PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN

Summary

Transcripciones de ARN están sujetas a numerosas normas posttranscriptional que está mediada por una multitud de trans-acción ARN-proteínas de unión (prácticas comerciales restrictivas). Aquí presentamos un método generalizable para identificar con precisión y en una escala de transcriptoma en todo los sitios de unión a ARN de las prácticas comerciales restrictivas.

Abstract

Transcripciones de ARN que son objeto de regulación post-transcripcional de genes interactuando con cientos de proteínas de unión a ARN (las prácticas comerciales restrictivas) y microRNA que contienen complejos de ribonucleoproteína (miRNPs) que se expresan a menudo en una celda de tipo dependiente. Para entender cómo la interacción de estos factores de unión al ARN afecta a la regulación de las transcripciones individuales, mapas de alta resolución en vivo de las interacciones proteína-ARN son necesarios ^1.

Una combinación de métodos genéticos, bioquímicos y de cálculo se aplican normalmente para identificar las prácticas comerciales restrictivas o ARN interacciones RNA-RNP. Microarrays de perfiles de ARN asociada a las prácticas comerciales restrictivas inmunopurificados (RIP-Chip) ² define los objetivos a nivel del transcriptoma, pero su aplicación se limita a la caracterización de las interacciones cinéticamente estable y sólo en casos raros ^3,4 permite identificar el elemento de reconocimiento de las prácticas comerciales restrictivas (RRE ) dentro de la meta de ARN de largo. Objetivo más directo RBP información del sitio se obtiene mediante la combinación de reticulación UV vivo con ^5,6 inmunoprecipitación ^7-9 seguido por el aislamiento de reticulado segmentos de ARN y secuenciación de cDNA (CLIP) ^10. El vídeo fue utilizado para identificar los objetivos de una serie de prácticas comerciales restrictivas ^11-17. Sin embargo, CLIP está limitada por la baja eficiencia de la radiación UV 254 nm ARN-proteína entrecruzamiento, y la ubicación de la reticulación no es fácilmente identificable dentro de los fragmentos secuenciados reticulado, por lo que es difícil separar objetivo UV reticulado segmentos de ARN de fondo no reticulado fragmentos de ARN también está presente en la muestra.

Hemos desarrollado un poderoso celular enfoque basado en los enlaces cruzados para determinar con alta resolución y transcriptoma en todo los sitios de unión de las prácticas comerciales restrictivas celular y miRNPs que llamamos PAR-Clip (fotoactivables-ribonucleósido-Enhanced entrecruzamiento e inmunoprecipitación) (ver fig. 1A de un esquema del método). El método se basa en la incorporación de los análogos de ribonucleósido fotorreactivos, tal como 4-thiouridine (4-SU) y 6-thioguanosine (6-SG) en el naciente transcripciones de ARN de las células vivas. La irradiación de las células por la luz UV de 365 nm induce reticulación eficiente de fotorreactivos etiquetados nucleósidos ARN celular a las prácticas comerciales restrictivas que interactúan. Inmunoprecipitación de las prácticas comerciales restrictivas de interés es seguido por el aislamiento del ARN reticulado y coinmunoprecipitó. El ARN aislado se convierte en una biblioteca de cDNA y la secuencia de profundidad utilizando la tecnología Solexa. Un rasgo característico de las bibliotecas de cDNA preparado por PAR-Clip es que la posición precisa de entrecruzamiento puede ser identificado por las mutaciones que residían en la secuencia de cDNA. Cuando se utiliza 4-SU, secuencias reticulado timidina a la transición citidina, mientras que con 6-SG resultados de guanosina a la adenosina mutaciones. La presencia de las mutaciones en las secuencias de reticulado permite separarlos de los antecedentes de las secuencias derivadas de abundantes ARN celular.

La aplicación del método a una serie de diversas proteínas de unión a ARN se informó en Hafner et al. ¹⁸

Protocol

El protocolo se describe el procedimiento PAR-clip para HEK293 células que expresan FLAG / HA-etiquetados IGF2BP1 a la inducción con doxiciclina. Vamos a utilizar un anticuerpo anti-FLAG de inmunoprecipitación.

PAR-clip funciona con cualquier línea celular que expresa niveles detectables de la endógena, sin etiquetar las proteínas de unión a ARN (RBP) de interés si un anticuerpo eficaz para la inmunoprecipitación está disponible.

Las células en expansión

1. Ampliar FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 células en un medio de crecimiento. Se recomienda utilizar entre 100 a 400 x 10 ⁶ células (aprox. 10 a 40 15 cm placas de cultivo celular) como punto de partida. Creciendo a una confluencia de aproximadamente el 80%.
2. 14 h antes de añadir un entrecruzamiento) 4-thiouridine a una concentración final de 100 mM (1:1000 v / v de M 1 4-thiouridine solución madre) directamente en el medio de cultivo celular y b) inducir la expresión de la Bandera / HA etiquetados IGF2BP1 mediante la adición de 1 mg / ml de doxiciclina (1:10.000 v / v de 10 mg / ml de solución de doxiciclina). NOTA: en lugar de 4-tiouridina también se puede utilizar 100 mM de 6-thioguanosine.

UV-entrecruzamiento

1. Lave las células una vez con 10 ml de helado de PBS por placa y eliminar por completo PBS.
2. Coloque las placas en una bandeja con hielo y descubierto irradian con luz nm 0,15 J / cm ² de 365 UV en un Stratalinker 2400 (Stratagene) o dispositivo similar.
3. Raspar las células con una goma de policía en 1 ml de PBS por placa, la transferencia de tubos de 50 ml centrifugación y recoger por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante. 100 x 10 ⁶ células HEK293 (10 15 placas cm) rendirá aproximadamente. 1 ml de celda húmeda de pellets.
4. (Opcional) A menos que usted desea continuar directamente con la lisis celular, descarga congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Gránulos de las células se pueden almacenar durante al menos 12 meses.

Lisis celular y digerir RNaseT1

1. Toma sedimento celular de las células reticuladas en 3 volúmenes de tampón de lisis 1x NP40 e incubar en hielo durante 10 minutos.
2. Lisado de células claras por centrifugación a 13.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
3. Borrar el lisado más filtrándola a través de un filtro de 0,2 micras jeringa membrana (Acrodisc de Pall o equivalente).
4. Añadir RNasa T1 (Fermentas, 10.000 U / l) a una concentración final de 1 U / l, y se incuban en un baño de agua durante 15 minutos a 22 ° C. Fría reacción después de 5 min en hielo antes de proceder.

Inmunoprecipitación y la recuperación de reticulado objetivo fragmentos de ARN

Usando el separador magnético

Siga estas pautas a través de la preparación de la muestra para evitar que las cuentas magnéticas que se sequen.

1. Coloque el tubo que contiene las cuentas en el soporte magnético de 1 2 minutos.
2. Añadir la solución tampón en el tubo, mientras que el tubo está en el separador magnético.
3. Tapar el tubo, retírelo del separador magnético, y volver a suspender las bolas. Puede volver a suspender las cuentas de prender el tubo con el dedo o el uso de un vórtice del 5 6.
4. Centrifugar brevemente para recoger los granos que pueden permanecer en la tapa del tubo.
5. Repita los pasos 1 a 4 según sea necesario.

Preparación de partículas magnéticas

1. Transferencia de 10 l de Dynabeads proteína G partículas magnéticas (Invitrogen) por lisado celular ml (para un experimento típico debe ser de aprox. 40 50 l de bolas) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Lávese las cuentas dos veces con 1 ml de solución tampón de citrato-fosfato.
2. Resuspender en el doble del volumen de tampón de citrato-fosfato en relación con el volumen original de la suspensión de cuentas.
3. Añadir 0,25 g de anti-FLAG anticuerpo monoclonal M2 (Sigma) por cada ml de suspensión y se incuban en una rueda giratoria de 40 min a temperatura ambiente.
4. Lávese las cuentas dos veces en 1 ml de solución tampón de citrato-fosfato para eliminar el anticuerpo no unido.
5. Volver a suspender las cuentas en el doble del volumen de tampón de citrato-fosfato en relación con el volumen original de la suspensión de perlas.

Inmunoprecipitación (IP), en segundo lugar la digestión RNasa T1, y desfosforilación

1. Añadir 20 l de recién preparada anticuerpo conjugado con partículas magnéticas, por ml de lisado parcial RNasa T1 de células tratadas y se incuba en tubos de 15 ml centrifugación en una rueda giratoria de 1 hora a 4 ° C.
2. Recoger partículas magnéticas en un colector de partículas magnéticas de 15 y 50 tubos de centrifugación ml (Invitrogen) y la transferencia a tubos de 1,5 ml de microfuga.
3. Lávese las cuentas 3 veces en 1 ml de solución de lavado IP.
4. Añadir RNaseT1 (Fermentas, 10.000 U / l) a una concentración final de 100 U / l, y se incuba la suspensión de bolas en un baño de agua durante 15 minutos a 22 º C. Cool posteriormente en el hielodurante 5 min.
5. Lávese las cuentas 3 veces en 1 ml de solución de lavado de alta en sal.
6. Cuentas de volver a suspender en un volumen de tampón desfosforilación
7. Añadir la pantorrilla intestinal fosfatasa alcalina (CIAP, NEB) a una concentración final de 0,5 U / l, y se incuba la suspensión durante 10 minutos a 37 ° C.
8. Lávese las cuentas dos veces en 1 ml de solución de lavado fosfatasa
9. Lávese las cuentas dos veces en la polinucleótido quinasa (PNK) de amortiguación sin TDT (la concentración de la TDT es necesario para la reacción enzimática es lo suficientemente alta como para dañar los granos magnéticos).
10. Volver a suspender las cuentas de un volumen original de cuentas de PNK buffer

Radiomarcado de segmentos de ARN a las proteínas reticuladas immunoprecipitated

1. A la suspensión de bolas se ha descrito anteriormente, añadir ^Υ-32 P-ATP a una concentración final de 0,5 Ci / mL y T4 PNK (NEB) y 1 U / l en un volumen de grano original. Incubar la suspensión durante 30 minutos a 37 ° C.
2. Añadir ATP no radiactivo para obtener una concentración final de 100 mM e incubar durante otros 5 minutos a 37 ° C.
3. Lavado de los granos magnéticos 5 veces con 800 l de buffer PNK sin TDT.
4. Volver a suspender las bolas en 70 l de tampón de carga SDS-PAGE.

SDS-PAGE y electroelución de reticulado ARN-proteína de rodajas de gel

1. Incubar la suspensión radiomarcado durante 5 minutos en un bloque de calor a 95 ° C para desnaturalizar las prácticas comerciales restrictivas y la liberación de la immunoprecipitated con ARN reticulado y agitar.
2. Eliminar las cuentas en el separador magnético y la transferencia del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 ml.
3. Carga 40 ml del sobrenadante por pocillo de una Novex Bis-Tris 4.12% (Invitrogen) en gel de poliacrilamida prefabricados y correr el gel durante 55 min a 200 V.
4. Desmonte la cámara de gel y desmantelar el gel, dejándola montado en una placa. Para facilitar la alineación del gel de la hoja impresa PhosphorImager, se recomienda la implantación de tres pequeñas piezas de gel radiactivos de forma asimétrica en tres de las cuatro esquinas del gel. Piezas radiactivas gel se pueden recoger a partir de geles que se utilizaban anteriormente para purificar radiomarcado oligonucleótidos sintéticos. Envuelva el gel en la película de plástico (por ejemplo, Saran wrap) para evitar la contaminación.
5. Exponer el gel a una pantalla PhosphorImager blanqueó durante 1 hora y visualizar en un phosphorimager.
6. Alinear el gel en la parte superior de la impresión PhosphorImager con las piezas de gel implantado para la orientación. Cortar las bandas que se corresponden con el tamaño esperado de las prácticas comerciales restrictivas (IGF2BP1, aprox. 75 kDa) y transferir a un tubo de D-Tubo dializador Midi y añadir 800 l 1x buffer SDS funcionamiento.
7. Electroelute el reticulado de ARN-RBP complejo en 1x SDS funcionamiento de amortiguación de 100 V durante 2 h. extirpados de la gelatina y se electroeluye en Midi D-Tubo dializador (Novagen) en 800 l de amortiguación SDS funcionamiento de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Proteinasa K digestión

1. Añadir un volumen igual de tampón de proteinasa K 2 veces con respecto a la electroeluate, seguido por la adición de proteinasa K (Roche) a una concentración final de 1,2 mg / ml. Incubar durante 30 min a 55 ° C.
2. Recuperar el ARN de ácido fenol / cloroformo / extracción de la IAA (25:24:1, pH 4,0), seguido de una extracción con cloroformo. Añadir 1 l de glucógeno (10 mg / ml) precipitar el ARN mediante la adición de 3 volúmenes de etanol. Disolver el precipitado en 10,5 l de agua.

preparación de la biblioteca de cDNA y la secuencia de profundidad

Llevar el ARN recuperado a través de un protocolo estándar de preparación de la biblioteca de cDNA descrito originalmente para la clonación de pequeños ARNs reguladores ^19. El primer paso, la ligadura de 3 'adaptador, se llevó a cabo como se describe en una escala de 20 l con 10,5 l de la ARN recuperado. Utilice el adaptador de juegos Solexa secuenciación descritos. Dependiendo de la cantidad de ARN se recuperó, 5'-adaptador-3'-adaptador de los productos sin insertos pueden ser detectados después de la amplificación del cDNA adicionales como las bandas de PCR. En tales casos, el consumo del producto ya PCR del tamaño esperado de un 3% NuSieve bajo punto de fusión en gel de agarosa, eluir el producto de PCR de las piezas de gel con el kit de GelElute (Qiagen) y la secuencia de uso de la tecnología Solexa. Una secuencia Solexa ejecutar normalmente ofrece entre 6 y 10 millones de secuencia se lee que son suficientes para una cobertura amplia del transcriptoma de los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN.

Bioinformáticas de análisis

Un cuidadoso análisis bioinformático de la secuencia se lee que hay que hacer para obtener puntos de vista significativos en los sitios de unión a ARN para el RBP examinado, como el elemento de reconocimiento de ARN, las regiones preferidas de unión de la RBP ha (exonic vs intrónicas, la secuencia de codificación frente a traducir secuencia). La secuencia se lee necesitan estar alineados en contra de las bases de datos del genoma y EST. Por lo general, el uso lee Mapping única en el genoma con un máximo de un desajuste, inserción o deleción de construir grupos de la secuencia se lee que luego pueden ser analizados. La frecuencia de mutaciones características de la secuencia se lee en clúster, T a las transiciones cuando se utiliza C 4-SU y G para una transición al uso de 6-SG, son indicativos de las secuencias de éxito reticulado. En nuestra experiencia ARN reticulado etiquetados con 4-SU muestran una tasa de mutación de fondo de aproximadamente un 20%. Esta tasa se incrementa hasta aprox. 50-80% en la reticulación.

Una descripción detallada de los análisis bioinformático se puede encontrar en el material complementario de la publicación por Hafner et al. ¹⁸

Pasos opcionales

Determinación de los niveles de incorporación de 4-tiouridina en el ARN total

Aislar el ARN total de la línea celular estable que expresa la RBP de interés después de haber crecido en medio suplementado con 100 mM 4SU 16 h antes de la cosecha. Como control, las células de la cosecha crecido sin adición 4SU. Aislar el ARN total mediante la adición de 3 volúmenes de reactivo Trizol (Sigma) a los gránulos de las células lavadas siguiendo las instrucciones del fabricante s. Además era purificar el ARN total utilizando Qiagen RNeasy de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para evitar la oxidación de 4SU durante el aislamiento de ARN y análisis, añadir 0,1 mM ditiotreitol (TDT) a los búferes de lavado y posterior pasos enzimáticos. Digerir y desfosforilado ARN total a los nucleósidos única para el análisis de HPLC como se describe antes de los ^20. En pocas palabras, en un volumen de 30 l, incubar 40 microgramos de RNA total se purifica por 16 horas a 37 ° C con 0,4 U de fosfatasa alcalina bacteriana (Bioquímica Worthington) y 0,09 U veneno de la serpiente de la fosfodiesterasa (Worthington Biochemical). Como patrón de referencia, utilizar un ARN sintético 4SU marcado, (que de forma estándar el uso CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) y también está sujeto a completar la digestión enzimática. Separar las mezclas resultantes de ribonucleósidos por HPLC en un descubrimiento Supelco C18 (partículas de sílice de fase en régimen de servidumbre M 5, 250 x 4,6 mm) de columna de fase inversa (Bellefonte PA, EE.UU.). Buffers HPLC son de 0,1 M TEAA en el 3% de acetonitrilo (A) y el 90% de acetonitrilo en agua (B). Utilice un gradiente isocrático: 0% de B durante 15 min, 0 a 10% de B durante 20 min, de 10 a 100% B durante 30 min. Aplicar un 5 min 100% B de lavado aplicado entre las corridas de limpiar la columna HPLC.

Resultados representante

Figura 1 (panel derecho) muestra un resultado representativo de un PAR-clip realizado con líneas celulares que expresan FLAG / HA-etiquetados IGF2BP1 con 4-SU y 6 SG-. Tenga en cuenta que la eficiencia de reticulación de 6-SG para IGF2BP1 es menor que la eficiencia de entrecruzamiento de 4-SU. La eficiencia de entrecruzamiento menor resultará en un fondo más alto de las secuencias derivadas de fragmentos de ARN celular abundante y por lo tanto debe tener en cuenta la ampliación de la experiencia al usar nucleósidos fotorreactivos menos eficiente.

El panel izquierdo de la figura 1 muestra una comparación del uso de diferentes análogos de uridina fotorreactivos que podrían ser potencialmente utilizados para PAR-clip en comparación con el tradicional reticulación UV de 254 nm.

La intensidad de la banda radiactiva de la longitud correcta le da una buena idea si el experimento PAR-Clip ha trabajado y se han aislado de ARN suficiente para llevar a cabo un pequeño protocolo de la secuencia de ARN (paso a paso la descripción de la preparación de la pequeña biblioteca de cDNA secuenciación de ARN se pueden encontrar en ^19). La frecuencia de mutaciones características de la secuencia se lee, T a las transiciones cuando se utiliza C 4-SU y G para una transición al uso de 6-SG, son indicativos de las secuencias de éxito reticulado. En nuestra experiencia ARN reticulado etiquetados con 4-SU muestran una tasa de mutación de fondo de aproximadamente un 20%. Esta tasa se incrementa hasta aprox. 50-80% en la reticulación.

Materials

Buffers and reagents

Growth medium HEK293 cells

DMEM 10% FBS 2 mM L-Glutamine 100 U/ml penicillin 100 U/ml streptomycin 100 μg/ml hygromycin 15 μg/ml blasticidin

4-thiouridine stock solution (1 M)

260.27 mg 4-thiouridine 1 ml DMSO

Doxycyclin stock (10 mg/ml)

10 mg doxycyclin 1 ml DMSO

1x NP40 lysis buffer

Prepare a stock of 5x buffer without DTT and protease inhibitors. Add DTT and protease inhibitor directly before the experiment.

50 mM HEPES, pH 7.5 150 mM KCl 2 mM EDTA 1 mM NaF 0.5% (v/v) NP40 0.5 mM DTT complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)

Citrate-Phosphate buffer

4.7 g/l citric acid 9.2 g/l Na2HPO4 pH 5.0

IP-wash buffer

50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 300 mM KCl 0.05% (v/v) NP40 0.5 mM DTT (add directly before experiment) complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before experiment)

High-salt wash buffer

50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 500 mM KCl 0.05% (v/v) NP40 0.5 mM DTT (add directly before the experiment) complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before the experiment)

Dephosphorylation buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.9 100 mM NaCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT

Phosphatase wash buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 20 mM EGTA 0.5% (v/v) NP40

Polynucleotide kinase (PNK) buffer without DTT

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2

PNK buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2 5 mM DTT

SDS PAGE loading buffer

10% glycerol (v/v) 50 mM Tris-HCl, pH 6.8 2 mM EDTA 2% SDS (w/v) 100 mM DTT 0.1% bromophenol blue

2x Proteinase K buffer

100 mM Tris-HCl, pH 7.5 150 mM NaCl 12.5 mM EDTA 2% (w/v) SDS