Ethanol-Fixierung und DAPI-Färbung: Eine Methode zur Visualisierung von DNA in C. elegans

- Beginnen Sie mit einem Tropfen Pufferlösung auf einem Mikroskopschlitten und übertragen Sie intakte Würmer auf das Tröpfchen. Sobald die Würmer an Ort und Stelle sind, verwenden Sie ein fusselfreies Gewebe, um den Puffer aufzusaugen und zu entfernen. Befestigen Sie die Probe, indem Sie die Proben mehrmals mit 90% Ethanol baden, so dass sie nach jeder Anwendung verdampfen kann.

Sobald das Ethanol nach der endgültigen Spülung verdampft ist, fügen Sie der Probe eine Lösung hinzu, die den Nukleinsäurefarbstoff DAPI enthält. DAPI bindet bevorzugt an Adenin- und Thyminbasen in der kleinen Nut der DNA. Wenn gebunden, absorbiert der DAPI-DNA-Komplex UV-Licht und emittiert sichtbares blaues Licht.

Als Nächstes fügen Sie ein Anti-Fade-Konservierungsmittel hinzu, um die Haltbarkeit der Probe zu verlängern. Tragen Sie einen Deckelschlupf auf und versiegeln Sie ihn auf dem Dia. Dann verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit einem blauen Filter, um DAPI-Körper zu visualisieren, die, abhängig von der Zelle und ihrem Zyklusstatus, einzelne Chromosomen, Schwesterchromatidpaare oder ganze Kerne darstellen können. In diesem Experiment zählen wir DAPI-gefärbte Schwesterchromatidpaare in Oozyten, um tetraploide Stämme von Caenorhabditis elegans zu identifizieren.

- Tetraploide Stämme haben 12 Chromosomenpaare, die durch Zählen der DAPI-Gefärbtkörper in unbefruchteten Eizellen validiert werden können. Um dies zu tun, lassen Sie fünf bis zehn Mikroliter M9-Puffer auf einen Dia fallen und übertragen Sie sechs bis zehn vermeintliche Tetraploide in den Tropfen. Unter einem Sezierendes Mikroskop saugen Sie den größten Teil des M9 vorsichtig in ein fusselfreies Reinigungsgewebe auf.

Dann 10 Mikroliter 90% Ethanol auf die Würmer fallen lassen und beobachten, wie das Ethanol vollständig verdampft. Sobald die Verdunstung abgeschlossen ist, wiederholen Sie den Prozess der Zugabe von Ethanol und beobachten Sie, wie es verdunstet. Insgesamt fügen Sie 10 Mikroliter in vier Anwendungen hinzu. Nach dem letzten Tropfen verdampft, fügen Sie sechs Mikroliter DAPI bei zwei Nanogramm pro Mikroliter oder einem ähnlichen Fleck hinzu.

Für die langfristige Lagerung der Dias, montieren Sie die Würmer in einem handelsüblichen oder hausgemachten Anti-Fade. Dann fügen Sie einen Deckelschlupf hinzu und versiegeln Sie die Kanten mit Nagellack. Nachdem der Nagellack getrocknet ist, können die Dias bewertet werden. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop und 100 x Vergrößerung.

Zuerst finden Sie die ausgereifteste unbefruchtete Oozyte, Die DAPI-Körper hier sind vermutlich einzelne Chromosomenpaare. Als nächstes konzentrieren Sie sich auf den Kern der Eizelle und verwenden Sie den feinen Fokus des Mikroskops, um es langsam von oben nach unten zu scannen, während die DAPI-Körper gezählt werden. Dann erzählen Sie die DAPI-Körper im selben Kern, indem Sie den Fokus von unten nach oben verschieben.

Wilde Eizellen haben durchschnittlich sechs DAPI-Körper. Das Vorhandensein von 12 DAPI-Körpern zeigt an, dass die Tiere in diesem Stamm entweder teilweise oder vollständig Tetraploide sind. Analysieren Sie mindestens 10 Tiere pro Stamm. Oft sind Chromosomenpaare sehr nah oder berührend, so dass die Anzahl der DAPI-Körper oft kleiner ist als die tatsächliche Anzahl der Chromosomenpaare.