Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

Summary

מאמר זה מתאר גישה microdissect הרשתיות דג הזברה עם ובלי אפיתל הפיגמנט ברשתית מחוברת, 1-3 עוברים ימים postfertilization.

Abstract

דג הזברה הוא מודל החיה פופולרי למחקר על התפתחות העין בגלל המהירה שלה

Protocol

חלק 1: הכנות לפני microdissection

1. פתרונות
   1. E3 בינוני ⁴ (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl ₂ ו - 0.33 mM MgSO _4).
   2. הפתרון של הצלצול ^{1, 5} (116 mM NaCl, KCl mM 2.9, 1.8 מ"מ CaCl _2, 5 HEPES מ"מ, pH7.2), מסנן מעוקרים.
   3. 5N NaOH.
2. כימית תחריט של מחטים טונגסטן
   1. Secure כוס קטן המכיל 5N NaOH על צלחת פטרי על ידי חימר.
   2. צרף מהדק נייר בצד של הכוס, כך הוא בא במגע עם הפתרון NaOH.
   3. חבר את האלקטרודה השלילית של אספקת מתח DC קליפ הנייר אלקטרודה חיובית בקצה אחד של קטע קצר (~ 2cm) של תיל טונגסטן.
   4. עוטפים את הקצה השני של החוט טונגסטן עם כדור חימר קטנים לטבול זה סוף לתוך הפתרון NaOH.
   5. הגדלת מתח 3V כ וטובלים את החוט למעלה ולמטה הפתרון NaOH עד שיעור תחריט טוב מושגת. מחט באיכות טובה בדרך כלל ניתן חקוק 10 דקות.
   6. תיל טונגסטן חשופים פתרון יהפוך בהדרגה רזה. כאשר כדור חימר נושר, הצד השני של הקו כי הוא עדיין מחובר האלקטרודה החיובית תהיה צורה מחט חדה.
   7. יש לשטוף את המחט חדה עם הפתרון של רינגר או E3 להסיר הפקדות מלח.
   8. צרף את המחט אל המוליך עץ על ידי קלטת או בעל מחט לטיפול קל.
3. תרבות צלחות
   1. פלקון 60 x 15 מ"מ לוחות קלקר תרבות מוכנים לשימוש עבור microdissection הרשתית.
   2. בשביל לנתח הרשתית המצורפת הרשתית, למעוך שני עוברים לחלוטין צלחת תרבות המכיל פתרון של רינגר להיפטר דביקות של המשטח 30 דקות לפני החיתוך. זמן קצר לפני הניתוח, לשטוף את הצלחת נרחב עם פתרון Ringer של טרי.
4. עוברים אוסף ובימוי
   1. דג הזברה למבוגרים נשמרים כפי שתואר ^{4, 5.}
   2. הפרד את הדגים הורה טנקים רבייה סטטי pairwise על ידי מחיצה בלילה שלפני הרבייה.
   3. הסר את המחיצה אחרי האור בחדר מופעלת למחרת בבוקר. לאפשר להורים לעבור אל במרווחים של 10 דקות כל חצי שעה. הפרד את הדג לאחר חציית כל אחד.
   4. שמירה על העוברים במעבר שנאספו כל מדיום E3 בנפרד 28 ° C.
   5. שלב בו עוברים הפריה שעות 10-12 פוסט (hpf) ו restage מיד לפני לנתיחה בנקודות זמן מסוימות, על פי הקריטריונים שנקבעו ^{1, 6.}

חלק 2: Dissection - הסרת המוח חשיפה עין ¹

• ההליכים המתוארים בסעיף זה נפוצים לנתח הרשתית (חלק 3A) ו הרשתית המצורפת הרשתית (חלק 3B).
• והניתוחים כל קנס נעשים על ידי קצה של מלקחיים דומון ובסיוע זוג נוסף של דומון מלקחיים עבור מיקום הרקמה. מחט כימי חרוט טונגסטן יכולה לשמש מניפולציות עדין במידת הצורך.
• והניתוחים כל קנס מבוצעות בהגדלה ~ 5-8x תחת מיקרוסקופ אולימפוס SZX16 מצויד אובייקטיבי 1X או שווה ערך.
• שמירה על העוברים בתווך E3 בשנת עליון ספסל החממה ב 28 ° C ליד המיקרוסקופ עבור גישה קלה העובר במהלך לנתיחה.
• שלב המיקרוסקופ הוא חימם עד 28 ° C על ידי צלחת תרמו כדי למזער את ההשפעה של תנודות הטמפרטורה על ביטוי גנים.

1. העברת עובר בשלב התפתחותי מסוים לפתרון של רינגר ב 60 פלקון X צלחת 15 מ"מ תרבות מוכנים כמתואר חלק 1 # 3.
2. חותכים את הראש עם החלק הקדמי של תא המטען במהירות מהגוף.
3. הצמד את הקצה האחורי של רקמה זו על הצלחת תרבות עם מלקחיים סיוע.
4. פתח את הראש בצד הגבי החל המצח הקדמי.
5. הסר את המוח, כך הצד המדיאלי של העיניים הוא חשוף פונה כלפי מעלה מניפולציות נוספות.

3A חלק: דיסקציה רשתית ¹

1. הכן את העובר כפי שמתואר חלק 2.
2. בזהירות המברשת הרשתית חשוף בצד המדיאלי של כדור העין פונה כלפי מעלה על ידי קצה מלקחיים עד פתח קטן על הרשתית נתפסת.
3. המשך צחצוח ומתקלף פעולה עד הצד המדיאלי של הרשתית כמעט חשוף לכל. הימנע מגרד ניקוב הרשתית חשוף.
4. כדי להסיר את הרשתית לרוחב על הרשתית אשר כעת פונים כלפי מטה, הגישה ולצחצח בזווית של כ -45 מעלות מעל פני צלחת תרבות.
5. הסר את הרשתית המצורף יחסית היטב serrata אורה ידי מצמיד את החלק המנותק של הרשתית אל גצלחת ulture לנתיחה, ואז להרים את הרשתית בעדינות.
6. מגלגלים את הרשתית בתחתית המנה תרבות לנקות את הרשתית שיורית.
   1. יש לנו לב תרבות המסוים הזה פלקון צלחת קלקר יש דבקות מועדף של הרשתית למשך כ 20 דקות פעם עובר הוא כתוש. מאפיין זה מנוצל להסרת שאריות הרשתית. עם זאת, תאים ברשתית לעשות מקל על פני השטח במידה פחותה יותר, אשר יכול להיבדק מקרוב בהגדלה גבוהה. צריך לאזן בין השלמות של הסרת הרשתית שלמות הרשתית.
   2. העדשה לעיתים קרובות שומרת על הצלחת תרבות מתנתק הרשתית במהלך תהליך מתגלגל. לעיתים, יש צורך לנתק את העדשה על ידי מחט טונגסטן חרוט עם פעולה מתערבל על פני העדשה.
7. נהלים אלה מצליח להסיר מן הרשתית הרשתית מבלי להתפשר על שלמות הרקמה. זה מסומן על ידי מורפולוגיה הכולל טוב (איור 1B ו 'ב') היסטולוגיה (איור 1B "), החץ בפרט, שימור תאי המטריצה ​​בין שכבת photoreceptor ואת הרשתית הוא טוב במיוחד (איור 1B."; להשוות עם היסטולוגיה מעובר כולה (איור 1 א ")).

3B חלק: הרשתית המצורפת לנתיחה רשתית ³

1. הכן את העובר כפי שמתואר חלק 2.
2. פין ראש לצלחת התרבות על ידי מלקחיים עוזר. הרם את העין בעדינות מהצד האחורי לרוחב ומגלגלים אל הצד הקדמי.
   1. דמית העין משוערת ורקמות scleral בצד החיצוני של השכבה הרשתית מחוברים בחוזקה יחסית לעור וניתן קלופים בעיקר על ידי גלגול את העין בזהירות בצד הקדמי.
3. מוציאים את העדשה עם מחט טונגסטן אחרי הצד לרוחב של העין חשופה וכאשר העין מחוברת עדיין העור.
4. נהלים אלה מצליח לשמר את השכבה הרשתית כולה עם הרשתית. Choroids משוערת ורקמות scleral ניתן להסיר במידה רבה (איור 1 ג, 'C ו-C ").

חלק 4: דגימת רקמות אוסף לעבודה RNA

1. הדגימות גזור ניתן לאסוף ב TRIzol בצינור RNase ללא microfuge לאפיון הזרם RNA כפי שתואר לפני ^1.

נציג תוצאות

באיור 1. (א) הרוחב (א ') להציג הגבי של ראש הזחל דג הזברה hpf בשעה 52 לפני לנתיחה. (א ') בסעיף היסטולוגית המקביל ראש הזחל ב (א) & (א'). (ב) הרוחב (ב ') להציג הגבי של הרשתית גזור hpf ב 54. פני הרשתית היה שלם משני צדדי ותצוגות הגבי. (ב ') סעיף היסטולוגית המקביל של הרשתית גזור ב (ב) & (ב'). מבנה הרשתית למינציה רשתית היה שלם. בפרט, מטריקס בין תאי השכבה ואת הרשתית קולטי האור (A ", חיצים) השתמרה היטב ברשתית גזור (B", חיצים). (ג) הרוחב (ג') להציג המדיאלי של הרשתית הרשתית המצורפת גזור hpf ב 52. הרשתית היא שכבה שלם ורצוף, אשר הצביעו גם על ידי בסעיף היסטולוגית של הרקמה גזור (C "). אזור לבן" C הוא עצב הראייה (חץ). לבדיקת רקמות, דגימות רקמה נאספו קבוע 4% paraformaldehyde. פלסטיק הטבעה וכן חתך של דגימות אלה בוצעו כמתואר ^3. בר סולם = 50 מיקרומטר.

Discussion

Microdissection של רקמות דג הזברה עין יכול למעשה לקבל הרשתיות שלם הרשתית המצורפת הרשתיות. זו מסייעת באופן משמעותי מחקרים ביטוי הנוגעים רקמת עין ספציפיים (כלומר הרשתית הרשתית או). למעשה, יש לנו מנוצל בהצלחה הליכים אלה להשיג פרופילים ביטוי RNA של הרשתית כולה ¹ ו ³ הרשתית. השירות של פרופילים אלה נתמכת במידה רבה על ידי זיהוי האחרונות שלנו מסלולים למשפחות הגן, כי הם מודאגים ב בידול רשתית מוטציה ^2. השלבים הקריטיים ביותר בהליכים לנתיחה הרשתית הם פעולה צחצוח על ידי קצה של מלקחיים ורקמות מתגלגל להסרת שאריות הרשתית. אנו מוצאים לשים את המרפקים על זרוע מתכווננת נשענת על כיסא במהלך דיסקציה יכולה משמעותי לייצב את תנועות ידיים לא רצויות. כמו כן, כמה שרידים הרשתית עשוי להישאר serrata אורה. הסיבה לכך היא כי באזור זה לא יכול לבוא במגע עם פני דבקות הצלחת תרבות לנתיחה. עם זאת, תאים הרשתית ביותר הם שיבשו במהלך פעולה צחצוח לקלף את אלה שרידי הרשתית צפויים להיות שלם. כמו כן, צריך להיות איזון בין שלמות פגע ברשתית ואת השלמות של הסרת הרשתית. בשביל לנתח הרשתית המצורפת הרשתית, רוב דמית העין משוערת ורקמות scleral שנראים כמו קרום דק ושקוף, יכול להיות קילף יחד עם העור. אפשר גם להסיר את השרידים הללו על ידי צחצוח פני השטח של הרקמה, אולם מאזן צריך להיות גם פגעה בין שלמות הרשתית ואת השלמות של זיהום הסרת רקמות. ביצענו בהצלחה לנתיחה מ DPF 1-3 (24-72 hpf), אשר מכסים בשלבים קריטיים של המורפוגנזה עין דג הזברה ^7. בחודש ממוצע זה ייקח בערך 10 עד 20 דקות מ וכרת את הראש לאוסף של הרקמות גזור. בעזרת תרגול, סטודנט יכול לבצע דיסקציה טובה ועקבית תוך חודש.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cordless pestle motor	VWR international	47747-370
DC power supply	Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)	VWR international	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox	Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm	BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope	Olympus Corporation	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL	Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
Wooden Applicator	Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.