Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Verzamel in een buis met M9-buffer maximaal 150 hermafrodietwormen in het gewenste stadium van ontwikkeling. Verwijder bacteriën uit de wormen door te wassen met M9-buffer en het monster te centrifugeren.
Bekijk de buis onder een ontleedmicroscoop bij het verwijderen van het supernatant om verlies van monster te voorkomen. Breng de wormen over in een glazen schaal met een minimaal volume M9-buffer. Voeg levamisole toe om de wormen te verdoven.
Zoek de kop van de worm en de farynx, of foregut, die twee bolvormige structuren bevat. Gebruik twee naalden om door de worm achter de farynx te snijden. Zorg ervoor dat u de dissectie snel voltooit om te voorkomen dat het weefsel wordt aangetast.
Zodra de nagelriem is verstoord, worden de twee geslachtsarmen geëxtrudeerd of uit het lichaam geduwd vanwege de interne druk van de worm.
In dit voorbeeld zullen we geslachtsklieren van volwassen wormen ontleden voor immunofluorescentieanalyse.
- Pluk 100 tot 150 wormen in de gewenste ontwikkelingsfase en verzamel ze in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 100 microliter M9-buffer. Vul vervolgens de microcentrifugebuis met nog eens 900 microliters M9-buffer en centrifugeer deze gedurende 1 minuut op 1 minuut bij kamertemperatuur op 1000 keer g.
Verwijder onder een ontleedmicroscoop voorzichtig 900 microliters van de M9-buffer. Herhaal vervolgens de was nog twee keer om de meeste aangekoppelde bacteriën te verwijderen.
Vervolgens, met behulp van een 200-microliter micropipet tip met een verbrede boring, breng de wormen in 100 microliters van M9 buffer over naar een glazen wijzerplaat met platte bodem. Voeg vervolgens 1 tot 3 microliters van 0,1 molaire levamisole toe aan de schaal en draai deze voorzichtig. Bevestig nu twee 25-gauge naalden aan twee spuiten om één ontledingsgereedschap voor elke hand te maken.
Plaats onder een ontleedmicroscoop elke naald onder en over elke worm en maak een fijne snede op elke worm in de buurt van de tweede faryngeale bol met behulp van een schaarachtige beweging. Snijd alle dieren minstens één keer binnen vijf minuten om de levamisole effectief te houden.
- Het is erg belangrijk dat de dissectie van de dieren in de schaal in minder dan vijf minuten wordt voltooid.
- Als een geëxtrudeerde gonade niet zichtbaar is, sla dan gewoon dat dier over. De juiste geëxtrudeerde geslachtsklieren zijn hier zichtbaar.
