Summary
Immunofluorescensavbildning begränsas av förmågan att observera komplexa, tidsberoende biologiska processer i en enda ögonblicksbild. Denna studie beskriver en live-bildmetod som utförs på precisionsskurna mussubmandibulära körtelskivor. Detta tillvägagångssätt möjliggör realtidsobservation av cell-cellinteraktioner under homeostas och processerna för regenerering och reparation.
Abstract
Regenerering av spottkörtlar är en komplex process som involverar intrikata interaktioner mellan olika celltyper. Nya studier har belyst den centrala roll som makrofager spelar för att driva det regenerativa svaret. Vår förståelse av denna kritiska roll har dock främst förlitat sig på statiska bilder erhållna från fixerade vävnadsbiopsier. För att övervinna denna begränsning och få insikter i dessa interaktioner i realtid, beskriver denna studie ett omfattande protokoll för odling av spottkörtelvävnad ex vivo och fånga levande bilder av cellmigration.
Protokollet omfattar flera viktiga steg: Först skärs musens submandibulära spottkörtelvävnad försiktigt med hjälp av en vibratom och odlas sedan vid ett luft-vätskegränssnitt. Dessa skivor kan skadas avsiktligt, till exempel genom exponering för strålning, för att inducera cellskador och utlösa den regenerativa responsen. För att spåra specifika celler av intresse kan de märkas endogent, till exempel genom att använda spottkörtelvävnad som samlats in från genetiskt modifierade möss där ett visst protein är märkt med grönt fluorescerande protein (GFP). Alternativt kan fluorescerande konjugerade antikroppar användas för att färga celler som uttrycker specifika cellytemarkörer av intresse. När de väl har förberetts utsätts spottkörtelskivorna för live-avbildning med hjälp av ett konfokalt bildsystem med högt innehåll under en varaktighet av 12 timmar, med bilder tagna med 15 minuters intervall. De resulterande bilderna sammanställs sedan för att skapa en film, som sedan kan analyseras för att extrahera värdefulla cellbeteendeparametrar. Denna innovativa metod ger forskare ett kraftfullt verktyg för att undersöka och bättre förstå makrofaginteraktioner i spottkörteln efter skada, och därigenom öka vår kunskap om de regenerativa processer som spelar in i detta dynamiska biologiska sammanhang.
Introduction
Makrofager har visat sig spela en allt viktigare roll i regenererings- och reparationsprocesserna, som sträcker sig bortom deras klassiska immunfunktion 1,2. Faktum är att makrofager är involverade i en uppsjö av processer relaterade till regenerering, som uppvisar kritisk reglerande aktivitet i alla stadier av reparation, såväl som ärrbildning och fibros 3,4. Vävnadsresidenta makrofager är mycket heterogena celltyper med komplexa mekanismer som driver olika cellulära fenotyper, och de spelar viktiga roller i organutveckling, funktion och homeostas (som granskats i5). Vävnadsresidenta makrofager uppstår initialt från prekursorer i gulesäcken och fostrets lever, och de ersätts därefter av proliferation eller av blodmonocyter från benmärg i varierande takt, beroende på livslängden hos befintliga makrofager och den vävnad eller nisch i vilkende finns 6,7.
Det är viktigt att notera att makrofager som är bosatta i vävnader är spridda i alla vävnader och bidrar till olika organfunktioner. De är unikt programmerade av sin mikromiljö för att utföra nischspecifika funktioner. Av denna anledning ger lokaliseringen av makrofager i vävnaden insikt i deras funktion, med unika populationer observerade i lungan, bröstkörteln, tarmen, huden och muskeln 8,9,10. Under utvecklingen av bröstkörtlarna är duktala makrofager intimt förknippade med det duktala trädet, och deras utarmning resulterar i signifikant minskad förgrening11. Dessutom krävs makrofager för morfogenes under puberteten och alveologenes under graviditeten, där de aktivt övervakar epitelet. Vid muskelskada "bor" en specifik population av makrofager inom skadestället, vilket ger en övergående nisch där de tillhandahåller proliferationsinducerade signaler som krävs för stamcellsproliferation. Således uppvisar de den specialiserade roll som distinkta makrofagpopulationer spelar för att styra reparationsprocessen2. I lungan uppstår ett liknande fenomen där interstitiella makrofager primar interleukin (IL)-R1-uttryckande alveolära typ II (AT2)-celler för omvandling till skadeassocierade transienta stamceller genom frisättning avIL-1B 12. Dessutom har ny forskning visat att makrofager är viktiga för regenerering av musens submandibulära spottkörtel (SMG) efter strålningsskada, och i deras frånvaro störs epitelregenereringen13. Sammantaget belyser dessa data vikten av makrofagaktivering och funktion i övergående inflammatoriska nischer efter vävnadsskada, såväl som under homeostas.
Makrofager är aktiva celler, och deras funktioner involverar interaktioner med en mängd olika celltyper, inklusive direkt cell-cellkontakt14,15, samt mer indirekta metoder som utsöndring av lösliga faktorer 2,16, som är väsentliga för nischreglering. Även om klassisk immunofluorescensavbildning är användbar för att börja reda ut dessa interaktioner, är den begränsad genom att endast avbilda en enda ögonblicksbild i tiden, vilket utelämnar många tidpunkter som är kritiska för en mycket dynamisk regenerativ process 17,18. Eftersom betydelsen av timing och uppkomsten av olika föryngringsvågor blir allt tydligare, är det viktigt att dissekera dessa processer mer i detalj.
Strålbehandling är en livräddande behandling för många som diagnostiserats med cancer. Även om strålbehandling ofta är effektiv för att krympa eller eliminera tumören/tumörerna, kan den också skada friska vävnader som ligger i strålfältet och framkalla ett immunsvar. Strålskador kan inducera snabb rekrytering av makrofager och direkta och indirekta immunmodulerande svar19,20. Spottkörtlarna bestrålas ofta oavsiktligt under behandling av huvud- och halscancer21,22, vilket leder till epitelskador, cellatrofi och fibros23,24, vilket resulterar i xerostomi eller kronisk muntorrhet25.
Spottkörteln består av en uppsjö av celltyper och strukturer, inklusive men inte begränsat till epitelceller (både salivproducerande acinarceller och salivtransporterande duktala celler), myoepitelceller, epitelceller, nerver, blodkärl, immunceller, fibroblaster och extracellulär matris (ECM). Rollen och responsen för många av dessa celltyper i den regenerativa responsen har tidigare beskrivits 26,27,28,29,30. Hur dessa olika celler interagerar under homeostas och regenerering, och särskilt hur immunceller som makrofager beter sig, är dock mindre väl studerat. Detta manuskript beskriver en nyetablerad metod för att studera de levande interaktionerna mellan SMG-makrofager och andra celler av intresse i ex vivo-vävnad. Kulsprutan skivas på en vibratom, färgas för ytmarkörer och avbildas i upp till 12 timmar. Med hjälp av denna metod kan fagocytos av omgivande celler med makrofager observeras, makrofagmigrationskinetik kan studeras och direkta cell-cellinteraktioner mellan makrofager och epitelceller kan påvisas.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av det brittiska inrikesministeriet och utfördes enligt PPL PB5FC9BD2 och PP0330540. Alla experiment är i linje med ARRIVE-riktlinjerna och de från University of Edinburgh.
Vildtypsmöss erhölls kommersiellt (se materialförteckning). Krt14CreER; R26mTmG-möss föddes upp i huset, genom att korsa Krt14CreER/+ möss31 med R26mTmG/mTmG-möss 32. I alla experiment användes 8-10 veckor gamla honmöss.
1. Samla in och bädda in SMG
- Avliva musen/mössen genom att utsätta dem för en stigande koncentration av koldioxid (CO2 ). Spraya sedan snittområdet med 70 % etanol (EtOH) och använd sax och pincett för att försiktigt dissekera SMG från den omgivande vävnaden (Figur 1A). Ta bort eventuellt fett och bindväv med en pincett och placera körteln i ett uppsamlingsrör som innehåller iskall Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, se materialförteckning).
- Dela körteln i bitar som mäter cirka 1 cm2 vardera med hjälp av en pincett.
- Värm 4 % agaros till 50 °C och häll den sedan direkt i en 35 mm form.
- Häll en liten mängd smält 50 °C agaros i en separat skål och skölj körteln noggrant genom att flytta runt den i överskottet av agaros.
OBS: Detta steg är nödvändigt för att ta bort överflödig vätska från körtlarna. Ett överskott av vätskor kan hindra körtlarna från att fästa ordentligt på agarosen. - Placera 4-6 bitar av körteln i agarosen och se till att de ligger plant och är i samma plan (Figur 1A).
OBS: Se till att körtlarna inte vidrör ytan på agarn eller plattans botten. - Lägg locket på den 35 mm tjocka skålen och lägg den i en isbox och täck tallriken med is.
- Vänta i 5-10 minuter tills agarosen stelnar.
2. Sektionering
- Använd en skalpell för att försiktigt skära runt det körtelinbäddade agarosblocket och ta bort blocket som innehåller vävnaden från skålen. Lämna ungefär en kant på 5 mm.
- Fäst agarosblocket på vibratomsteget (se materialtabell) genom att applicera en droppe superlim, se till att hela blockets bottenyta är i kontakt med superlimmet.
- Låt superlimmet härda i cirka 5 minuter. Fyll sedan vibratomkammaren med iskall 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) som innehåller 1 % penicillin-streptomycin (P/S).
- Tillsätt is på både sidan och botten av vibratomkammaren.
OBS: Upprätthåll en mycket kall miljö och byt ut isen vid behov. - Klipp bort överflödig agaros och skapa 5 mm mellanrum mellan varje körtelbit genom att göra snitt med en skalpell. Detta kommer att ge enskilda skivor.
- Rikta in vibratombladet med agarosblockets yta och ställ in start- och slutpunkterna för sektionerna för att uppnå önskad skivtjocklek.
- Innan du påbörjar skärprocessen, se till att bladet inte är i kontakt med blocket. Denna försiktighetsåtgärd förhindrar att man av misstag skär stora bitar av agaros och förlorar delar av provet.
- Skär sektioner med en tjocklek på 150 μm med låg hastighet och hög vibration (t.ex. en hastighet på 3 och en vibrationsinställning på 8-10 på en skala från 1-10 för varje parameter) (figur 1A).
- När en sektion har skurits och släppts ut i den omgivande PBS, samla ihop sektionerna med en pensel och placera dem i en skål som innehåller förvärmda Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media med P/S.
3. Odling och färgning av SMG-skivor
- Odling
- Tillsätt 1,5 ml RPMI-media till varje brunn på en 6-hålsplatta som innehåller ett 0,4 μm filter. Se till att det inte finns några luftbubblor instängda under filtret.
- Överför 1-6 skivor till varje filter med en pensel, var noga med att inte bryta skivorna.
OBS: Se till att skivorna inte är nedsänkta i media utan istället flyter på filtret. Om de är helt nedsänkta kan de kvävas under odlingen. - Inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 och byt media var 3:e dag (figur 1A).
- Bestråla experimentplattor med en engångsdos av 10 Gy gammastrålning med hjälp av en kommersiellt tillgänglig bestrålare (se materialförteckning). Lägg sedan tillbaka dem i inkubatorn.
- Färgning för live-avbildning
- Använd en pensel, lyft försiktigt skivorna från filtret och placera dem i en 24-hålsplatta som innehåller 500 μL odlingssubstrat per brunn, där skivorna kommer att sänkas ner.
- Tillsätt relevanta konjugerade antikroppar och kärnfärgning (se materialtabell) till mediet i lämpliga koncentrationer27.
- Inkubera skivorna med antikroppar i 2 timmar vid 37 °C under försiktig omrörning.
- Tvätta skivorna genom att sänka ner dem i odlingsmedier och tvätta dem i 3 omgångar om 10 minuters tvätt vid 37 °C med försiktig omrörning.
4. Montering och live-avbildning
- Använd en pincett, ta bort tejpen från ena sidan av en dubbelsidig bilddistans och fäst den med den självhäftande sidan nedåt på botten av en 6-hålsplatta med glasbotten.
- Pipettera 50 μL material i springan i mitten av distansen.
- Placera skivan i mediet med en pensel och se till att den ligger plant utan några luftbubblor.
- Använd en pipett och ta försiktigt bort 20 μL media från springan.
- Ta bort tejpen från distansens ovansida med en pincett och placera en 25 mm rund täckglas ovanpå. Tryck runt kanten på distansen för att säkerställa att täckglaset fäster ordentligt, var försiktig så att du inte bryter täckglaset genom att använda för mycket kraft (Figur 1A).
- Avbilda skivan på ett konfokalmikroskop under önskad tidsperiod eller intervall (t.ex. var 15:e minut i 12 timmar med ett 20x vattenobjektiv).
Representative Results
Makrofagers svar på skada i den submandibulära spottkörteln är fortfarande okänt. Detta inkluderar om de lokaliserar och migrerar till specifika strukturer i körteln, samt avståndet och hastigheten med vilken de migrerar. Detta har varit svårt att fastställa med hjälp av statisk bildbehandling.
För att ta itu med detta har en metod för live-avbildning för att studera makrofag-epitelcellsinteraktion i realtid utvecklats. Immunofluorescensfärgning av skivor kombinerades med en endogent märkt musmodell för härstamning (Figur 1A och Figur 2A). I denna modell exponerades skivorna för 10 Gy gammastrålning för att inducera strålningsskada och avbildades 2 timmar, 3 dagar och 4 dagar efter bestrålning (IR), med icke-bestrålade skivor som kontroller. Data samlades in från fyra kanaler: Hoechst (med laser 425 för att minimera fototoxicitet), GFP (488), dTomato (561) och Alexa 647 (640). En z-stack utfördes och en bild togs var 2-3 μm, med totalt 30 till 40 plan insamlade, vilket resulterade i en total höjd på 80-90 μm.
Genom att använda denna teknik och analysera membranbunden tomatsignal (mT) och Caspase 3/7-aktivitet blev det uppenbart att organotypiska skivor behöll sin epitelstruktur, överlevde i odling och uppvisade minimal celldöd. Data visade att icke-bestrålade skivor av den submandibulära körteln från R26mTmG-möss 32, odlade i 7 dagar, behöll sin mT-signal och epitelarkitektur (Figur 1B). 3 dagar efter ex vivo-bestrålning var dock acinär- och duktalcellsatrofi uppenbar (Figur 1B; acini- och duktalstrukturer markerade med streckade vita respektive gröna linjer), vilket överensstämmer med strålningsskada in vivo 13. Apoptos var försumbar i de icke-bestrålade skivorna, men det fanns tecken på Caspase 3/7+-celler i de bestrålade skivorna 4 dagar efter bestrålning (Figur 1C; gröna pilar), liknande in vivo-skada 33,34. Dessutom rekapitulerade bestrålade skivor in vivo DNA-skador 34,35,36,37, vilket indikeras av förhöjda γH2AX38 jämfört med icke-bestrålade kontroller (figur 1D,E). Organotypiska spottkörtelskivor uppvisade således god livsduglighet i odling och reagerade på liknande sätt på in vivo-vävnad på bestrålning.
Därefter undersöktes cell-cellinteraktioner i realtid. Makrofager som interagerar direkt med GFP-märkta epitelceller (Krt14CreER-GFP) observerades under en 12-timmarsperiod 3 dagar efter IR (Figur 2A och Video 1). Anmärkningsvärt nog var det uppenbart att makrofager förblev i närheten av epitelceller i timmar och ofta höll kontakten under hela den 12 timmar långa avbildningsperioden. Dessutom observerades fagocytos av epitelceller i realtid av makrofager, vilket bekräftar att makrofager utför sin traditionella funktion i skivodlingsmodellen (Figur 2B, Videor 2 och Video 3). Denna teknik identifierade också att makrofager är relativt stationära under både homeostas och efter strålskada, sannolikt på grund av deras höga densitet i vävnaden. Detta visar för första gången att spottkörtelmakrofager inte migrerar i någon större utsträckning under homeostas eller efter strålningsskada. Men även om makrofager inte visade någon signifikant migration, uppvisade den omgivande vävnaden ökad dynamik efter bestrålning, med flera makrofager som aktivt interagerade runt kluster av märkta epitelceller. Dessutom, enbart baserat på kärnfärgning, gjorde denna teknik det möjligt för oss att visualisera cellrörelser i skivan över tid, ofta med hela kanaler som verkar "migrera" i vävnaden (Video 4). Med tiden under odlingsprocessen blev det uppenbart att skivorna skiftade från en platt till en sfäroidliknande morfologi, vilket tyder på att cellrörelser inom skivan sannolikt beror på att de omorganiseras till en sfärliknande struktur, som liknar en potentiell omorganisationshändelse.
Slutligen kan live-bilddata som genereras av denna analys användas för att kvantitativt mäta cellbeteende, såsom migration. Enskilda celler kan detekteras och segmenteras (figur 3A), och migrationen kan mätas med hjälp av en kommersiellt tillgänglig programvara för bildbehandling och analys (se materialtabell och video 5). Dessutom kan närmaste objektanalys göras för att avgöra om celler, i detta fall makrofager, migrerar närmare andra celler av intresse, i detta fall Krt14CreER-GFP+-celler, och hur denna dynamik förändras över tiden (Figur 3B).
Figur 1: Rekapitulation av in vivo-respons i precisionsskurna vävnadsskivor i spottkörtlarna. A) Schematisk beskrivning av försöksprotokollet. B) Representativa bilder av membranbundna tomater erhållna från färsk vävnad från submandibulära körtlar (SMG), omanipulerade SMG-skivor odlade i 7 dagar eller SMG-skivor som bestrålats med en engångsdos av 10 Gy gammastrålning 3 eller 7 dagar tidigare. Streckade vita linjer anger exempel på acinarstrukturer och streckade gröna linjer anger exempel på duktala strukturer. Skalstapel = 50 μm. (C) Representativa bilder av Caspase-3/7-uttryck erhållna från omanipulerade SMG-skivor eller SMG-skivor bestrålade med en engångsdos av 10 Gy gamma-bestrålning 2 timmar eller 4 dagar tidigare. Gröna pilspetsar indikerar positiva kärnor. Skalstapel = 50 μm. (D) Representativa bilder av γH2AX-uttryck erhållna från omanipulerade SMG-skivor eller SMG-skivor som bestrålats med en engångsdos av 10 Gy gamma-bestrålning 3 dagar tidigare. Skalstapel = 20 μm. (E) Representativt uttryck av γH2AX i EpCAM+ -epitelceller från omanipulerade SMG-skivor eller SMG-skivor som bestrålats med en engångsdos av 10 Gy gamma-bestrålning 2 timmar och 3 dagar tidigare. SSA = spridningsområde på sidan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Levande avbildning av makrofag-epitelcellsinteraktioner och fagocytos. (A) Sekventiella stillbilder av interaktioner mellan KRT14+-stamceller och deras avkomma (Krt14CreER-GFP+-celler) och makrofager efter bestrålning. Cellavbildning i realtid fångar celldynamiken under en 90-minutersperiod. Skalstapel = 20 μm. Associerad video är Video 1. (B) Sekventiella stillbilder av en makrofag som fagocytoserar en epitelcell. Cellavbildning i realtid visar processen under en 60-minutersperiod. Vita pilar pekar på makrofagen och gula pilar indikerar kärnan i cellen som genomgår fagocytos. Skalstapel = 50 μm. Associerad video är Video 2. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Live-avbildning för analys av celldynamik. (A) Bild som illustrerar individuell cellidentifiering och segmentering för analys av cellulära beteendeparametrar, såsom migration (se video 5). Celler pseudofärgas slumpmässigt för enskilda celler och spårdistinktion. Skalstapel = 100 μm. (B) Kvantifiering av avståndet (i μm) för det närmaste objektet till enskilda Krt14CreER-GFP+-celler plottade över 10 tidpunkter (bilder tagna var 5:e minut). Data presenteras som medelvärdet per brunn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Live-avbildning som avslöjar dynamiska interaktioner mellan KRT14+ stamceller/avkomma och makrofager efter bestrålning. Skivorna exponerades för en enda gammastråldos på 10 Gy före levande avbildning. Krt14CreER-GFP+-celler representeras i grönt, makrofager (F4/80+) i rött och kärnor i cyan. Videon består av en enda z-stack som spänner över en 12 timmar lång kulturperiod med bilder tagna var 15:e minut. Klicka här för att ladda ner videon.
Video 2: Levande avbildning som fångar en makrofag som uppslukar en epitelcell. Makrofager (F4/80+) visas i rött och kärnor visas i cyan. Videon består av en enda z-stack och sträcker sig över en 12 timmars odlingsperiod med bilder tagna var 15:e minut. Klicka här för att ladda ner videon.
Video 3: Maximal projektion live-avbildning som visar en makrofag som uppslukar en epitelcell. Makrofager (F4/80+) visas i rött och kärnor visas i cyan. Videon har en maximal projektion av z-stack-bilder på totalt 80 μm (ett enda plan presenteras i video 2) och sträcker sig över en 12 timmars odlingsperiod med bilder tagna var 15:e minut. Klicka här för att ladda ner videon.
Video 4: Levande avbildning som illustrerar det dynamiska beteendet hos spottkörtelepitel i odling efter bestrålning. Skivorna utsattes för en enda gammastråldos på 10 Gy före levande avbildning. Makrofager (F4/80+) representeras i rött, kärnor i cyan. Videon består av en enda z-stack som spänner över en 12 timmar lång kulturperiod med bilder tagna var 15:e minut. Klicka här för att ladda ner videon.
Video 5: Kvantitativ spårning av cellmigration över tid. Den här videon visar individuell spårning av cellspår från livebildvideor. Pilar indikerar cellspår och celler är pseudofärgade individuellt. Videon består av en enda z-stack och sträcker sig över en odlingsperiod på 1 timme med bilder tagna var 15:e minut. Klicka här för att ladda ner videon.
Discussion
Möjligheten att odla spottkörtelvävnad ex vivo ger en utmärkt möjlighet att studera cell-cellinteraktioner i samband med både homeostas och skaderespons. Även om intravital avbildning av musens submandibulära körtel är möjlig39,40, är denna teknik beroende av att man använder fluorescerande reportermusmodeller för att endogent märka celler av intresse och måste utföras under terminal anestesi. Här beskrivs en metod för att odla submandibulära körtelskivor ex vivo, med bibehållen cellulär arkitektur och cell-cellinteraktioner. Detta tillvägagångssätt förfinar nuvarande tekniker för live-avbildning och ger ett alternativ till intravital avbildning.
Det långsiktiga underhållet av vävnad med hjälp av denna teknik bygger på odling av skivor vid ett luft-vätskegränssnitt. Tidigare explanteringsmodeller 26,41 har sannolikt uppnått framgångsrik odling under bara några dagar eftersom de var nedsänkta i media och i princip "kvävda". Däremot bibehåller användningen av ett luft-vätskegränssnittsodlingssystem vävnadshälsa och struktur under en längre period, vilket säkerställer högkvalitativ avbildning. Metoden att montera SMG-skivor före avbildning, med en liten mängd media och i en utrymmesbegränsad kammare för att hålla skivan platt, är avgörande för teknikens framgång. Visualisering av celler i denna analys beror på endogent märkta reportermöss eller fluorescerande konjugerade antikroppar. Överflödet av transgena fluorescerande reportermusmodeller och konjugerade antikroppar riktade mot specifika celltyper och undergrupper gör denna metod lämplig för att utforska olika cellspecifika interaktioner.
Även om denna metod ger en bra modell av vävnad in situ och ex vivo bestrålningsskada resulterar i acinär- och duktal strukturatrofi, liknande vad som sker in vivo13, kan vissa element inte rekapituleras ex vivo. Dessa inkluderar bristen på fungerande kärl och neuronal input, såväl som frånvaron av infiltrerande inflammatoriska celler. Med tanke på den väldokumenterade roll som blodkärl och nerver spelar i spottkörtelhomeostas och regenerering 26,42 och betydelsen av migrerande immunceller43, såsom T- och B-celler, i spottkörtelfunktion, skaderespons, infektion och Sjögrens syndrom (SS) patogenes (som granskats i44), kan denna analys missa några viktiga cellulära interaktioner. Dessutom kan mycket snabba migrationshändelser, såsom förflyttning av naturliga mördarceller (NK)45 och dendritiska celler (DC)46, missas genom avbildning var 15:e minut. Avbildningsintervallen kan dock optimeras för att studera de specifika cell-cellinteraktioner som är av intresse, och förmågan att avbilda i 3 dimensioner genom z-staplar möjliggör bedömning av 3D-cellrörelser. Säker montering av vävnaden under avbildning är avgörande för kvantifiering, till exempel cellspårningsmätningar. Dessutom, även om denna studie använde musvävnad, ger protokollet en livskraftig metod för att studera cell-cellinteraktioner i mänskliga spottkörtlar, vilket genererar värdefull translationell information som inte kan uppnås med andra metoder.
Medan rollen av vävnadsresidenta makrofager i homeostas och regenerering har visats i flera vävnader 2,10,11,12, är deras roll i spottkörtlarna i stort sett obesvarad. Även om det är känt att makrofager är nödvändiga för epitelregenerering efter strålningsskada13, är de exakta mekanismerna bakom denna effekt fortfarande okända. Live-avbildning av spottkörtelskivor möjliggör visualisering och analys i realtid av komplex vävnadsdynamik, som ofta missas av traditionell konfokal avbildning. Dessutom är det uppenbart att makrofager genomgår dynamiska förändringar i form medan de utför olika funktioner in vivo 47,48,49, och detta protokoll ger sannolikt en bättre representation av dessa förändringar än en typisk statisk vy i fixerad vävnad. Framtida studier kan använda denna teknik för att undersöka hur cell-cell-kommunikationen förändras under homeostas, skada och regenerering/upplösning. Detta tillvägagångssätt kommer att vara användbart för att belysa viktiga signalvägar och händelser som i slutändan kan erbjuda terapeutiska fördelar.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
SE finansieras av Wellcome Trust grant 108906/Z/15/Z; EE finansieras av UKRI/MRC-anslaget MR/S005544/1 och av ett Chancellor's Fellowship från University of Edinburgh. Figur 1A skapas med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc) | Avantor/VWR | 734-2240 | Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 35 mm dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Coverslips | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111650 | Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter |
| Double-sided sticker | Grace Bio-Labs | 654004 | SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD |
| EtOH | Scientific Laboratories Supplies | CHE1924 | Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7% |
| F4/80 antibody | Invitrogen | 17-4801-82 | F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience |
| Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Student Fine Forceps Straight Broad Shanks |
| Glass bottom 6 well plate | Cellvis | P06-1.5H-N | 6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025050 | +calcium +magnesium, no phenol red |
| Hoechst | Sigma Aldrich | 14533 | Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Ice box | Fisher Scientific | 11339623 | Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid |
| Imaging and analysis software | Harmony | ||
| Low Melting Agarose | Merck | A9414-25G | |
| Paintbrush | Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 20012027 | |
| RPMI | ThermoFisher | 12634010 | Gibco Advanced DMEM/F-12 |
| Scalpel | Swann-Morton | Disposable scalpels, No. 11 blade | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Extra Narrow Scissors 10.5 cm |
| Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator | JL Shepherd & Associates | ||
| Superglue | Bostik | Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1000 S | |
| Vibratome blades | Astra | Superior Platinum Double Edge blade | |
| Wild-type (C57BL/BJ) mice | Charles River |
References
- Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
- Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
- Lucas, T., et al. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. J Immunol. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Duffield, J. S., et al. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J Clin Invest. 115 (1), 56-65 (2005).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Mass, E., Nimmerjahn, F., Kierdorf, K., Schlitzer, A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 23 (9), 563-579 (2023).
- Dick, S. A., et al. Three tissue resident macrophage subsets coexist across organs with conserved origins and life cycles. Sci Immunol. 7 (67), (2022).
- Hassel, C., Gausserès, B., Guzylack-Piriou, L., Foucras, G. Ductal macrophages predominate in the immune landscape of the lactating mammary gland. Front Immunol. 12, 754661 (2021).
- Kolter, J., et al. A subset of skin macrophages contributes to the surveillance and regeneration of local nerves. Immunity. 50 (6), 1482-1497 (2019).
- Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nat Cell Biol. 22 (5), 546-558 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- McKendrick, J. G., et al. CSF1R-dependent macrophages in the salivary gland are essential for epithelial regeneration after radiation-induced injury. Sci Immunol. 8 (89), doi:10.1126/sciimmunol.add4374 eadd4374 (2023).
- Muntjewerff, E. M., Meesters, L. D., vanden Bogaart, G.
- Bissonnette, E. Y., Lauzon-Joset, J. F., Debley, J. S., Ziegler, S. F. Cross-talk between alveolar macrophages and lung epithelial cells is essential to maintain lung homeostasis. Front Immunol. 11, 583042 (2020).
- Xue, Q., et al. Analysis of single-cell cytokine secretion reveals a role for paracrine signaling in coordinating macrophage responses to TLR4 stimulation. Sci Signal. 8 (381), (2015).
- McArdle, S., Mikulski, Z., Ley, K. Live cell imaging to understand monocyte, macrophage, and dendritic cell function in atherosclerosis. J Exp Med. 213 (7), 1117-1131 (2016).
- Gurevich, D. B., et al. Live imaging of wound angiogenesis reveals macrophage orchestrated vessel sprouting and regression. Embo j. 37 (13), (2018).
- Meziani, L., et al. CSF1R inhibition prevents radiation pulmonary fibrosis by depletion of interstitial macrophages. Eur Respir J. 51 (3), (2018).
- Bickelhaupt, S., et al. Effects of CTGF blockade on attenuation and reversal of radiation-induced pulmonary fibrosis. J Natl Cancer Inst. 109 (8), (2017).
- Formenti, S. C., Demaria, S.
- Chambers, M. S., Garden, A. S., Kies, M. S., Martin, J. W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: pathogenesis, impact on quality of life, and management. Head Neck. 26 (9), 796-807 (2004).
- Radfar, L., Sirois, D. A. Structural and functional injury in minipig salivary glands following fractionated exposure to 70 Gy of ionizing radiation: an animal model for human radiation-induced salivary gland injury. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 96 (3), 267-274 (2003).
- Grehn, A. L., Gustafsson, H., Franzén, L., Thornell, L. E., Henriksson, R. Ultrastructural morphometry of parotid acinar cells following fractionated irradiation. Oral Oncol. 33 (1), 23-28 (1997).
- Rocchi, C., Emmerson, E. Mouth-watering results: clinical need, current approaches, and future directions for salivary gland regeneration. Trends Mol Med. 26 (7), 649-669 (2020).
- Emmerson, E., et al. Salivary glands regenerate after radiation injury through SOX2-mediated secretory cell replacement. EMBO Mol Med. 10 (3), 8051 (2018).
- May, A. J., et al. Diverse progenitor cells preserve salivary gland ductal architecture after radiation-induced damage. Development. 145 (21), (2018).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nat Commun. 4, 1494 (2013).
- Mizrachi, A., et al. Radiation-induced microvascular injury as a mechanism of salivary gland hypofunction and potential target for radioprotectors. Radiat Res. 186 (2), 189-195 (2016).
- Friedrich, R. E., Bartel-Friedrich, S., Holzhausen, H. J., Lautenschläger, C. The effect of external fractionated irradiation on the distribution pattern of extracellular matrix proteins in submandibular salivary glands of the rat. J Craniomaxillofac Surg. 30 (4), 246-254 (2002).
- Vasioukhin, V., Degenstein, L., Wise, B., Fuchs, E. The magical touch: genome targeting in epidermal stem cells induced by tamoxifen application to mouse skin. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8551-8556 (1999).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Gilman, K. E., et al. P2X7 receptor deletion suppresses γ-radiation-induced hyposalivation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 316 (5), R687-R696 (2019).
- Ren, J., et al. Radioprotective effects and mechanism of HL-003 on radiation-induced salivary gland damage in mice. Sci Rep. 12 (1), 8419 (2022).
- Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL6 modulation. Cancer Res. 76 (5), 1170-1180 (2016).
- Chang, S., et al. Inorganic nitrate alleviates total body irradiation-induced systemic damage by decreasing reactive oxygen species levels. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 103 (4), 945-957 (2019).
- Varghese, J. J., et al. Localized delivery of amifostine enhances salivary gland radioprotection. J Dent Res. 97 (11), 1252-1259 (2018).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. gammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).
- Takano, T., et al. Highly localized intracellular Ca(2+) signals promote optimal salivary gland fluid secretion. Elife. 10, (2021).
- Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy. J Vis Exp. 135, (2018).
- O'Dell, N. L., Sharawy, M. H., Schuster, G. S. Effects of in vivo single and multiple isoproterenol injections on subsequently explanted submandibular glands. Acta Anat (Basel. 105 (4), 431-438 (1979).
- Lombaert, I. M., et al. Cytokine treatment improves parenchymal and vascular damage of salivary glands after irradiation). Clin Cancer Res. 14 (23), 7741-7750 (2008).
- Stolp, B., et al. Salivary gland macrophages and tissue-resident CD8(+) T cells cooperate for homeostatic organ surveillance. Sci Immunol. 5 (46), 4371 (2020).
- Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary Sjögren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
- Vanherberghen, B., et al. Microwell-based live cell imaging of NK cell dynamics to assess heterogeneity in motility and cytotoxic response. Methods Mol Biol. 1441, 87-106 (2016).
- de Winde, C. M., Munday, C., Acton, S. E. Molecular mechanisms of dendritic cell migration in immunity and cancer. Med Microbiol Immunol. 209 (4), 515-529 (2020).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Paterson, N., Lämmermann, T. Macrophage network dynamics depend on haptokinesis for optimal local surveillance. Elife. 11, (2022).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
