Drosophila ( Drosophila ) Dissection du cerveau adulte : une méthode en neurobiologie volante

Overview

Cette vidéo décrit comment disséquer et isoler le cerveau adulte de Drosophila- une procédure nécessaire pour visualiser l’organe, qui est autrement obscurci par la cuticule, l’oeil, et le tissu trachéal. Le protocole d’exemple montre une démonstration détaillée donnant des préparations de haute qualité qui peuvent être employées pour l’immunostaining et les méthodes d’imagerie dans la neurobiologie de Drosophila.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Kelly et coll., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Préparation de la station de dissection

1. Placez le stéréomicroscope et la source lumineuse avec des oies à fibres optiques attachées sur un grand banc. Pour favoriser des mouvements réguliers de la main et réduire le « tremblement » de la main lors de la dissécation, il est essentiel qu’un espace de repos adéquat pour les mains et les bras soit disponible autour du microscope. Assurez-vous qu’il y a environ 8 à 10 pouces de chaque côté du microscope et de 4 à 6 pouces entre la base du microscope et le bord du banc.
2. Remplissez 2 ou 3 puits d’un plat en verre de 9 puits ou 3 puits avec 1,0 mL de tampon PTN (0,1 M de phosphate de sodium tampon pH 7,2, 0,1 % de surfactant nonionique, voir tableau des matériaux pour les composants tampons complets) et placez-les à côté de la station de dissectation sur la glace. Les cerveaux nouvellement disséqués seront transférés dans ce plat et stockés jusqu’à l’étape de fixation.
   REMARQUE: Si l’imagerie en direct est nécessaire, le tampon de dissection doit être tampon 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) ou tampon HL3. Si la localisation des protéines intracellulaires est nécessaire, PBS peut également être utilisé comme tampon alternatif pour la dissection et la fixation. Après fixation, la perméabilisation des membranes cellulaires devrait alors être effectuée à l’aide de lavages PTN contenant 0,1 % ou 0,3 % de détergent non ionique.
   1. Si pbs est employé pour des dissections et la fixation, les bouts de pipette devraient être rincés au moins une fois avec un tampon détergent-contenant (tel que PTN) pour empêcher des cerveaux de coller aux bouts en plastique de pipette pendant le transfert aux tubes de microcentrifugeuse.
3. À l’aide d’un verre vide de 35 mm ou d’une boîte de Pétri en plastique, construire un plat de dissection contenant un élastomer en silicone. En bref, mélanger les composants de l’élastomère selon les directives du fabricant, verser dans des plats de 35 mm, et laisser polymériser pendant la nuit sur une surface plane. Elastomer contenant des plats de dissection doit être utilisé pour protéger les extrémités fines des forceps disséquants, qui peuvent facilement être endommagés si le contact est fait entre les forceps et une surface plus dure, comme un plat en verre. Nous achetons également régulièrement des plats enrobés de silicone disponibles dans le commerce auprès de détaillants en ligne. Pour augmenter le contraste pendant les dissections, les plats de dissection élastomères en silicone contenant du charbon de bois inactivé (et donc du noir coloré) sont particulièrement utiles.

2. Procédure adulte de dissection du cerveau

1. Anesthésier le D. melanogaster adulte de 3 à 5 jours avec du CO_{2 ou} en utilisant de la glace. Si vous utilisez de la glace, placez le flacon contenant des mouches à l’envers (extrémité de prise vers le bas) dans un seau à glace pendant ~5 min. Placer le flacon dans la glace à l’envers empêche les mouches de se loger dans la nourriture. Une fois que les mouches ont été anesthésiées, placez les mouches sur une garniture en métal froid ou une boîte de Pétri assise dans la glace ou sur un coussin de mouche émettant du CO_2. Si vous disséquez des cerveaux pour analyser la neurodégénérescence, des mouches plus âgées peuvent également être utilisées.
2. Placez une petite quantité (150 - 200 μL) de PTN au centre du plat de dissection à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une pipette p200 pour créer une « bulle » de PTN. Placez le plat de dissection sous le stéréomicroscope et ajustez l’éclairage et la mise au point de sorte que la bulle de PTN remplit le champ de vision et soit uniformément éclairée.
3. Manipulez les mouches de sorte qu’elles soient « ventre vers le haut »(c.-à-d.côté ventral vers le haut) tout en se trouvant sur le métal ou le tampon de CO_2.
4. À l’aide d’une #5 forceps, saisir l’abdomen d’une mouche pour la disséquer et, en gardant la main sur la mouche, la submerger complètement dans le PTN sur le plat de dissection.
   REMARQUE: Pour le reste du protocole, toutes les étapes doivent être effectuées pendant que la tête est immergée dans ptn.
5. À l’aide d’une deuxième paire de forceps #5, saisir la base de la trompe de mouche et tirer les deux paires de forceps à part pour détacher la tête de mouche du corps. Jeter l’abdomen et le thorax. Au cours de cette étape, il est essentiel que la tête ne soit pas relâchée et autorisée à flotter à la surface du PTN. Une fois que la tête flotte, il peut être très difficile à saisir à nouveau sans écraser le cerveau.
   REMARQUE: En utilisant cette méthode, les connexions entre le cerveau et le cordon nerveux ventral sont rompues. Si des connexions intactes entre ces régions du SNC sont nécessaires, un autre protocole de dissection devrait être suivi. Si la trompe se détache de la tête de mouche avant que la tête ne soit enlevée, il y aura un trou où se trouvait la trompe. Dans ce cas, saisir la tête de mouche au bord du trou près d’un œil. Retirez ensuite la tête à l’aide d’une force modérée tout en tirant les deux paires de forceps l’une de l’autre. Parfois, lorsque la tête est retirée du corps, l’intestin et/ou le cordon nerveux ventral reste attaché à la tête et doit être enlevé avant de poursuivre la dissection.
6. Tandis qu’une paire de forceps saisit la trompe, la deuxième paire devrait saisir le bord médial de l’oeil droit de mouche. Lentement, retirez les forceps les uns des autres. Cette étape doit être effectuée avec une petite quantité de force latérale constante. Comme les forceps se déplacent lentement les uns des autres, la trompe doit s’éloigner de la tête et créer un trou central dans la cuticule de la tête. Jeter la trompe avec la première paire de forceps sans libérer la partie médiale de l’œil droit de la deuxième paire.
   REMARQUE: Le cerveau adulte de D. melanogaster se trouve dans la région caudale (c.-à-d. postérieure/arrière) de la tête de mouche. Ainsi, il faut éviter de saisir cette région de la tête. Idéalement, seule la partie rostrale(c.-à-d.avant) de la tête près de la rétine médiale doit être directement saisie par les forceps. Le cerveau et la trachée associée doivent maintenant être visibles à travers le trou central dans la cuticule. À ce moment, tous les fils filandreux blancs de trachée qui dépassent du trou peuvent être enlevés et jetés.
7. Avec la deuxième paire de forceps, saisir le bord médial de la rétine gauche (au bord du trou central dans la cuticule de la tête). Pour enlever les rétines et les cuticules associées, éloignez lentement les forceps les uns des autres à un angle de 180°. Comme la rétine se dissocie du lobe optique sous-jacent, vous devriez ressentir une légère diminution de la tension. Procédez lentement pour éviter de déchirer le lobe optique.
   REMARQUE: Séparer les forceps trop rapidement au cours de cette étape peut entraîner la déchirure du lobe optique ou la perturbation des structures du corps champignon. De temps en temps, la cuticule sera enlevée, mais des morceaux de la rétine resteront attachés au lobe optique. Si l’imagerie des corps de champignons, il n’est pas complètement nécessaire d’enlever toute la rétine. Cependant, l’analyse d’autres régions du cerveau (telles que l’innervation des neurones rétiniens des lobes optiques du cerveau) peut exiger que la rétine soit complètement enlevée comme décrit par.
   REMARQUE: Comme la rétine est lentement séparée du lobe optique sous-jacent du cerveau, le lobe optique doit être observable comme une structure blanche opaque recouverte de trachée blanche et filandreuse. Une fois qu’une rétine a été enlevée, elle peut être jetée. Lors de l’analyse du pathfinding des neurones rétiniens, un soin particulier doit être pris au cours de cette étape pour prévenir les dommages au lobe optique. Un protocole supplémentaire axé sur la dissection et l’imagerie en direct des neurones photorécepteurs est également disponible.
8. Maintenant, retirez soigneusement autant de trachée visible que possible. La trachée peut déjà contenir ou se remplir plus tard d’air, ce qui fait flotter le cerveau et, potentiellement, être perdu lors d’étapes d’immunostaining ultérieures. Pour enlever la trachée, retirez-la du cerveau à l’aide d’une paire très #5 forceps.
9. Retirez le reste de la rétine et la cuticule environnante en utilisant les deux paires de forceps pour saisir la région médiale de la rétine de la mouche gauche. Déchirer soigneusement la rétine en deux pour enlever les morceaux de la rétine et de la cuticule. Dans certains cas, enlever la cuticule restante sans écraser le cerveau s’avère particulièrement difficile. Dans ces cas, nous avons constaté que les brins restants du cordon nerveux ventral peuvent plutôt être saisis par une paire de forceps tandis que l’autre paire de forceps est utilisée pour enlever soigneusement le dernier de la cuticule.
10. À l’aide d’une pipette p200, déplacez les cerveaux disséqués vers un puits du plat de 9 ou 3 puits contenant du PTN. Les cerveaux du même génotype doivent être mis en commun dans le même puits et conservés sur la glace. Les tissus cérébraux doivent être fixés dans l’heure qui suit la dissection. Les cerveaux peuvent être fixés en petits lots et mis en commun si un plus grand nombre de cerveaux est nécessaire. Dans la plupart des cas, un chercheur expérimenté peut habituellement disséquer un cerveau et le transférer dans le plat de collecte de verre en environ 3 à 5 minutes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed