Superior Platinum Double Edge blade
Wild-type (C57BL/BJ) mice Charles River

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  2. Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
  3. Lucas, T., et al. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. J Immunol. 184 (7), 3964-3977 (2010).
  4. Duffield, J. S., et al. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J Clin Invest. 115 (1), 56-65 (2005).
  5. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  6. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
  7. Mass, E., Nimmerjahn, F., Kierdorf, K., Schlitzer, A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 23 (9), 563-579 (2023).
  8. Dick, S. A., et al. Three tissue resident macrophage subsets coexist across organs with conserved origins and life cycles. Sci Immunol. 7 (67), (2022).
  9. Hassel, C., Gausserès, B., Guzylack-Piriou, L., Foucras, G. Ductal macrophages predominate in the immune landscape of the lactating mammary gland. Front Immunol. 12, 754661 (2021).
  10. Kolter, J., et al. A subset of skin macrophages contributes to the surveillance and regeneration of local nerves. Immunity. 50 (6), 1482-1497 (2019).
  11. Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nat Cell Biol. 22 (5), 546-558 (2020).
  12. Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
  13. McKendrick, J. G., et al. CSF1R-dependent macrophages in the salivary gland are essential for epithelial regeneration after radiation-induced injury. Sci Immunol. 8 (89), doi:10.1126/sciimmunol.add4374 eadd4374 (2023).
  14. Muntjewerff, E. M., Meesters, L. D., vanden Bogaart, G. Antigen cross-presentation by macrophages. Front Immunol. 11, 1276 (2020).
  15. Bissonnette, E. Y., Lauzon-Joset, J. F., Debley, J. S., Ziegler, S. F. Cross-talk between alveolar macrophages and lung epithelial cells is essential to maintain lung homeostasis. Front Immunol. 11, 583042 (2020).
  16. Xue, Q., et al. Analysis of single-cell cytokine secretion reveals a role for paracrine signaling in coordinating macrophage responses to TLR4 stimulation. Sci Signal. 8 (381), (2015).
  17. McArdle, S., Mikulski, Z., Ley, K. Live cell imaging to understand monocyte, macrophage, and dendritic cell function in atherosclerosis. J Exp Med. 213 (7), 1117-1131 (2016).
  18. Gurevich, D. B., et al. Live imaging of wound angiogenesis reveals macrophage orchestrated vessel sprouting and regression. Embo j. 37 (13), (2018).
  19. Meziani, L., et al. CSF1R inhibition prevents radiation pulmonary fibrosis by depletion of interstitial macrophages. Eur Respir J. 51 (3), (2018).
  20. Bickelhaupt, S., et al. Effects of CTGF blockade on attenuation and reversal of radiation-induced pulmonary fibrosis. J Natl Cancer Inst. 109 (8), (2017).
  21. Formenti, S. C., Demaria, S. Systemic effects of local radiotherapy. Lancet Oncol. 10 (7), 718-726 (2009).
  22. Chambers, M. S., Garden, A. S., Kies, M. S., Martin, J. W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: pathogenesis, impact on quality of life, and management. Head Neck. 26 (9), 796-807 (2004).
  23. Radfar, L., Sirois, D. A. Structural and functional injury in minipig salivary glands following fractionated exposure to 70 Gy of ionizing radiation: an animal model for human radiation-induced salivary gland injury. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 96 (3), 267-274 (2003).
  24. Grehn, A. L., Gustafsson, H., Franzén, L., Thornell, L. E., Henriksson, R. Ultrastructural morphometry of parotid acinar cells following fractionated irradiation. Oral Oncol. 33 (1), 23-28 (1997).
  25. Rocchi, C., Emmerson, E. Mouth-watering results: clinical need, current approaches, and future directions for salivary gland regeneration. Trends Mol Med. 26 (7), 649-669 (2020).
  26. Emmerson, E., et al. Salivary glands regenerate after radiation injury through SOX2-mediated secretory cell replacement. EMBO Mol Med. 10 (3), 8051 (2018).
  27. May, A. J., et al. Diverse progenitor cells preserve salivary gland ductal architecture after radiation-induced damage. Development. 145 (21), (2018).
  28. Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nat Commun. 4, 1494 (2013).
  29. Mizrachi, A., et al. Radiation-induced microvascular injury as a mechanism of salivary gland hypofunction and potential target for radioprotectors. Radiat Res. 186 (2), 189-195 (2016).
  30. Friedrich, R. E., Bartel-Friedrich, S., Holzhausen, H. J., Lautenschläger, C. The effect of external fractionated irradiation on the distribution pattern of extracellular matrix proteins in submandibular salivary glands of the rat. J Craniomaxillofac Surg. 30 (4), 246-254 (2002).
  31. Vasioukhin, V., Degenstein, L., Wise, B., Fuchs, E. The magical touch: genome targeting in epidermal stem cells induced by tamoxifen application to mouse skin. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8551-8556 (1999).
  32. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  33. Gilman, K. E., et al. P2X7 receptor deletion suppresses γ-radiation-induced hyposalivation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 316 (5), R687-R696 (2019).
  34. Ren, J., et al. Radioprotective effects and mechanism of HL-003 on radiation-induced salivary gland damage in mice. Sci Rep. 12 (1), 8419 (2022).
  35. Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL6 modulation. Cancer Res. 76 (5), 1170-1180 (2016).
  36. Chang, S., et al. Inorganic nitrate alleviates total body irradiation-induced systemic damage by decreasing reactive oxygen species levels. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 103 (4), 945-957 (2019).
  37. Varghese, J. J., et al. Localized delivery of amifostine enhances salivary gland radioprotection. J Dent Res. 97 (11), 1252-1259 (2018).
  38. Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. gammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).
  39. Takano, T., et al. Highly localized intracellular Ca(2+) signals promote optimal salivary gland fluid secretion. Elife. 10, (2021).
  40. Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy. J Vis Exp. 135, (2018).
  41. O'Dell, N. L., Sharawy, M. H., Schuster, G. S. Effects of in vivo single and multiple isoproterenol injections on subsequently explanted submandibular glands. Acta Anat (Basel. 105 (4), 431-438 (1979).
  42. Lombaert, I. M., et al. Cytokine treatment improves parenchymal and vascular damage of salivary glands after irradiation). Clin Cancer Res. 14 (23), 7741-7750 (2008).
  43. Stolp, B., et al. Salivary gland macrophages and tissue-resident CD8(+) T cells cooperate for homeostatic organ surveillance. Sci Immunol. 5 (46), 4371 (2020).
  44. Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary Sjögren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
  45. Vanherberghen, B., et al. Microwell-based live cell imaging of NK cell dynamics to assess heterogeneity in motility and cytotoxic response. Methods Mol Biol. 1441, 87-106 (2016).
  46. de Winde, C. M., Munday, C., Acton, S. E. Molecular mechanisms of dendritic cell migration in immunity and cancer. Med Microbiol Immunol. 209 (4), 515-529 (2020).
  47. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
  48. Paterson, N., Lämmermann, T. Macrophage network dynamics depend on haptokinesis for optimal local surveillance. Elife. 11, (2022).
  49. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 201
Undersøke celle-celle-interaksjoner i spyttkjertelen <em>via ex vivo</em> levende celleavbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elder, S., Cholewa-Waclaw, J.,… More

Elder, S., Cholewa-Waclaw, J., Emmerson, E. Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging. J. Vis. Exp. (201), e65819, doi:10.3791/65819 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter