Cette vidéo montre la préparation de cultures primaires de neurones du cerveau des drosophiles stade avancé pupes. Vues des cultures vivantes montrent neurites et l'imagerie des niveaux de calcium en utilisant Fura-2.
Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation des cultures primaires de neurones du cerveau des drosophiles stade avancé pupes. La procédure commence par l'enlèvement des cerveaux des animaux à 70-78 heures après la formation puparium. Les cerveaux isolés sont présentés après une brève incubation de la papaïne suivie de plusieurs lavages en milieu de croissance sans sérum. Le processus de dissociation mécanique de chaque cerveau dans une baisse de 5 ul des médias sur une lamelle est illustré. Les axones et des dendrites des neurones post-mitotiques sont fait une embardée hors près du soma au cours de dissociation, mais les neurones commencent à se régénérer les processus au sein de quelques heures de placage. Les images montrent des cultures vivantes moins 2 jours. Neurones continuer à élaborer des processus pendant la première semaine de la culture. Populations neuronales spécifiques peuvent être identifiées en culture en utilisant GAL4 lignes pour conduire l'expression tissu spécifique de marqueurs fluorescents tels que la GFP ou DP. Enregistrements de cellules entières ont démontré les neurones cultivés forme fonctionnelle, spontanément actifs synapses cholinergiques et GABAergiques. Un segment courte vidéo illustre la dynamique du calcium dans les neurones cultivés en utilisant Fura-2 comme un colorant indicateur de calcium pour contrôler transitoires calciques spontanées et la nicotine réponses de calcium évoquée dans un plat de neurones en culture. Ces cultures du cerveau pupe sont un système modèle utile dans lesquels des outils génétiques et pharmacologiques peuvent être utilisés pour identifier les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui influencent la formation et la fonction des synapses centrales.
Neurones récoltés à partir de cerveaux de rongeurs embryonnaire / postnatale peut être cultivé en culture cellulaire primaire, où elles s'étendent neurites et la forme fonctionnelle des connexions synaptiques. Méthodes de préparation de ces cultures sont bien établies et d'études dans les cultures neuronales de rongeurs ont joué un rôle crucial dans l'identification des gènes et des facteurs environnementaux impliqués dans la régulation de la formation des synapses et de la fonction (Banker et Goslin, 1991). Alor…
Ce travail a été soutenu par le NIH aux subventions NS27501 DKOD. Un appui supplémentaire pour ce travail a été fourni par une subvention à l'UC Irvine en faveur de DKOD l'entremise du Programme Professeur HHMI.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Concanavalin A | Sigma | C-2010 | To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months. | |
Laminin | Sigma | L-2020 | Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months. | |
Coverslips | Bellco Biological Glassware | 1943-00012 | 12 mm glass coverslips | |
ConA + Laminin solution | Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month. | |||
Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C. | ||
Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C. | ||
Solution B: HEPES | Buffer | Sigma | H-3375 | 20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C. |
Solution A | Buffer | For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C. |