Summary
Çalışmak için
Abstract
Δ-proteobacterium Myxococcus xanthus sürüsü milyonlarca sinyalleri bir dizi çevresel uyaranlara yanıt olarak karmaşık, dinamik desenler oluşturmak için kolektif bir, koordine bir hareket olarak hareket hücre içerir . Bu modeller, kendini organize ve acil bireysel hücrelerin davranışlarını gözlemleyerek tahmin edilemez. Bir zaman atlamalı microcinematography izleme testi kullanılarak, M. ayrı bir acil desen tespit xanthus kaynak 1 doğru bir besin degrade kadar bir sürüsü yönlendirilmiş bir hareket olarak tanımlanan, kemotaksis olarak adlandırılır.
Time-lapse microcinematography yoluyla kemotaksis verimli karakterize etmek için, bir çok değiştirilebilir plaka kompleksi geliştirdi (Şekil 1) ve 8 mikroskoplar (Şekil 2), zaman atlamalı videos yakalama yetenekli her bir küme inşa edilmiş. Testin ölçülebilir verilerin tutarlı çoğaltma yetecek kadar titiz, ve ortaya çıkan videolar ince sürüsü davranış değişiklikleri gözlemlemek ve izlemek için izin verir. Bir kez yakalanan, videolar, binlerce videoları işlemek ve depolamak için yeterli belleğe sahip bir analiz / depolama bilgisayara aktarılır. Bu kurulum esnekliği kanıtlanmıştır M. birkaç üyelerine faydalı xanthus toplum.
Protocol
Malzemeleri gerekli:
- Klett metre
- Pipet ve ipuçları
- 2.5 ml mikrosantrifüj tüpler
- Mikrosantrifüj
- CTTYE medya:
- % 1.0 Casitone (Difco Laboratories),% 0.5 maya özü (Difco Laboratories),
- 10.0 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.0 mM KH 2 PO 4, 8.0 mM MgSO 4
- TPM medya:
- 10.0 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.0 mM KH 2 PO 4, 8.0 mM MgSO 4
- Agaroz
- Su banyosu, 55 ° C
- Cam mikroskop lamı
- Büyük cam lamelleri
- 2 x 2 cm, 0.5-mm kalınlığında silikon kauçuk conta (Grace Bio-Lab Inc.)
- Parafilm (ya da etiketleme bant)
- Forseps
- Küçük bağlayıcı klipleri
- Micro-örnekleme pipet (Balıkçı)
- 100 ul cam tek ucu (Balıkçı)
- Kimwipes
Bölüm 1: Hücre Hazırlama
Steril bir ortam oluşturarak başlayın.
- Temiz çalışma alanı, don eldiven ve ışık brülör.
- CTTYE suyu içeren bir balona aşılama ve dinç dönen ile 32 ° C de karanlıkta inkübe bir gecede hücre kültürü başlayın.
- Sonra kültür 5 x 10 8 hücre / ml, 2.5 ml mikrosantrifüj tüp içine pipetle 1 ml hücre yoğunluğu ulaştı.
- 16.000 xg (veya maksimum hız) 2 dakika süreyle santrifüj Pelet hücreleri.
- Durusu ve supernatant atın.
- 1 ml TPM (tuz dengeli, besin ücretsiz medya) ile hücre pelletini yıkayın.
- yeniden askıya alma ve vorteks
- 16.000 xg (veya maksimum hız) az 2 dakika için iplik Re-pelet hücreleri.
- Durusu ve supernatant atın.
KRİTİK ADIM - Pipetleme ve vorteks bir arada kullanarak 100 ul TPM medya tamamen pelet yeniden askıya.
ÖNEMLİ NOT: Bu adım, tüp içinde kalan hücreleri hiçbir kümeleri olduğunu sağlar. Bu biraz zaman alabilir. - Izleme tahlil plakalar hazırlarken oda sıcaklığında kenara hücreleri ayarlayın.
Bölüm 2: Agar hazırlanması
- TPM (testi medya) ve CTTYE (besleyici disk) medya hem de 50 ml hazırlayın.
- Her (agaroz agar daha az difraktif) 0.5 g agaroz ekleyin.
- Sterilize etmek Otoklav.
- Sterilizasyon sonrasında, 55 medya korumak ° C (bir inkübatör veya su banyosu) izleme tahlil plaka kompleksleri inşa ederken.
Bölüm 3: Besin Disk İnşaat
- Oluşturan küçük bir iyi, bir alev steril cam mikroskop lamı üst 0.5 mm kalınlığında steril bir silikon kauçuk conta yerleştirin.
- Pipet ~ 300 ul 55 ° C de slaytta conta tarafından oluşturulan ve besin disk içeren bir CTTYE medya / agaroz. CTTYE medya / agaroz kadar höyük.
- CTTYE medya / agaroz üst alev sterilize slayt (conta ile) yerleştirin.
ÖNEMLİ NOT: Bu slayt şekillendirme kabarcıklarını engellemek için bir açıyla aşağı doğru ayarlanmış olması gerekir. - Slayt yerleştirildikten sonra, mini bağlayıcı klipleri ile birlikte karmaşık kelepçe - her iki tarafta.
- Kırpılır kompleksi, 4 ° C ve CTTYE medya / agaroz ayarlamak için izin yerleştirin. Bu genellikle yaklaşık 5 dakika sürer.
Bölüm 4: Takip Testi Hazırlık - Plaka Kompleksleri Kurma
Parçaları bir araya toplamak, slayt kompleksleri hazırlamak, besin disk yerleştirin, TPM medya / agaroz, ayrı ve kuru plaka kompleksleri, plaka hücreleri ve tahlil plaka kompleksleri izleme monte dökün.
Plaka karmaşık parçaları bir araya
- Her bir kompleks için, alev, bir cam mikroskop lamı sterilize
- Otoklavlanmış conta slayt üstünde bir koyun ve bir kenara koyun (yüzü yukarı sterilize). Bu testin alt oluşturacaktır.
- Alev bir cam kapak kayma ve yer etiketleme bant (veya Parafilm) ile sarılmış bir ikinci cam mikroskop lamı üstüne (yüzü yukarı sterilize) bir kenara sterilize edin. Bu çatlama lamel tutmak için bir destek slayt olarak kullanılır. Bu testin en oluşturacaktır.
- Alev üçüncü bir cam mikroskop lamı sterilize ve kenara koyun (yüzü yukarı sterilize). Bu agaroz düzleştirmek için kullanılır.
ÖNEMLİ NOT: contalar, forseps ile aşağı basarak cam bir mühür formu emin olun, aksi takdirde medya / agaroz kurumasına neden olabilir.
P besleyici diske dantel
ÖNEMLİ: 10 ile 5 Adımda bir defada bir slayt kompleksi yapılması gerekir, aksi takdirde medya / agaroz film kalitesi kötü sonuçlanan katılaşmaya başlar.
- Besleyici disk kompleksi formu çıkarın 4 ° C (bölüm 3 adım 5) ve şu anda katılaşmış CTTYE / agaroz açığa slaytları ayrı gözetlemek.
- 100 ul cam tek ipucu, bir mikro-örnekleme pipet kullanarak yukarıda açıklanan CTTYE medya / agaroz 1 mm çapında 'besleyici disk' çıkarın ve kapak kayma (yukarıdaki adım 3) conta tarafından oluşturulan .
Plakalar dökün
KRİTİK ADIM
- Pipet ~ 300 ul 55 ° C TPM medya / agaroz ve kapak kayma ve besin disk içeren conta tarafından oluşturulan içine. TPM medya / agaroz kadar höyük.
KRİTİK ADIM - TPM medya / agaroz üstünde herhangi bir conta (3 adım) alev sterilize slayt yerleştirin.
ÖNEMLİ NOT: Bu slayt şekillendirme kabarcıklarını engellemek için bir açıyla aşağı doğru ayarlanmış olması gerekir. - Slayt (5 adım) yerleştirildikten sonra, mini bağlayıcı klipleri ile birlikte karmaşık kelepçe - her iki tarafta.
- Kırpılır kompleksi, 4 ° C ve medya / agaroz ayarlamak için izin yerleştirin. Bu genellikle yaklaşık 5 dakika sürer.
Ayrı ve kuru plakalar
ÖNEMLİ: medya / agaroz kurumasını önlemek için, 20 üzerinden 11, bir defada yalnızca bir slayt kompleksi yapılmalıdır adımları.
ÖNEMLİ: En iyi sonuç için, 13 ile 11 adımda 4 yapılmalıdır ° C
- Medya / agaroz ayarlandıktan sonra, bağlayıcı klipleri kaldırmak ve bant sarılmış slayt gevşetmek için kompleks sonuna sıkmak.
- Bant sarılmış bir slayt çıkarın ve daha sonra kullanmak için tezgah üzerine yerleştirin.
KRİTİK ADIM - Destek slayt (conta), bir kama olarak forseps kullanma kapak slip / conta / media / agaroz kompleksi ayrı ve destek slayt atın.
ÖNEMLİ NOT: kapak kayma / conta kompleksi ayrı bir meraklı hareket etmeyin. Bu kapak kayma kırılması ve / veya medya / agaroz destek slayt yapışmasını neden olabilir. - Bant sarılmış slayt kapak kayma / conta / media / agaroz kompleksi (conta tarafı yukarı) yerleştirin ve 4 kaldırmak ° C. Tüm görünür nem yeni maruz medya / agaroz yüzeyinden buharlaşması izin vermek için bir yazıcı için bu karmaşık sonraki yerde en fazla 1 dakika.
ÖNEMLİ NOT: M. medya / agaroz kuru bu kadar çok uzun süre izin vermeyin etkileyebilir xanthus sürüsünün davranış.
Plaka hücreleri
KRİTİK ADIM
- Sonra aşırı nem, besin disk uzak medya / agaroz yaklaşık 1 mm üzerine konsantre hücreleri (part 1 adım 8) 0.5 ul pipet buharlaştı.
ÖNEMLİ NOT: Bu hücreler, düz aşağı ve sonra doğruca yukarı pipet hareket ettirerek tevdi olduğundan emin olmak için son derece önemlidir. Bu sürüsü yuvarlak olmasını sağlar.
ÖNEMLİ: Bu medya / agaroz pipet ucu dokunmak için son derece önemlidir. Bu yüzey üzerinde bir depresyon ve M. davranış değişikliği xanthus sürüsü.
İPUCU: pipet medya / agaroz yaklaşmadan önce sıkıp. Bu hücreler bir damla pipet ucu alt görünür ve hücreleri daha kolay yatırmak için yapmak için izin verecektir. - Hücrelerin yatırılır sonra, brülör sonraki karmaşık hücre nokta kurumasını bekleyin yerleştirin en fazla 20 sn.
Tahlil birleştirin
- Hücre nokta kuruduktan sonra, kapak kayma / conta / media / agaroz / hücre kompleksi (13 adım) contası ile slayt / conta kompleksi (adım 1) hizaya getirin ve yavaşça bir mühür formu ile birlikte basın.
KRİTİK ADIM - Slayt yüzeyleri temizleyin ve Parafilm bıraktığı kalıntı kaldırmak için bir Kimwipe kayma kapsayacak. Tamamlanan test Şekil 1 benzer.
- , 32 ° C'de muhafaza ısıtılmış aşaması tamamlanan slayt kompleksi Place (slayt aşağı yukarı kayma kapak) yoğuşmaya oluşturan önlemek için (adım 15) hemen sonra aşağı silin. Varsa, yoğunlaşma oluşan görüntü elde etme yazılımı başlamadan önce birkaç saniye boyunca ısıtmalı sahnede slayt karmaşık bekletin.
- (2X, 4X, 10X) uygun bir hedef seçin.
Bölüm 5: Film Hazırlığı
t "> KRİTİK ADIM- Açın, fotoğraf makinesi ve mikroskop ve ışık düzeylerini kontrol (ışık çok yoğun olmadığından emin olun). Bilgisayarı başlatın ve görüntü elde etme programını açın.
- Canlı görüntü penceresi tıklayın ve mikroskop odak. Görüntü Şekil 3'te görüldüğü gibi görünmelidir. Düzgün agar yüzeyinden dikkat edin.
- Görüntüler elde başlayın.
KRİTİK ADIM - Medya / agar odak kayması neden yerleşmek eğilimi, ilk bir saat boyunca odağı düzenli olarak kontrol edin.
- Çalışma alanını temiz.
- Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, transfer görüntüleri depolama için satın almış ve bir gecede% 90 etanol iliklerine slayt kompleksi yıkmak.
- Yeniden Otoklav conta.
Şekil 1 TM plaka kompleks Karikatür resimde. (A) patladı görünümü ve kesit temel TM plaka kompleksi gösterir. (B) büyük contaların kullanımını gösterir.
Şekil 2 Mikroskop küme. Her mikroskop düğüm (inset) Nikon E400 mikroskop, hedefleri, ısıtılmış bir aşamada, bir Insight kamera ve dizüstü bilgisayar oluşur. Her düğüm birlikte ağ ve bir ana denetleyici bilgisayara bağlı. Düğümlerin İki EXFO ışık kaynağı ve iki Uniblitz kepenkler oluşur floresan yetenekleri ile ayarlanır.
Şekil 3. 20X görüntü izleme analiz aygıtının bir anda = 0. Ölçeği bar, 1 mm.
Şekil 4 TM plaka kompleks Uyarlanabilirlik. (A) M. 100X görüntü % 1.0 agar CTTYE xanthus kayma motilite. (B) P. 20X görüntü aeruginosa motilite seğirmesi. (C) 20X görüntü S. marcescens motilite swarming. Her ikisi de (B) ve (C),% 1.0 agar LB ölçüldü. (D) M. 40X görüntü smegmatis% 0.5 agar LB motilite kayar. Bu görüntü Şekil 1B görülen alternatif tahlil yapılandırmayı kullanarak ele geçirildi.
Video 1 izleme tahlil tabi bir sürüsü bir zaman atlamalı video.
Bir M. Video 2. bir zaman atlamalı video xanthus sürüsü hücrelerin% 1 floresan ile işaretlenmiş. Alternatif faz kontrast ve floresan görüntüler yakalanır ve floresan hücrelerinin sürüsü içindeki konumunu aydınlatmak için üst üste. Bu video% 1.0 agar CTTYE üzerine yakalandı.
M. Video 3. bir zaman atlamalı video xanthus kayma motilite. Bu video% 1.0 agar CTTYE üzerine yakalandı.
Video 4 P. bir zaman atlamalı video aeruginosa motilite seğirmesi. Bu video% 1.0 agar LB yakalandı.
Video 5 S. bir zaman atlamalı video marcescens motilite swarming. Bu video% 1.0 agar LB yakalandı.
Video 6 M. A time-lapse video smegmatis motilite kayar. Bu video Şekil 1B görülen alternatif tahlil yapılandırmayı kullanarak% 0.5 agar LB yakalandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse microcinematography (TM), prokaryotik motilite 2-7 okuyan bir standart yaklaşım haline gelmiştir . Geleneksel olarak, TM yüzeylerde 8-11 gibi filtre kağıdı fitil, ince agar pedleri, veya agar plaka kullanılarak yapılır. Bu yöntemler bakteri hareketin genel çizimler için görüntü dizileri oluşturmak için kullanıldığı zaman etkili, yeterli ve maliyet. Ancak, görüntü sıralarını tekrarlanabilir ve nicel titiz veri üretimi sonucu gerekiyorsa, bu yöntemlerin zaman alıcı ve biraz güvenilmez. Örneğin, insan hatasından kaynaklanan bu teknikler farklılıklar agar yüzeyindeki bakteri tahlil substrat bir tarafında odak düzlemli farklılıklar çalışılan davranışını önemli ölçüde etkileyebilecek usulsüzlük, geniş bir dizi yanlışlıklar yol açabilir diğer. Bu sorunları çözmek için, biz, ucuz ve yeniden kullanılabilir (Şekil 1) hem de silikon contalar kullanılarak tekrarlanabilir sonuçlar yeterince tutarlı kalitede bir TM plaka kompleksi tasarladık. Buna ek olarak, plaka kompleksi yüksek değiştirilebilir ve sulu ve daha çeşitli ortam türleri ve agar konsantrasyonları üzerinde bir hafta için yeterince oksijenli kalmak kanıtlamıştır.
Zaman atlamalı filmleri üretimi kolaylaştırmak için, 8 Nikon E400 mikroskoplar her 2X, 4X, 10X hedefleri ile donatılmış. Buna ek olarak, bir Insight kamera (Diagnostic Instruments, Inc.), Ve ısıtılmış bir sahne (20/20 Teknolojileri) her mikroskop için satın alınmıştır. Her kamera yüksek değiştirilebilir görüntü elde etme yazılım SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.) Yüklü olduğu bir dizüstü bilgisayar ile bağlantılı. Tüm çeşitli bileşenleri düğüm, her biri bir mikroskop, üç temel amacı, bir Insight kamera, ısıtılmış bir sahne ve bir kontrol bilgisayarı oluşan içine monte edilmiştir. Her sekiz düğümler bir küme halinde bir araya ağ ve küme (Şekil 2) tarafından oluşturulan zaman atlamalı video derlemek, analiz etmek ve saklamak için kullanılan bir depolama bilgisayara bağlı. Depolama bilgisayar kümesi tarafından üretilen büyük miktarda veri depolamak için gerekli olan 1 terabayt RAID sistemi ile donatılmış.
Tamamlandığında, plaka kompleksi mikroskobun ısıtılmış sahnede yerleştirilir ve izleme tahlil başlatılır. Görüntüler, hücrelerin motilite oranı esas alınarak belirlenir önceden ayarlanmış aralıklarla elde edilir. Örneğin, bireysel M. xanthus hücreleri dakikada yaklaşık bir hücre uzunluğu hızında hareket eder. Bir M. görüntüler elde edilir aynı hızı (dakika başına bir görüntü) xanthus sürüsü, zaman atlamalı video oynatımı sırasında yumuşak görünecektir. Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, görüntülerin sıralı bir matris içine derlenmiş ve yeterli bir hızda (Video. 1) hareket ediyormuş gibi görünür oynatılabilir. Bu zaman atlamalı video çeşitli yazılım paketleri kullanılarak analiz edilebilir.
Testi üzerine Çeşitlemeler TM plaka kompleksi yüksek değiştirilebilir ve çeşitli koşullar altında pek çok farklı mikroorganizmaların görselleştirmek için kullanılabilir. Swarm görselleştirme faz-kontrast mikroskobu (tek bir varlık gibi sürüsünün davranış kayıtları), floresan mikroskobu (floresan olmayan nüfus içinde seyreltilmesi bireysel floresan hücrelerinin davranış kayıtları), veya bir kombinasyonu kullanılarak yapılabilir her ikisi (alternatif sıralı faz-kontrast ve floresan görüntü bindirmeleri) (Video 2). Plaka kompleksi başarıyla M. dahil olmak üzere çeşitli prokaryotik davranışların zaman atlamalı video oluşturmak için kullanılır olmuştur xanthus kayma motilite, Pseudomonas aeruginosa seğirmesi motilite, motilite swarming Seratia marcescens ve roman Mycobacterium smegmatis sürgülü motilite (Şekil 4 ve Videolar 3-6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma, RDW için bir Ulusal Bilim Vakfı Kariyer ödülü (MCB-0.746.066, acil Davranış düzenler transkripsiyonel Aktivatörler Karakterizasyonu) mümkün olmuştur
LJ Shimkus, BS Goldman, G. Suen, M. Singer, LG Welch, KA Murphy, ve HG Taş el yazması üzerinde yararlı tartışmalar ve yorumlar için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0% Casitone | Difco Laboratories | ||
| 0.5% yeast extract | Difco Laboratories | ||
| Micro-sampling pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 μl glass disposable tip | Fisher Scientific | ||
| 2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket | Grace Bio-Lab Inc. |
References
- Taylor, R. G., Welch, R. D. Chemotaxis as an emergent property of a swarm. J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).
- Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation. J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).
- Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein. Science. 310, 855-857 (2005).
- Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging. Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).
- Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure. J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).
- Dworkin, M., Eide, D. Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients. J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).
- Dworkin, M.
- Wu, S. S., Kaiser, D. Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus. J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).
- Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals. Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).
