ג. אלגנס הבלטת גונד: טכניקת ניתוח מהירה

Overview

סרטון זה מתאר שיטה לנתח גונדות של הרמפרודיטים בוגרים C. elegans, וכתוצאה מכך רקמות המתאימות להדמיה חיסונית ופלואורסצנטית.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Gervaise ו Arur, ניתוח מרחבי וטמפורלי של פעיל ERK ב C. elegans Germline. ג'יי ויס אקספ. (2016).

1. ניתוח תולעים למבוגרים להשגת גונדים

1. בחר 100 - 150 WT (N2) או הגנוטיפ הרצוי של תולעים בשלב ההתפתחותי הרצוי והספציפיות (L1, L2, L3, L4, מבוגר וכו ')ב 100 μL של חיץ M9 בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
2. למלא את הצינור microcentrifuge עם 900 μL של מאגר M9 (ראה לוח חומרים). צנטריפוגה הצינורות ב 1,000 x g במיקרוצנטריפוגה במשך 1 דקות בטמפרטורת הסביבה.
3. הסר בעדינות 900 μL של מאגר M9 והשליך. הסר את המאגר תחת מיקרוסקופ מנתח כדי להבטיח שהתולעים לא יוסרו בטעות.
4. חזור על שלבים 1.2 - 1.3 פעמיים נוספות עם מאגר M9 טרי בכל פעם. זה מבטיח שכל החיידקים שנסחפו עם התולעים נשטפים ביעילות.
5. לאחר הכביסה הסופית להסיר 900 μL של מאגר M9 מהצינור ולהשליך.
6. העבר את 100 μL הנותרים של חיץ M9 המכיל את 100 - 150 תולעים עם קצה 200 μL-micropipette לצלחת שעון זכוכית תחתונה שטוחה. ודא שקצה המיקרופיפט נחתך בסימן 10 μL לפני השימוש. אי חיתוך הקצה יגרום להטעיה של התולעים.
7. הוסף 1 - 3 μL של 0.1 M levamisole לצלחת שעון זכוכית המכילה את התולעים במאגר M9. בעדינות מערבולת levamisole ו M9 כדי לאפשר אפילו ערבוב עד התולעים להפסיק לזוז.
   שים לב: מניות Levamisole ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. כאן, להשתמש בריכוז גבוה יותר של 1 - 3 מ"מ ממה שתואר בספרות23 של 0.2 - 0.25 מ"מ של levamisole על מנת להשיג אובדן מהיר של ניידות בבעלי החיים. אם בעלי החיים מתנופפים במשך זמן רב מדי בהשעיה הנוזלית, הדפוסים המתקבלים של dpERK באוטינות יכולים להיות משתנים (עקב מתח או חוסר תזונה או שניהם). דפוסי כתמים לשחזור יותר הושגו עם 1 - 3 mM levamisole לניתוח.
8. לצרף שני מחטים 25 G לשני מזרקים 1 מ"ל (גודל המזרק לא משנה, מד המחט הוא קריטי). מקם מזרק אחד בכל יד (איור 1).
9. תחת מיקרוסקופ מנתח, מקמו כל מחט מתחת ומעל כל תולעת כפי שמוצג באיור 1 והניחו חתך דק על התולעת ליד הנורה הלוע השנייה בתנועה דמוית מספריים. לאחר חתך אחד בתולעת לעבור לחיה הבאה עד שכל בעלי החיים בצלחת נחתכו לפחות פעם אחת.
   שים לב: שים לב כי שלבים 1.8 - 1.9 הם רגישים לזמן. לנתח את כל התולעים בצלחת בפחות מחמש דקות עבור דפוס dpERK לשחזור. זמני ניתוח ארוכים יותר יגרמו לכיבוי אות ה- dpERK, במיוחד באזור 1. התאם את מספר התולעים לכל סיבוב של ניתוח(כלומר,50 תולעים לעומת 150) במידת הצורך כדי להישאר במסגרת הזמן שהוקצתה.
   1. במקרה גונד מובלט אינו גלוי במהלך הניתוח, אל תנסה חתך נוסף באותה חיה. בדרך כלל זה יהיה רק למול את החיה ולא לגרום להבלטה של gonad. במקום זאת, לעבור לחיה הבאה. תולעים שבהן gonads לא להבליט יופיעו ככזה על השקופיות שיבוצעו בסעיף 6 וניתן להתעלם במהלך הדמיה
      שים לב: באמצעות כל שלבי הניתוח והעיבוד, חשוב לזכור כי הגונד יישאר מחובר לגוף / פגר. אין לכפות את הגונד ואת הגוף לגזרים עם המחט. לעתים קרובות קרע חריג ברקמת האשך בניסיון לנתק את הגונד מהגוף יכול לגרום לאות נוגדנים מזויף. ניתן להתעלם מהגוף/הפגר במהלך שלבי ההדמיה, ורק את הגונד בתמונה. בנוסף, לפעמים תאי המעי יכולים לשמש גם פקדים פנימיים / בקרות סומטיות עבור הנוגדן להיות assayed.

איור 1: הדגמה של תנוחות מחט במהלך ניתוחים. משמאל: תצלום של ניתוח בתהליך. מימין: תנוחות מחט עם התייחסות לתולעת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.