Ögonlins dissekering: En teknik för att observera zebrafisklins morfologi

Overview

Denna video beskriver protokollet som är utvecklat för att dissekera vuxna och larv zebrafisk linser för att analysera när lins morfologi och strukturell integritet av lins suturer.

Protocol

1. Dissekering av larv- och vuxna zebrafisklinser

1. Söv fisk från 6 dpf larver till vuxen ålder med trikain tills den inte svarar för beröring men visar fortfarande ett starkt hjärtslag. Mät fiskens standardlängd enligt Schilling (2002) för iscensättning.
2. Ta omedelbart bort ögonen med hjälp av mikrodesektionssax och placera den i en dissekeringsform i PBS (Figur 1 visas för vuxna ögon).
   1. Gör en anpassad 35 mm skål fylld med silikon för lins dissekeringar. När silikonet har satts, punktskatt en divot runt 2-3 mm i diameter och 0,5 mm djup för immobilisering av vuxna ögon / linser under dissekering.
3. Dissekering av vuxna zebrafisklinser
   1. Placera ett vuxenöga i skålen divot bakre sidan upp fylld med PBS. Immobilisera ögat genom att föra in tång i <45°-vinkel genom den optiska skivan. Var försiktig så att du inte hackar eller komprimerar objektivet. Gör två eller tre radiella snitt genom näthinnan och sclera från optikskivan till ciliaryzonen med dissekeringssax.
   2. Skala tillbaka näthinnan och skleran som blomblad och vänd ögat, hornhinnans sida upp. Immobilisera linsen indirekt genom manipulering av sclera och hornhinna med saxens plana sida, samtidigt som du drar bort näthinnan och fäst vävnader med tång. Trimma försiktigt överflödig vävnad från linsen.
      OBS: Det är viktigt att dissekera noggrant för att få konsekvent friska linser.
4. Dissekering av larv zebrafisklinser
   1. Placera ett larvöga bakre sidan upp på den plana delen av silikonformen fylld med PBS och använd en vässad volframnål för att göra radiella snitt genom näthinnan och sclera samtidigt som du immobiliserar ögat med en annan volframnål eller tång.
      OBS: Var försiktig så att linsen inte skadas.
      1. Slipa spetsen på en 2 cm lång 0,1 mm volframtråd elektrolytiskt genom att suspendera trådspetsen i 10% (w/v) NaOH och applicera en lågspänningsväxande ström14. Fäst nålen i en Pasteur-pipett genom att smälta glasets ände med en Bunsenbrännare.
         OBS: Alternativa fina dissektionsverktyg kan också användas.
         VARNING: NaOH är frätande.
   2. Skopa försiktigt ut objektivet från det dissocierade ögat med en trubbig sida av nålen och dra försiktigt bort fastsatt vävnad.

Representative Results

Figur 1: Dissekering av zebrafisklinser. A) Ögonen dissekeras från bedövad fisk och placeras bakre sida upp (B). c) Ögonen immobiliseras med tång via optikskivan (od) och två till tre radiella snitt görs i näthinnan och skleran från optikskivan till zonulerna. (D) Vik ut klaffarna för att visa objektivet. (E) Vrid ögat mot hornhinnan uppåt, immobilisera linsen indirekt via hornhinnan och dra bort sklera-näthinnan. f) Trimma bort återstående näthinna och ciliary zone/zonules från linsen

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A