Ooglensdissectie: een techniek om zebravislensmorfologie te observeren

Overview

Deze video beschrijft het protocol dat is ontwikkeld om volwassen en larvale zebravislenzen te ontleden om corticale lensmorfologie en structurele integriteit van de lens hechtingen te analyseren.

Protocol

1. Dissectie van larvale en volwassen zebravislenzen

1. Verdoof vissen van 6 dpf larven tot volwassenheid met tricaine tot niet-responsief om aan te raken, maar vertoont nog steeds een sterke hartslag. Meet de standaardlengte van vissen volgens Schilling (2002) voor enscenering.
2. Verwijder onmiddellijk de ogen met behulp van een microdissectieschaar en plaats deze in een dissectieschaal in PBS (figuur 1 voor volwassen ogen).
   1. Maak een aangepaste 35 mm schotel gevuld met siliconen voor lensdissecties. Zodra siliconen zijn ingesteld, accijns een divot rond 2-3 mm in diameter en 0,5 mm diep voor het immobiliseren van volwassen ogen / lenzen tijdens dissectie.
3. Dissectie van volwassen zebravislenzen
   1. Plaats een volwassen oog in de schotel divot posterior kant omhoog gevuld met PBS. Immobiliseer het oog door de tang onder een hoek van <45° door de optische schijf te steken. Zorg ervoor dat u de lens niet in- of samendrukt. Maak twee of drie radiale incisies via het netvlies en sclera van de optische schijf naar de ciliaire zone met een dissectieschaar.
   2. Pel het netvlies en de sclera terug zoals bloemblaadjes en keer het oog, hoornvlies naar boven. Immobiliseer de lens indirect door manipulatie van de sclera en het hoornvlies met de platte kant van de schaar, terwijl u het netvlies en de bevestigde weefsels met een tang wegtrekt. Knip overtollig weefsel voorzichtig uit de lens.
      OPMERKING: Het is van vitaal belang om zorgvuldig te ontleden om consistent gezonde lenzen te verkrijgen.
4. Dissectie van larvale zebravislenzen
   1. Plaats een larvale oogposter naar boven op het platte deel van de siliconenschaal gevuld met PBS en gebruik een geslepen wolfraamnaald om radiale sneden door het netvlies en de sclera te maken terwijl u het oog immobiliseert met een andere wolfraamnaald of tang.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de lens niet beschadigt.
      1. Slijp de punt van een lengte van 2 cm van 0,1 mm wolfraamdraad elektrolytisch door de draadpunt in 10% (w/v) NaOH te schorten en een laagspannings wisselstroom toe te passen14. Bevestig de naald in een Pasteur pipet door het glazen uiteinde te smelten met een Bunsen brander.
         OPMERKING: Er kunnen ook alternatieve fijne dissectiegereedschappen worden gebruikt.
         LET OP: NaOH is corrosief.
   2. Schep de lens voorzichtig uit het gedissocieerde oog met een stompe kant van de naald en trek het vastgemaakte weefsel voorzichtig weg.

Representative Results

Figuur 1: Zebravis lens dissectie. (A) Ogen worden ontleed van verdoofde vissen en achterste zijde naar boven geplaatst (B). (C) De ogen worden geïmmobiliseerd door een tang via de optische schijf (od) en twee tot drie radiale incisies worden gemaakt in het netvlies en sclera van de optische schijf naar de zonules. (D) Vouw de flappen uit om de lens te onthullen. (E) Draai het oog naar het hoornvlies omhoog, immobiliseer de lens indirect via het hoornvlies en trek het sclera-netvlies weg. (F) Verwijder de resterende retina- en ciliaire zone/zonules van de lens

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A