Drosophila Disección cerebral adulta: un método en neurobiología mosca

Overview

Este video describe cómo diseccionar y aislar el cerebro adulto de Drosophila, un procedimiento necesario para visualizar el órgano, que de otra manera está oscurecido por la cutícula, el ojo y el tejido traqueal. El protocolo de ejemplo muestra una demostración detallada que produce preparaciones de alta calidad que se pueden utilizar para métodos de inmunodetención e imágenes en neurobiología de Drosophila.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparación de la estación de disección

1. Coloque el estereomicroscopio y la fuente de luz con cuellos de ganso de fibra óptica unidos en una gran sobremesa. Para promover movimientos constantes de las manos y reducir el "agitación" de las manos mientras se disecciona, es esencial que haya espacio adecuado para el descanso de las manos y los brazos alrededor del microscopio. Asegúrese de que hay aproximadamente 8 - 10 pulgadas a ambos lados del microscopio y 4 - 6 pulgadas entre la base del microscopio y el borde del banco.
2. Llene 2 o 3 pozos de un plato de vidrio de 9 o 3 pozos con 1,0 ml de tampón de PTN (0,1 M de fosfato sódico buffer pH 7,2, tensioactivo no iónico del 0,1%, consulte Tabla de materiales para componentes de búfer completos) y colóquelo junto a la estación de disección sobre hielo. Los cerebros recién diseccionados serán transferidos a este plato y almacenados hasta el paso de fijación.
   NOTA: Si se requieren imágenes en vivo, el búfer de disección debe ser 1x línea salina almacenada en búfer de fosfato (PBS) o búfer HL3. Si se requiere localización de proteínas intracelulares, PBS también se puede utilizar como un búfer alternativo para la disección y fijación. Después de la fijación, la permeabilización de las membranas celulares debe realizarse utilizando lavados de PTN que contengan detergente noniónico del 0,1% o 0,3%.
   1. Si PBS se utiliza para disecciones y fijación, las puntas de pipeta deben enjuagarse al menos una vez con un tampón que contenga detergente (como el PTN) para evitar que los cerebros se peguen a las puntas de la pipeta de plástico durante la transferencia a tubos de microcentrífuga.
3. Con una placa de vidrio o petri de plástico vacía de 35 mm, construya una placa de disección que contenga un elastómero de silicona. Mezcle brevemente los componentes del elastómero de acuerdo con las instrucciones del fabricante, vierta en platos de 35 mm y deje que polimerice durante la noche en una superficie plana. Elastómero que contiene platos de disección debe utilizarse para proteger las puntas finas de disección de fórceps, que pueden dañarse fácilmente si se hace contacto entre los fórceps y una superficie más dura, como un plato de vidrio. También compramos regularmente platos recubiertos de silicona disponibles comercialmente de minoristas en línea. Para aumentar el contraste durante las disecciones, los platos de disección de elastómero de silicona que contienen carbón inactivado (y por lo tanto negro coloreado) son particularmente útiles.

2. Procedimiento de disección cerebral para adultos

1. Anestesiado 3 - 5 días adulto D. melanogaster con CO₂ o mediante el uso de hielo. Si utiliza hielo, coloque el vial que contiene moscas al revés (enchufe hacia abajo) en un cubo de hielo durante ~5 min. Colocar el vial en hielo al revés evita que las moscas se alo por el alimento. Una vez que las moscas hayan sido anestesiadas, coloque las moscas en una almohadilla de metal frío o una placa de Petri sentadas en hielo o en una almohadilla de mosca emisora de CO_2. Si se diseccionar cerebros para analizar la neurodegeneración, también se pueden utilizar moscas mayores.
2. Coloque una pequeña cantidad (150 - 200 μL) de PTN en el centro del plato de disección usando una pipeta de transferencia o una pipeta p200 para crear una "burbuja" de PTN. Coloque el plato de disección debajo del estereomicroscopio y ajuste la iluminación y el enfoque para que la burbuja del PTN llene el campo de visión y se ilumine uniformemente.
3. Manipular las moscas para que estén "boca arriba"(es decir,lado ventral hacia arriba) mientras se encuentran en la almohadilla de metal o CO_2.
4. Usando un par de fórceps #5, agarra el abdomen de una mosca para ser diseccionado y, manteniendo la mosca, sumérgela completamente en el PTN en el plato de disección.
   NOTA: Para el resto del protocolo, todos los pasos deben realizarse mientras la cabeza está sumergida en PTN.
5. Usando un segundo par de fórceps #5, agarre la base del proboscis de mosca y tire de los dos pares de fórceps para separar la cabeza de mosca del cuerpo. Deseche el abdomen y el tórax. Durante este paso, es fundamental que la cabeza no se libere y se le permita flotar en la superficie del PTN. Una vez que la cabeza está flotando, puede ser muy difícil de agarrar de nuevo sin aplastar el cerebro.
   NOTA: Con este método, se cortan las conexiones entre el cerebro y el cordón nervioso ventral. Si se requieren conexiones intactas entre estas regiones del SNC, se debe seguir un protocolo de disección alternativo. Si el proboscis se separa del cabezal de mosca antes de que se retire la cabeza, habrá un agujero donde estaba el proboscis. En este caso, agarre la cabeza de la mosca en el borde del agujero cerca de un ojo. A continuación, retire la cabeza usando una cantidad moderada de fuerza mientras tira de los dos pares de fórceps separados entre sí. Ocasionalmente, cuando se extrae la cabeza del cuerpo, el intestino y/o el cordón nervioso ventral permanecen unidos a la cabeza y deben retirarse antes de continuar con la disección.
6. Mientras que un par de fórceps agarra el proboscis, el segundo par debe agarrar el borde medial del ojo de mosca derecho. Lentamente, desgarra los fórceps el uno del otro. Este paso debe realizarse con una pequeña cantidad de fuerza lateral constante. A medida que los fórceps se separan lentamente entre sí, los proboscis deben alejarse de la cabeza y crear un agujero central en la cutícula de la cabeza. Deseche el proboscis con el primer par de fórceps sin liberar la parte medial del ojo derecho del segundo par.
   NOTA: El cerebro adulto D. melanogaster se encuentra en la región caudal(es decir,posterior/trasera) del cabezal de mosca. Por lo tanto, debe evitarse agarrar esa región de la cabeza. Idealmente, sólo la parte rostral(es decir,frontal) de la cabeza cerca de la retina medial debe ser agarrada directamente por los fórceps. El cerebro y la tráquea asociada ahora deben ser visibles a través del agujero central en la cutícula. En este momento, cualquier hilo blanco encorvado de tráquea que sobresalga del agujero se puede quitar y descartar.
7. Con el segundo par de fórceps, agarre el borde medial de la retina izquierda (en el borde del agujero central en la cutícula de la cabeza). Para eliminar las retinas y la cutícula asociada, tire lentamente de los fórceps el uno del otro en un ángulo de 180°. A medida que la retina se desvincula del lóbulo óptico subyacente, debe sentir una ligera disminución de la tensión. Proceda lentamente para evitar que se rompa el lóbulo óptico.
   NOTA: Separar los fórceps demasiado rápido durante este paso puede resultar en el desgarro del lóbulo óptico o la interrupción de las estructuras del cuerpo de hongos. Ocasionalmente, se eliminará la cutícula, pero las piezas de la retina permanecerán unidas al lóbulo óptico. Si se toma imágenes de los cuerpos de las setas, no es completamente necesario extraer toda la retina. Sin embargo, el análisis de otras regiones cerebrales (como la invvación de la neurona retiniana de los lóbulos cerebrales ópticos) puede requerir que la retina se elimine por completo como se describe.
   NOTA: A medida que la retina se separa lentamente del lóbulo óptico subyacente del cerebro, el lóbulo óptico debe ser observable como una estructura blanca opaca cubierta de tráquea blanca y encorvada. Una vez que se ha eliminado una retina, se puede descartar. Al analizar el pathfinding de las neuronas de la retina, se debe tener especial cuidado durante este paso para prevenir el daño al lóbulo óptico. También está disponible un protocolo adicional centrado en la disección y la imagen en vivo de las neuronas fotorreceptores.
8. Ahora, retire cuidadosamente la mayor cantidad posible de tráquea visible. La tráquea ya puede contener o llenarse posteriormente de aire, haciendo que los cerebros floten y, potencialmente, se pierdan durante los pasos posteriores de inmunodetención. Para eliminar la tráquea, sáquela del cerebro usando un par de fórceps #5 muy afilados.
9. Retire la retina restante y la cutícula circundante usando ambos pares de fórceps para agarrar la región medial de la retina de la mosca izquierda. Rasgar cuidadosamente la retina por la mitad para eliminar trozos de la retina y la cutícula. En algunos casos, eliminar la cutícula restante sin aplastar el cerebro resulta especialmente difícil. En estos casos, hemos encontrado que las hebras restantes del cordón nervioso ventral pueden ser agarradas por un par de fórceps, mientras que el otro par de fórceps se utiliza para eliminar cuidadosamente el último de la cutícula.
10. Usando una pipeta p200, mueva los cerebros diseccionados a un pozo del plato de 9 o 3 pozos que contiene PTN. Los cerebros del mismo genotipo deben agruparse en el mismo pozo y mantenerse en hielo. El tejido cerebral debe fijarse dentro de una hora después de la disección. Los cerebros se pueden fijar en lotes pequeños y agruparse si se requiere un mayor número de cerebros. En la mayoría de las circunstancias, un investigador experimentado generalmente puede diseccionar un cerebro y transferirlo al plato de recolección de vidrio en aproximadamente 3 - 5 min.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed