Дрозофила Рассечение мозга взрослых: метод в нейробиологии мухи

Overview

Это видео описывает, как вскрыть и изолировать взрослый мозг Drosophila-процедура, необходимая для визуализации органа, который в противном случае скрыты кутикулы, глаз и трахеи ткани. Пример протокола показывает подробную демонстрацию, дать высококачественные препараты, которые могут быть использованы для иммуностиминга и методов визуализации в нейробиологии Дрозофилы.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Келли и др.,вскрытие и иммунофлуоресцентное окрашивание грибного тела и фоторецептор нейронов во взрослых Drosophila меланогастер мозга, J. Vis. Exp. (2017).

1. Подготовка станции вскрытия

1. Распоистите стереомикроскоп и источник света с прикрепленными волоконно-оптическими гусиными водолазами на большой скамейке. Для содействия устойчивые движения рук и уменьшить руку "встряхнуть" при вскрытии, важно, чтобы адекватные руки и руки отдыха пространство доступно вокруг микроскопа. Убедитесь, что есть примерно 8 - 10 дюймов по обе стороны от микроскопа и 4 - 6 дюймов между основанием микроскопа и края скамейки.
2. Заполните 2 или 3 колодца стеклянного 9-хорошо или 3-хорошо блюдо с 1,0 мл буфера PTN (0,1 М фосфата натрия buffer pH 7,2, 0,1% неионные сурфактант, см. Таблица материалов для полного буфера компонентов) и место рядом с рассечения станции на льду. Недавно расчлененные мозги будут переданы этому блюду и храниться до шага фиксации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется живая визуализация, буфером вскрытия должен быть буфер 1x фосфат буферного солевого раствора (PBS) или буфер HL3. Если требуется внутриклеточная локализация белка, PBS также может быть использован в качестве альтернативного буфера для вскрытия и фиксации. После фиксации, проницаемость клеточных мембран должна быть выполнена с помощью PTN моет содержащие 0,1% или 0,3% неионического моющего средства.
   1. Если PBS используется для вскрытия и фиксации, пипетки советы должны быть промыты по крайней мере один раз с моющим средством, содержащим буфер (например, PTN), чтобы предотвратить мозг от прилипания к пластиковой пипетки советы во время передачи в микроцентрифуг труб.
3. Используя пустое 35-мм стекло или пластиковую чашку Петри, постройте рассечение, содержащее силиконовый еластомер. Короче говоря, смешать компоненты еластомера в соответствии с указаниями производителя, налить в 35 мм посуду, и дайте ему полимеризировать на ночь на плоской поверхности. Еластомер, содержащий рассечение блюд, следует использовать для защиты тонких кончиков рассечения щипец, которые могут быть легко повреждены, если контакт между щипец и более трудной поверхности, таких как стеклянная тарелка. Мы также регулярно покупаем коммерчески доступные силиконовые блюда с покрытием у интернет-магазинов. Для увеличения контрастности во время вскрытий особенно полезны силиконовые ерастомные блюда, содержащие инактивированный уголь (и, таким образом, окрашенные в черный цвет).

2. Процедура вскрытия мозга взрослых

1. Анестезия 3 - 5 дней взрослый D. melanogaster с CO₂ или с помощью льда. При использовании льда поместите флакон, содержащий мух вверх дном (заткнуть конец вниз) в ведро со льдом в течение 5 минут. Размещение флакона во льду вверх дном предотвращает попадание мух в пищу. После того, как мухи были обезболены, поместите мух на холодную металлическую подушечку или чашку Петри, сидящую во льду или на CO_2, излучающих мухомочку. Если вскрыть мозг для анализа нейродегенерации, старые мухи также могут быть использованы.
2. Поместите небольшое количество (150 - 200 МКЛ) PTN в центре рассечения блюдо с помощью передачи пипетки или р200 пипетки для создания "пузырь" PTN. Поместите рассечение блюдо под стереомикроскоп и настроить освещение и фокус так, что пузырь PTN заполняет поле зрения и равномерно освещены.
3. Манипулируйте мухами так, чтобы они «живот вверх»(т.е.вентрал-сторона вверх) лежа на металлической или CO_{2 площадке.}
4. Используя одну пару #5, схватить живот мухи, чтобы быть вскрыты и, удерживая муху, полностью погрузить его в PTN на вскрытии блюдо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для оставшейся части протокола все шаги должны выполняться в то время как голова погружена в PTN.
5. Используя вторую пару #5, схватить основание хоботка мухи и тянуть две пары типсов друг от друга, чтобы отделить голову мухи от тела. Откажитесь от живота и грудной клетки. Во время этого шага крайне важно, чтобы голова не была выпущена и не позволяла плавать на поверхности PTN. Как только голова плавает, это может быть очень трудно понять снова без дробления мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используя этот метод, соединения между мозгом и желудочковый нервный шнур разорваны. Если требуются нетронутые связи между этими регионами ЦНС, следует следовать альтернативному протоколу вскрытия. Если хоботок отделяется от головы мухи до удаления головы, будет отверстие, где хоботок был. В этом случае, схватить голову мухи на краю отверстия возле одного глаза. Затем удалите голову, используя умеренное количество силы, потянув две пары типсов друг от друга. Иногда, когда голова удаляется из тела, кишечник и / или брюшной нервный шнур остается прикрепленным к голове и должны быть удалены до продолжения вскрытия.
6. В то время как одна пара типсов захватывает хоботок, вторая пара должна схватить медиальный край правого глаза мухи. Медленно, тянуть типсы друг от друга. Этот шаг должен выполняться с небольшим количеством устойчивой боковой силы. По мере того как типсы медленно двигают отдельно друг от друга, хоботок должен вытянуть далеко от головки и создать центральное отверстие в кутикуле головки. Отбросьте хоботок с первой парой типсов, не выпуская медиальной части правого глаза от второй пары.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослый мозг D. melanogaster находится в хвостовой(т.е.задней/задней) области головы мухи. Таким образом, следует избегать захвата этого региона головы. В идеале, только ростральной(т.е.передней) части головы вблизи медиальной сетчатки должны быть непосредственно схваты миппы. Мозг и связанная с ним трахея теперь должны быть видны через центральное отверстие в кутикуле. В это время любые белые тягучие нити трахеи, выступающие из отверстия, могут быть удалены и отброшены.
7. Со второй парой типсов, схватить медиальный край левой сетчатки (на краю центрального отверстия в кутикуле головы). Чтобы удалить сетчатку и связанную с ней кутикулу, медленно вытяните миппы друг от друга под углом 180 градусов. Как сетчатка отмежевается от основной оптической доли, вы должны чувствовать небольшое снижение напряжения. Продолжайте медленно, чтобы предотвратить разрыв оптической доли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разделение типсов слишком быстро во время этого шага может привести к разрыву оптической доли или нарушению структуры тела гриба. Иногда кутикула удаляется, но части сетчатки остаются прикрепленными к оптической доле. При визуализации грибов органов, это не совсем необходимо удалить всю сетчатку. Тем не менее, анализ других областей мозга (таких как иннервация нейронов сетчатки зрительных долей мозга) может потребовать полного удаления сетчатки, как описано.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку сетчатка медленно отделяется от основной оптической доли мозга, оптическая доля должна наблюдаться как непрозрачная белая структура, покрытая белой, тягучий трахеей. После удаления одной сетчатки она может быть удалена. При анализе патового пути нейронов сетчатки, особое внимание следует принимать во время этого шага, чтобы предотвратить повреждение оптической доли. Также доступен дополнительный протокол, ориентированный на вскрытие и живую визуализацию нейронов фоторецептора.
8. Теперь осторожно удалите как можно больше видимой трахеи. Трахея может уже содержать или позже наполняться воздухом, в результате чего мозг плавать и, потенциально, быть потеряны во время более поздних иммуностимуляторных шагов. Чтобы удалить трахею, снимите ее с мозга, используя очень острую пару #5 миппов.
9. Удалите оставшуюся сетчатку и окружающую кутикулу с помощью обеих пар типсов, чтобы схватить медиальной области левой мухи сетчатки. Аккуратно разорвьте сетчатку пополам, чтобы удалить кусочки сетчатки и кутикулы. В некоторых случаях удаление оставшейся кутикулы без дробления мозга оказывается особенно сложным. В этих случаях мы обнаружили, что оставшиеся нити брюшного нервного шнура могут быть схваты одной парой типсов, в то время как другая пара типсов используется для тщательного удаления последней кутикулы.
10. Используя р200 пипетки, переместить расчлененные мозги в один колодец из 9- или 3-хорошо блюдо, содержащее PTN. Мозги одного и того же генотипа должны быть сведены в один и тот же колодец и храниться на льду. Ткань мозга должна быть исправлена в течение одного часа после вскрытия. Мозги могут быть исправлены небольшими партиями и объединились, если требуется большее количество мозгов. В большинстве случаев опытный исследователь обычно может вскрыть мозг и перенести его в стеклянное блюдо сбора примерно за 3 - 5 минут.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed