नेत्र लेंस विच्छेदन: ज़ेब्राफिश लेंस आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए एक तकनीक

Overview

यह वीडियो प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसे वयस्क और लार्वा जेब्राफिश लेंस को विच्छेदन करने के लिए कॉर्टिकल लेंस आकृति विज्ञान और लेंस टांके की संरचनात्मक अखंडता का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है।

Protocol

1. लार्वा और वयस्क जेब्राफिश लेंस का विच्छेदन

1. 6 डीपीएफ लार्वा से मछली को ट्राइकेन के साथ वयस्कता तक जब तक स्पर्श करने के लिए गैर-उत्तरदायी नहीं होता है लेकिन फिर भी एक मजबूत दिल की धड़कन दिखाता है। मंचन के लिए शिलिंग (2002) के अनुसार मछली मानक लंबाई को मापें।
2. माइक्रो-विच्छेदन कैंची का उपयोग करके तुरंत उत्पादित आंखें और पीबीएस में एक विच्छेदन पकवान में रखें (वयस्क आंखों के लिए दिखाया गयाचित्रा 1)।
   1. लेंस विच्छेदन के लिए सिलिकॉन से भरा एक कस्टम 35 मिमी पकवान बनाएं। एक बार सिलिकॉन सेट हो जाने के बाद, विच्छेदन के दौरान वयस्क आंखों/लेंस को स्थिर करने के लिए व्यास में 2-3 मिमी और ०.५ मिमी गहरी के आसपास एक डिवोट उत्पादित करें ।
3. वयस्क जेब्राफिश लेंस का विच्छेदन
   1. पीबीएस से भरे डिश डिवोट पीछे की ओर एक वयस्क आंख रखें। ऑप्टिक डिस्क के माध्यम से &45 ° कोण पर संदंश डालने से आंख को स्थिर करें। निक या लेंस सेक करने के लिए नहीं सावधान रहना। ऑप्टिक डिस्क से सिइलरी जोन में विच्छेदन कैंची के साथ रेटिना और स्क्लेरा के माध्यम से दो या तीन रेडियल चीरे बनाएं।
   2. वापस रेटिना छील और फूल पंखुड़ियों की तरह स्क्लेरा और आंख उलटा, कॉर्निया पक्ष ऊपर । कैंची के सपाट पक्ष के साथ स्क्लेरा और कॉर्निया के हेरफेर के माध्यम से लेंस को अप्रत्यक्ष रूप से स्थिर करें, जबकि रेटिना को दूर करते हैं और संदंश के साथ ऊतकों से जुड़े होते हैं। लेंस से अतिरिक्त ऊतक को सावधानी से ट्रिम करें।
      नोट: लगातार स्वस्थ लेंस प्राप्त करने के लिए सावधानी से विच्छेदन करना महत्वपूर्ण है।
4. लार्वा जेब्राफिश लेंस का विच्छेदन
   1. पीबीएस से भरे सिलिकॉन डिश के सपाट हिस्से पर एक लार्वा आंख के पीछे की ओर रखें और रेटिना और स्क्लेरा के माध्यम से रेडियल कटौती करने के लिए एक तेज टंगस्टन सुई का उपयोग करें, जबकि आंख को एक और टंगस्टन सुई या संदंश के साथ स्थिर करें।
      नोट: लेंस को नुकसान न पहुंचे, इसका ध्यान रखें।
      1. तार की नोक को 10% (w/v) NaOH में निलंबित करके और कम वोल्टेज बारी-धारा14 लागू करके इलेक्ट्रोलाइटिक रूप से 0.1 मिमी टंगस्टन तार की 2 सेमी लंबाई की नोक को तेज करें। बुनसेन बर्नर का उपयोग करके ग्लास एंड को पिघलाकर सुई को पाश्चाप पिपेट में सुरक्षित करें।
         नोट: वैकल्पिक ठीक विच्छेदन उपकरण भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
         सावधानी: नाओएच संक्षारक है।
   2. धीरे-धीरे सुई के कुंद पक्ष के साथ अलग आंख से लेंस बाहर स्कूप, और ध्यान से दूर संलग्न ऊतक खींच।

Representative Results

चित्रा 1: ज़ेब्राफिश लेंस विच्छेदन। (क) आंखों को एनेस्थेटाइज्ड मछली से विच्छेदित किया जाता है और पीछे की ओर (बी) रखा जाता है । (ग) आंखों को ऑप्टिक डिस्क (ओडी) के माध्यम से संदंश द्वारा स्थिर किया जाता है और दो से तीन रेडियल चीरे रेटिना और स्क्लेरा में ऑप्टिक डिस्क से ज़ोन्यूल्स तक किए जाते हैं । (घ) लेंस को प्रकट करने के लिए फ्लैप को फोल्ड करें। (ङ) कॉर्निया का सामना करने के लिए आंख को घुमाएं, कॉर्निया के माध्यम से परोक्ष रूप से लेंस को स्थिर करें और स्क्लेरा-रेटिना को दूर खींचें । (च) लेंस से शेष रेटिना और सिलियरी जोन/ज़ोन्यूल्स को ट्रिम करें

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A