Disección de lentes oculares: una técnica para observar la morfología de las lentes de pez cebra

Overview

Este video describe el protocolo que se desarrolla para diseccionar lentes de pez cebra adultos y larvarios para analizar la morfología de las lentes corticales y la integridad estructural de las suturas de la lente.

Protocol

1. Disección de lentes de pez cebra larvarias y adultas

1. Anestesia peces de larvas de 6 dpf a la edad adulta con tricarina hasta que no responden al tacto, pero todavía muestran un latido del corazón fuerte. Mida la longitud estándar del pescado según Schilling (2002) para la puesta en escena.
2. Excisa inmediatamente los ojos usando tijeras de micro-disección y colóquelas en un plato de disección en PBS (Figura 1 que se muestra para los ojos adultos).
   1. Haga un plato personalizado de 35 mm lleno de silicona para disecciones de lentes. Una vez que la silicona se ha ajustado, excitar un divot de alrededor de 2-3 mm de diámetro y 0,5 mm de profundidad para inmovilizar los ojos/lentes adultos durante la disección.
3. Disección de lentes de pez cebra adultos
   1. Coloque un ojo adulto en el lado posterior del plato divot lleno de PBS. Inmovilice el ojo insertando fórceps en un ángulo de <45° a través del disco óptico. Tenga cuidado de no cortar o comprimir la lente. Realice dos o tres incisiones radiales a través de retina y escleras desde el disco óptico hasta la zona ciciliaria con tijeras de disección.
   2. Pelar la retina y las escleras como pétalos de flores e invertir el ojo, lado de córnea hacia arriba. Inmovilizar la lente indirectamente a través de la manipulación de la esclerótica y córnea con el lado plano de las tijeras, mientras tira de la retina y los tejidos unidos con fórceps. Recorte cuidadosamente el exceso de tejido de la lente.
      NOTA: Es vital diseccionar cuidadosamente para obtener lentes consistentemente saludables.
4. Disección de lentes larvarias de pez cebra
   1. Coloque un lado posterior del ojo larvario en la parte plana de la silicona llena de PBS y use una aguja de tungsteno afilada para hacer cortes radiales a través de la retina y la esclerótica mientras inmoviliza el ojo con otra aguja o fórceps de tungsteno.
      NOTA: Tenga cuidado de no dañar la lente.
      1. Agudizar la punta de una longitud de 2 cm de alambre de tungsteno de 0,1 mm electrolíticamente suspendiendo la punta del cable en 10% (w/v) NaOH y aplicando una corriente alterna de baja tensión14. Asegure la aguja en una pipeta Pasteur derritiendo el extremo de vidrio usando un quemador Bunsen.
         NOTA: También se pueden utilizar herramientas alternativas de disección fina.
         PRECAUCIÓN: NaOH es corrosivo.
   2. Saque suavemente la lente del ojo disociado con un lado contundente de la aguja y tire cuidadosamente del tejido unido.

Representative Results

Figura 1: Disección de lentes de pez cebra. (A) Los ojos se diseccionan de los peces anestesiados y se colocan hacia arriba (B). (C) Los ojos son inmovilizados por fórceps a través del disco óptico (od) y dos o tres incisiones radiales se hacen en retina y esclerótica desde el disco óptico hasta las zonules. (D) Doble las solapas para revelar la lente. (E) Gire el ojo a cara la córnea hacia arriba, inmovilice la lente indirectamente a través de la córnea y tire de la esclera-retina. (F) Recortar la retina restante y la zona ciliaria /zonules de la lente

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A