Dissezione delle lenti oculari: una tecnica per osservare la morfologia delle lenti zebrafish

Overview

Questo video descrive il protocollo sviluppato per sezionare lenti zebrafish adulte e larvali per analizzare la morfologia corticale delle lenti e l'integrità strutturale delle suture delle lenti.

Protocol

1. Dissezione di lenti larvali e zebrafish adulte

1. Anestetizza i pesci da 6 larve dpf all'età adulta con tricaina fino a quando non risponde al tatto ma mostra ancora un forte battito cardiaco. Misurare la lunghezza standard del pesce secondo Schilling (2002) per la messa in scena.
2. Asportare immediatamente gli occhi utilizzando forbici a microsezione e posizionare in un piatto di dissezione in PBS (Figura 1 mostrata per gli occhi adulti).
   1. Crea un piatto personalizzato da 35 mm riempito con silicone per le dissezioni delle lenti. Una volta impostato il silicone, asportare un divot di circa 2-3 mm di diametro e 0,5 mm di profondità per immobilizzare gli occhi / lenti degli adulti durante la dissezione.
3. Dissezione di lenti zebrafish adulte
   1. Posizionare un occhio adulto nel piatto divot lato posteriore riempito con PBS. Immobilizzare l'occhio inserendo le forcep con un angolo di <45° attraverso il disco ottico. Fare attenzione a non graffiare o comprimere l'obiettivo. Fare due o tre incisioni radiali attraverso retina e sclera dal disco ottico alla zona ciliaria con forbici di dissezione.
   2. Sbucciare la retina e lo sclera come petali di fiori e invertire l'occhio, lato cornea verso l'alto. Immobilizzare la lente indirettamente attraverso la manipolazione della sclera e della cornea con il lato piatto delle forbici, mentre si tira via la retina e i tessuti attaccati con le forcelle. Tagliare con cura il tessuto in eccesso dall'obiettivo.
      NOTA: È fondamentale sezionare attentamente per ottenere lenti costantemente sane.
4. Dissezione delle lenti larvali zebrafish
   1. Posizionare un lato posteriore dell'occhio larvale sulla parte piatta della piastra di silicone piena di PBS e utilizzare un ago di tungsteno affilato per effettuare tagli radiali attraverso la retina e lo sclera immobilizzando l'occhio con un altro ago di tungsteno o pinza.
      NOTA: Fare attenzione a non danneggiare l'obiettivo.
      1. Affilare elettroliticamente la punta di un filo di tungsteno di 2 cm di filo di tungsteno da 0,1 mm sospendendo la punta del filo in NaOH al 10% (w/v) e applicando una corrente alternata a bassa tensione14. Fissare l'ago in una pipetta Pasteur sciogliendo l'estremità del vetro utilizzando un bruciatore Bunsen.
         NOTA: È inoltre possibile utilizzare strumenti alternativi di dissezione fine.
         ATTENZIONE: NaOH è corrosivo.
   2. Estrarre delicatamente l'obiettivo dall'occhio dissociato con un lato smussato dell'ago e tirare via con cura il tessuto attaccato.

Representative Results

Figura 1: Dissezione delle lenti Zebrafish. (A) Gli occhi sono sezionati da pesci anestetizzati e posizionati sul lato posteriore verso l'alto (B). (C) Gli occhi sono immobilizzati da force attraverso il disco ottico (od) e due o tre incisioni radiali sono fatte in retina e sclera dal disco ottico agli zonuli. (D) Piegare i lembi per rivelare l'obiettivo. (E) Ruotare l'occhio per affrontare cornea verso l'alto, immobilizzare l'obiettivo indirettamente attraverso la cornea e tirare via la sclera-retina. (F) Tagliare via la retina rimanente e la zona ciliaria/zonules dall'obiettivo

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A