Dissection des lentilles oculaires : une technique pour observer la morphologie des lentilles zebrafish

Overview

Cette vidéo décrit le protocole qui est développé pour disséquer les lentilles de poisson zèbre adulte et larvaire pour analyser la morphologie corticale des lentilles et l’intégrité structurelle des sutures de lentilles.

Protocol

1. Dissection des lentilles de poisson zèbre larvaire et adulte

1. Anesthésier les poissons de 6 larves de dpf à l’âge adulte avec de la tricaine jusqu’à ce qu’ils ne soient pas sensibles au toucher, mais qu’ils affichent tout de même un rythme cardiaque fort. Mesurer la longueur standard des poissons selon Schilling (2002) pour la mise en scène.
2. Excisez immédiatement les yeux à l’aide de ciseaux de micro-dissection et placez-les dans un plat de dissection dans PBS (figure 1 montrée pour les yeux adultes).
   1. Faire un plat personnalisé de 35 mm rempli de silicone pour les dissections de lentilles. Une fois que le silicone a réglé, exciser un divot d’environ 2-3 mm de diamètre et 0,5 mm de profondeur pour immobiliser les yeux adultes / lentilles pendant la dissection.
3. Dissection des lentilles adultes de poisson zèbre
   1. Placez un œil adulte dans le plat divot côté postérieur rempli de PBS. Immobiliser l’œil en insérant des forceps à l’angle de 45 ° à travers le disque optique. Veillez à ne pas entailler ou compresser l’objectif. Faire deux ou trois incisions radiales à travers la rétine et la sclère du disque optique à la zone ciliaire avec des ciseaux de dissection.
   2. Peler la rétine et la sclère comme des pétales de fleurs et inverser l’œil, côté cornée vers le haut. Immobiliser indirectement la lentille par manipulation de la sclère et de la cornée avec le côté plat des ciseaux, tout en retirant la rétine et les tissus attachés avec des forceps. Coupez soigneusement l’excès de tissu de la lentille.
      REMARQUE: Il est essentiel de disséquer soigneusement pour obtenir des lentilles toujours saines.
4. Dissection des lentilles larvaire de poisson zèbre
   1. Placez un côté larvaire postérieur des yeux vers le haut sur la partie plate du plat en silicone rempli de PBS et utilisez une aiguille de tungstène aiguisée pour faire des coupures radiales à travers la rétine et la sclère tout en immobilisant l’œil avec une autre aiguille de tungstène ou des forceps.
      REMARQUE: Veillez à ne pas endommager la lentille.
      1. Aiguiser la pointe d’une longueur de 2 cm de 0,1 mm de fil de tungstène électrolytiquement en suspendant la pointe du fil en 10% (w/v) NaOH et en appliquant un courant alternatif à basse tension14. Fixez l’aiguille dans une pipette Pasteur en faisant fondre l’extrémité en verre à l’aide d’un brûleur Bunsen.
         REMARQUE: D’autres outils de dissection fine peuvent également être utilisés.
         MISE EN GARDE: NaOH est corrosif.
   2. Retirez doucement la lentille de l’œil dissocié avec un côté émoussé de l’aiguille, et retirez soigneusement les tissus attachés.

Representative Results

Figure 1 : Dissection des lentilles zebrafish. (A) Les yeux sont disséqués à partir de poissons anesthésiés et placés côté postérieur vers le haut (B). (C) Les yeux sont immobilisés par des forceps via le disque optique (od) et deux à trois incisions radiales sont faites dans la rétine et la sclère du disque optique aux zonules. (D) Pliez les volets pour révéler l’objectif. (E) Faire pivoter l’œil pour faire face à la cornée vers le haut, immobiliser la lentille indirectement par l’intermédiaire de la cornée et retirer la sclérienne-rétine. (F) Couper le reste de la rétine et de la zone ciliaire/zonules de la lentille

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A