Summary
Для изучения
Abstract
Рой δ-proteobacterium Myxococcus Ксанф содержит миллионы клеток, которые действуют как коллективные, координации движения через серию сигналов для создания сложных, динамических моделей, как ответ на сигналами окружающей среды. Эти модели самоорганизации и возникающих, они не могут быть предсказаны, наблюдая за поведением отдельных клеток. Использование покадровой микрокиносъемки отслеживания анализа, мы выявили различные возникающие картины в M. Ксанф называется хемотаксис, определяется как направленное движение лазают по питательным градиент к ее источника 1.
Для того, чтобы эффективно характеризуют хемотаксис с помощью покадровой микрокиносъемки, мы разработали пластины высоко модифицируемые комплекса (рис. 1) и построен кластер из 8 микроскопов (рис. 2), каждый из которых способен захватить покадровой видео. Анализ является достаточно строгими, чтобы последовательно репликации количественные данные, и в результате видео позволяют нам наблюдать и отслеживать незначительные изменения в рой поведение. Как только захватили, видео передается анализ / хранения компьютер с достаточным объемом памяти для обработки и хранения тысяч видеороликов. Гибкость этой установки, оказалась полезной для нескольких членов М. Ксанф сообщества.
Protocol
Поставки необходимо:
- Klett метр
- Внесите и советы
- 2,5 мл пробирок микроцентрифужных
- Микроцентрифуга
- CTTYE СМИ:
- 1,0% Casitone (Difco Laboratories), 0,5% дрожжевого экстракта (Difco Laboratories),
- 10,0 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 1,0 мМ KH 2 PO 4, 8,0 мМ MgSO 4
- TPM СМИ:
- 10,0 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 1,0 мМ KH 2 PO 4, 8,0 мМ MgSO 4
- Агароза
- Водяная баня набор до 55 ° C
- Слайды стекло микроскопа
- Большие покровные стекла
- 2 х 2 см, 0,5-мм силиконовой резиновой прокладкой (Grace Bio-Lab Inc)
- Парафильмом (или маркировки ленты)
- Щипцы
- Малый клипы связующего
- Микро-отбор проб пипеткой (Фишер)
- 100 мкл стекла одноразового наконечника (Фишер)
- Kimwipes
Часть 1: Сотовый подготовка
Начните с создания стерильной среде.
- Чистая рабочее пространство, дон перчатки, и легкие горелки.
- Начало ночной культуры клеток путем посева в колбу CTTYE бульоном и инкубируют в темноте при 32 ° С при энергичном закрученной.
- Как только культура достигла плотностью 5 × 10 8 кл / мл, пипетки 1 мл клеток в 2,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Гранул клетки центрифугированием в течение 2 мин при 16000 мкг (или максимальная скорость).
- Декантировать и отбросить супернатант.
- Промыть осадок клеток с 1 мл TPM (соль сбалансированную, питательную, свободных средств массовой информации).
- повторно приостанавливать и вихревые
- Re гранул клетки, крутя в течение 2 мин при 16000 мкг (или максимальная скорость).
- Декантировать и отбросить супернатант.
Важнейшим шагом - Полностью измененный приостановить осадок в 100 мкл среды TPM с помощью комбинации пипетки и вортексе.
ВАЖНО: Этот шаг гарантирует, что Есть нет скопления клеток остается в трубке. Это может занять некоторое время. - Установите в сторону клетки при комнатной температуре при подготовке отслеживания пластины теста.
Часть 2: Подготовка агара
- Подготовка 50 мл и TPM (анализ СМИ) и CTTYE (питательные диск) средства массовой информации.
- Добавить 0,5 г агарозы, чтобы каждый (агарозном меньше, чем дифракционный агар).
- Автоклав для стерилизации.
- После стерилизации, поддерживать средства массовой информации при 55 ° С в инкубаторе (или водяной бане) при строительстве комплексов слежения анализа пластины.
Часть 3: Пищевая Строительство Диск
- Место стерильным 0,5-мм прокладка силиконовая резина в верхней части пламени стерилизовать микроскопический слайд стекла, образуя небольшой колодец.
- Внесите ~ 300 мкл 55 ° C CTTYE СМИ / агарозы в яме, создаваемой прокладку на слайд и содержащих питательные диска. CTTYE СМИ / агарозном должны насыпи вверх.
- Место пламени стерилизовать слайд (без прокладки) поверх CTTYE СМИ / агарозы.
ВАЖНО: На этом слайде должен быть установлен вниз, под углом, чтобы предотвратить пузырей. - Как только слайд находится в месте, зажим комплекса вместе с мини-клипы связующего - по одной на каждой стороне.
- Место обрезается комплекс на 4 ° С и позволяют CTTYE СМИ / агарозы, чтобы установить. Это обычно занимает около 5 мин.
Часть 4: Отслеживание Пробирной Подготовка - Настройка пластины комплексы
Соберите компоненты, подготовить слайд комплексы, места питательных диск, залить TPM СМИ / агарозы, отдельных комплексов и сухой плиты, плита клеток, и собрать отслеживания комплексов анализа пластины.
Соберите пластины сложных компонентов
- Для каждого комплекса, пламя стерилизовать предметное стекло микроскопа
- Место автоклавного прокладку на верхнюю часть слайда и отложите в сторону (стерилизованное вверх). Это будет форма нижней части теста.
- Пламя стерилизации стеклянных покровным стеклом и поместить его на вершину второй слайд микроскопом стекла обернут маркировки ленты (или парафильмом) и отложите в сторону (стерилизованное вверх). Это используется как поддержка слайд держать покровное от трещин. Это будет форма верхней части теста.
- Пламя стерилизовать 1 / 3 микроскопический слайд стекла и отложите в сторону (стерилизованное вверх). Эта информация будет использоваться для выравнивания агарозы.
ВАЖНО: Убедитесь, что форма прокладок печать со стеклом, нажав ее вниз щипцами, в противном случае СМИ / агарозы, могут засохнуть.
P кружева питательных диск
ВАЖНО: Шаги с 5 по 10 должно быть сделано для одного слайда комплекса на время, в противном случае СМИ / агарозы может начаться укрепить приводит к снижению качества фильма.
- Удалить питательных диска сложная форма 4 ° С (шаг 5 из п. 3) и подглядывать друг от друга слайды подвергая теперь затвердевших CTTYE / агарозы.
- Удалить диаметром 1 мм 'питательных диск "от CTTYE СМИ / агарозном хорошо описано выше, с использованием микро-отбор проб пипеткой с 100 мкл стекла одноразового наконечника и поместить его в яме, создаваемой прокладку на крышку скольжения (шаг 3) .
Налейте пластин
Важнейшим шагом
- Внесите ~ 300 мкл 55 ° C TPM СМИ / агарозы в яме, создаваемой прокладку на крышку и скольжения содержащих питательные диска. TPM СМИ / агарозном должны насыпи вверх.
Важнейшим шагом - Место пламени стерилизовать слайд без каких-либо прокладку (с шага 3) в верхней части TPM СМИ / агарозы.
ВАЖНО: На этом слайде должен быть установлен вниз, под углом, чтобы предотвратить пузырей. - Как только слайд (с шагом 5) находится в месте, зажим комплекса вместе с мини-клипы связующего - по одной на каждой стороне.
- Место обрезается комплекс на 4 ° С и позволяют СМИ / агарозы, чтобы установить. Это обычно занимает около 5 мин.
Отдельный и сухие пластины
ВАЖНО: Для предотвращения массовой информации / агарозном от высыхания, шаги с 11 по 20 должны быть выполнены только на один слайд комплекса на время.
ВАЖНО: Для достижения наилучших результатов шаги с 11 по 13 должны быть выполнены при 4 ° C.
- Как только средства массовой информации / агарозном установил, снимите зажимы и отжать конце комплекса, чтобы ослабить ленту завернутый слайда.
- Удалите ленту пленку слайдов и поместите его на скамейку для дальнейшего использования.
Важнейшим шагом - Использование щипцов, как клин, отдельных скольжения покрова / прокладка / СМИ / агарозном комплекса с поддержкой слайд (без прокладки) и отбросить поддержку слайд.
ВАЖНО: Не используйте любопытных движение отдельных скольжения покрова / прокладка комплекса. Это может привести к разрыву покровным стеклом и / или средств массовой информации / агарозном придерживаться поддержка слайд. - Место скольжения покрова / прокладка / СМИ / агарозном комплекса на ленту-завернутые слайд (прокладка стороной вверх) и удалить от 4 ° C. Поместите этот комплекс рядом с горелкой, чтобы все видимые влага испаряется с вновь подвергаются СМИ / агарозном поверхности - не более 1 мин.
ВАЖНО: Не позволяйте СМИ / агарозном сухой слишком долго, поскольку это может повлиять на М. Ксанф рой поведение.
Пластина клетки
Важнейшим шагом
- Как только лишняя влага испарилась, пипетки 0,5 мкл концентрированной ячейки (шаг 8 из п. 1) на средства массовой информации / агарозном примерно на 1 мм от питательных диска.
ВАЖНО: Это чрезвычайно важно, чтобы убедиться, что клетки на хранение, перемещая пипетку вертикально вниз, а затем прямо вверх. Это гарантирует, что рой будет круговой.
ВАЖНО: Очень важно не трогать пипетки, чтобы средства массовой информации / агарозы. Это сделает депрессии на поверхности и изменить поведение М. Ксанф рой.
Совет: Нажмите пипетки, прежде чем обратиться СМИ / агарозы. Это позволит капли клетки появляются на нижней части кончика пипетки и облегчает хранение клеток. - Как только клетки на хранение, место комплексе рядом с горелкой, чтобы клетка место для сухой - не более 20 сек.
Соберите анализа
- Как только клетка пятно высохнет, выровнять слайд / прокладка комплекса (с шагом 1) с прокладкой на обложке скольжения / прокладка / СМИ / агарозном / клеточный комплекс (с шагом 13) и слегка нажмите вместе, чтобы сформировать печать.
Важнейшим шагом - Очистите поверхности скольжения и покровным стеклом с Kimwipe, чтобы удалить остаток оставленные парафильмом. Завершен анализ должен напомнить Рис 1.
- Место завершена слайд комплекса на нагревательный столик поддерживается на уровне 32 ° C (сползают вниз, накройте ошибиться) сразу же после протереть (шаг 15) для предотвращения образования конденсата форма формирования. Если него образовался конденсат, не говоря слайд комплекса сидеть на нагревательный столик на несколько секунд, прежде чем начать программного обеспечения получения изображений.
- Выберите подходящую цель (2X, 4X, или 10X).
Часть 5: Кино подготовка
т "> важнейшим шагом- Включите камеру и микроскоп, и проверьте уровень освещенности (убедитесь, что свет не слишком интенсивным). Запустите компьютер и открыть программу захвата изображений.
- Нажмите жить окне изображения и фокуса микроскопа. Изображение должно выглядеть примерно одна показано на рисунке 3. Обратите внимание на однородной поверхности агара.
- Начало получения изображения.
Важнейшим шагом - Проверьте фокусировку регулярно в течение первого часа, как средства массовой информации / агар стремится урегулировать вызывающие фокус в дрейф.
- Чистая рабочей зоны.
- После получения изображения завершения, передавать полученные изображения для хранения и сломать слайд комплекса путем замачивания в 90% этанола в одночасье.
- Автоклав прокладки для повторного использования.
Рисунок 1. Мультфильм иллюстрация комплекс пластины TM. () Показывает основные пластины ТМ комплекса в разобранном виде и поперечном сечении. (B) показывает, использование больших прокладок.
Рисунок 2. Микроскоп кластера. Каждый узел микроскопа (вставка) состоит из микроскопа Nikon E400, задачи, нагревается этапе Insight камеры и ноутбука. Каждый узел объединены в сеть и связаны с компьютера главного контроллера. Два узла настроены с флуоресцентными возможности, которые состоят из источника света и EXFO две створки Uniblitz.
Рисунок 3. 20X образ отслеживания анализа аппарата в момент = 0. Шкала бар, 1 мм.
Рисунок 4. Адаптивность комплекс пластины TM. (А) 100X образ М. Ксанф скользящей подвижности на CTTYE в 1,0% агара. (Б) 20-кратный образ П. палочки подергивания подвижности. (C) 20-кратный образ С. marcescens роятся подвижности. И (B) и (С) были проанализированы на LB в 1,0% агара. (D) 40X образ М. smegmatis скользящей подвижности на LB в 0,5% агара. Этот образ был взят в плен использованием альтернативной конфигурации анализа видно 1B рис.
Видео 1. Покадровой видео рой подвергаются отслеживания анализа.
Видео 2. Покадровой видео M. Ксанф рой, где 1% от клетки флуоресцентно маркированы. Переменный фазового контраста и флуоресцентные изображения были взяты в плен и обложил выяснить положение флуоресцентных клеток внутри роя. Это видео было захвачено на CTTYE в 1,0% агара.
Видео 3. Покадровой видео M. Ксанф скользящей подвижности. Это видео было захвачено на CTTYE в 1,0% агара.
Видео 4. Покадровой видео П. палочки подергивания подвижности. Это видео было захвачено на LB в 1,0% агара.
Видео 5. Покадровой видео С. marcescens роятся подвижности. Это видео было захвачено на LB в 1,0% агара.
Видео 6. Покадровой видео M. smegmatis скользящей подвижности. Это видео было захвачено на LB в 0,5% агара использованием альтернативной конфигурации анализа видно 1B рис.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Покадровый микрокиносъемки (TM) стала стандартным подходом к изучению прокариотических подвижность 2-7. Традиционно, ТМ выполняется с помощью фильтра фитили бумага, тонкая колодки агар или агар плит в качестве подложек 8-11. Эти методы являются адекватными и экономически эффективным, когда используется для создания последовательности изображений для иллюстрации общей бактериальной движения. Однако, если последовательности изображений должны приводить к поколению воспроизводимые и количественно точных данных, эти методы требуют много времени и довольно ненадежный. Например, изменения в этих методов вызвано человеческой ошибки могут привести к широкому кругу неточности, от нарушений в поверхность агара, которые могли бы существенно повлиять на поведение бактерий изучается с различиями в фокальной плоскости с одной стороны анализа субстрата к другому. Для решения этих задач, мы разработали комплекс ТМ пластина, которая имеет достаточно стабильное качество для получения воспроизводимых результатов путем использования силиконовых прокладок, которые одновременно являются недорогими и многоразовые (рис. 1). Кроме того, пластина комплекс весьма модифицируемые и доказала, чтобы избежать обезвоживания и достаточно кислорода для более чем неделю в течение различных типов носителей и агар концентрациях.
Для облегчения поколения замедленной фильмы, 8 Nikon E400 микроскопы были оснащены 2X, 4X, 10X и цели каждого из них. Кроме того, камера Insight (Diagnostic Instruments, Inc), и нагревательный столик (20/20 Technologies) был приобретен для каждого микроскопа. Каждая камера была связана с ноутбуком, на котором изображение высокой модифицируемые приобретение программного обеспечения SPOT (Diagnostic Instruments, Inc) был установлен. Все различные компоненты были собраны в узлы, каждый из которых состоит из микроскопа, три цели, камера Insight, нагревательный столик, и управляющего компьютера. Каждый из восьми узлов были объединены в сеть в кластере и связаны с хранения компьютер, который используется для компиляции, анализа и хранения покадровой видео порожденных кластера (рис. 2). Хранения компьютер был оснащен 1 терабайт RAID-системы, которая необходима для хранения огромного количества данных, полученных в кластере.
После завершения комплекса пластина помещается на нагревательный столик микроскопа и отслеживания анализа начинается. Изображения, полученные в заданные интервалы, которые определяются на основе подвижности скорость клеток. Например, отдельные М. Ксанф клетки перемещаются со скоростью примерно в одной ячейке длиной в минуту. Если изображение приобретенных М. Ксанф рой в то же темпами (по одному изображению на минуту), в результате замедленной видео появится гладко во время воспроизведения. После получения изображения будет завершена, изображения собраны в последовательном матрицы и воспроизведены с достаточной скоростью, что они, кажется, движется (Video. 1). Это покадровой видео теперь могут быть проанализированы с помощью различных пакетов программного обеспечения.
Вариации на анализ. Комплекс ТМ пластины очень модифицируемые и может использоваться для визуализации различных микроорганизмов при различных условиях. Рой визуализации можно выполнить с помощью фазово-контрастной микроскопии (которая фиксирует поведение роя как единое целое), флуоресцентной микроскопии (которая фиксирует поведение отдельных флуоресцентные клетки, которые были разводят в не-люминесцентные населения), или комбинация как (что наложение переменного последовательного фазового контраста и флуоресцентные изображения) (Видео 2). Пластины комплекса были успешно использованы для создания покадровой видеозаписи нескольких прокариотических поведения, включая М. Ксанф скользящей подвижности, синегнойной палочки подергивания подвижность, Seratia marcescens роятся моторику, и роман Mycobacterium smegmatis скользящей подвижности (рис. 4 и видео 3-6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование стало возможным благодаря Национального научного фонда Карьера премии (MCB-0746066, Характеризация транскрипции активаторы, которые регулируют поведение Emergent), чтобы RDW
Мы благодарны LJ Шимкус, Б. Гольдман, Г. Син, М. Зингер, Л. Г. Уэлч, К. Мерфи, и Герберт Тейлор за полезные обсуждения и замечания по рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0% Casitone | Difco Laboratories | ||
| 0.5% yeast extract | Difco Laboratories | ||
| Micro-sampling pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 μl glass disposable tip | Fisher Scientific | ||
| 2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket | Grace Bio-Lab Inc. |
References
- Taylor, R. G., Welch, R. D. Chemotaxis as an emergent property of a swarm. J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).
- Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation. J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).
- Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein. Science. 310, 855-857 (2005).
- Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging. Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).
- Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure. J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).
- Dworkin, M., Eide, D. Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients. J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).
- Dworkin, M.
- Wu, S. S., Kaiser, D. Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus. J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).
- Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals. Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).
