Eye Lens Dissektion: En teknik til at observere Zebrafish Lens Morfologi

Overview

Denne video beskriver den protokol, som er udviklet til at dissekere voksne og larve zebrafisk linser til at analysere kortikale linse morfologi og strukturelle integritet linse suturer.

Protocol

1. Dissektion af larve og voksne zebrafisk linser

1. Bedøve fisk fra 6 dpf larver til voksenalderen med tricaine indtil ikke-lydhør over for berøring, men stadig viser et stærkt hjerteslag. Mål fiskens standardlængde i henhold til Schilling (2002) til iscenesættelse.
2. Straks punktafgift øjne ved hjælp af mikro-dissektion saks og sted i en dissektion parabol i PBS (Figur 1 vist for voksne øjne).
   1. Lav en brugerdefineret 35 mm skål fyldt med silikone til linsedissektioner. Når silikone har sat, punktafgifter en divot omkring 2-3 mm i diameter og 0,5 mm dyb for immobilisering voksne øjne / linser under dissektion.
3. Dissektion af voksne zebrafisk linser
   1. Placer en voksen øje i fadet divot posterior side op fyldt med PBS. Immobiliser øjet ved at indsætte tang i <45°-vinkel gennem optisk disk. Pas på ikke at nick eller komprimere linsen. Lav to eller tre radiale snit gennem nethinden og sclera fra den optiske skive til ciliary zone med dissektion saks.
   2. Skræl nethinden og sclera som blomsterblade og vende øjet, hornhinden side op. Immobilisere linsen indirekte via manipulation af sclera og hornhinden med den flade side af saksen, mens du trækker væk nethinden og fastgjort væv med pincet. Trim forsigtigt overskydende væv fra linsen.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at dissekere omhyggeligt for at opnå konsekvent sunde linser.
4. Dissektion af larve zebrafisk linser
   1. Placer en larve øje bageste side op på den flade del af silikone parabol fyldt med PBS og bruge en skærpet wolfram nål til at gøre radiale nedskæringer gennem nethinden og sclera mens immobilisere øjet med en anden wolfram nål eller pincet.
      BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige linsen.
      1. Spidsen af en længde på 2 cm på 0,1 mm wolframtråd skærpes elektrolytisk ved at indstille trådspidsen til 10% (w/v) NaOH og anvende en lavspændings vekselstrøm14. Fastgør nålen i en Pasteur pipette ved at smelte glasenden ved hjælp af en Bunsen-brænder.
         BEMÆRK: Alternative fine dissektion værktøjer kan også bruges.
         ADVARSEL: NaOH er ætsende.
   2. Scoop forsigtigt linsen ud af det dissociated øje med en stump side af nålen, og træk forsigtigt det vedhæftede væv væk.

Representative Results

Figur 1: Zebrafisk linse dissektion. (A) Øjne dissekeres fra bedøvet fisk og placeres bageste side op (B). (C) Øjne immobiliseres af pincet via den optiske skive (od), og to til tre radiale snit er lavet i nethinden og sclera fra den optiske skive til zonules. (D) Fold klapperne ud for at afsløre linsen. (E) Roter øjet til ansigt hornhinden op, immobilisere linsen indirekte via hornhinden og trække væk sclera-nethinden. (F) Trim væk resterende nethinden og ciliary zone / zonules fra linsen

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A