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Biology

माइक्रो स्केल पोषक तत्व परतें समुद्री - सूक्ष्म जीवों के chemotactic रिस्पांस

doi: 10.3791/203 Published: May 28, 2007

Summary

microfluidic चैनलों के बद पोषक तत्व और कतरनी प्रवाह के भीतर जीवाणुओं की तैराकी व्यवहार सीस्केप के भीतर समुद्री रोगाणुओं के chemotactic foraging व्यवहार के अध्ययन के लिए और प्रयोगों में उनके क्रियान्वयन निर्माण में वर्णित हैं.

Protocol

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तैयार

1. एक मुखौटा बनाएँ

एक सीएडी सॉफ्टवेयर का प्रयोग, पारदर्शिता पर उच्च संकल्प मुद्रण के लिए चैनल डिजाइन. यह "मुखौटा" हो जाएगा.

साफ कमरे में:

2. स्वच्छ और वफ़र सेंकना

पहले, एसीटोन के साथ धार वफ़र, तो जल्दी से मेथनॉल के साथ, Isopropanol साथ तो. अंत में, नाइट्रोजन का उपयोग वफ़र सूखी.

5 मिनट के लिए ओवन (130 ° सी) में वफ़र बनाओ.

3. वफ़र कोटिंग

वफ़र स्पिन कोटिंग मशीन के केंद्र में रखें. वफ़र पर बोतल से डालो photoresist (एसयू 8). SU-8 प्रवाह चलो और ~ 10 एस के लिए आराम स्पिन coater पर मुड़ें और अपनी गति से 0 से 500 5 से अधिक rpm के लिए रैंप, 10 एस के लिए 500 rpm पर रखने, 10 से अधिक करने के लिए अंतिम गति रैंप और 30 एस के लिए अंतिम गति पर बनाए रखने के अंतिम गति लक्षित कोटिंग मोटाई और SU-8 इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है है. विवरण में पाया जा सकता http://www.microchem.com/

4. नरम - सेंकना

वफ़र कोटिंग के बाद, यह डिग्री सेल्सियस और फिर 95 में पहली सेंकना 65 में डिग्री सेल्सियस पाक समय लक्षित मोटाई और photoresist के इस्तेमाल के प्रकार के साथ बदलता रहता है है. तो फिर, वफ़र कम से कम 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं.

5. एक्सपोजर

वफ़र के शीर्ष पर मुखौटा प्लेस और पराबैंगनी प्रकाश करने के लिए SU-8 के मैनुअल में सिफारिश की समय के लिए वफ़र बेनकाब.

6. पोस्ट - जोखिम सेंकना

65 पर वफ़र सेंकना डिग्री सेल्सियस और फिर 95 डिग्री सेल्सियस SU-8 मार्गदर्शन के निर्देशों का पालन.

7. वफ़र विकसित करने के लिए "मास्टर" (मोल्ड) प्राप्त

एक डेवलपर (PMMA) के साथ भरा बीकर तैयार. बीकर में वफ़र विसर्जित जबकि बहुत धीरे बीकर oscillating photoresist की unexposed भाग तक दूर धोया जाता है.

हमारी प्रयोगशाला में:

8. PDMS तैयार है और इसे वफ़र पर डालना

इसके इलाज के एजेंट के साथ एक कप में 10:01 के अनुपात में PDMS मिक्स. हलचल और यह homogenously मिश्रण: इस बुलबुले के बहुत से उत्पन्न और मिश्रण अपारदर्शी देखो. 'मास्टर' पर मिश्रण डालो.

9. निर्वात चैम्बर में डी - बुलबुला

बुलबुले हटायें, मास्टर और PDMS मिश्रण है कि यह एक निर्वात चैम्बर में कवर है जब तक सभी बुलबुले गए हैं रखा.

10. ओवन में बेकिंग

65 डिग्री सेल्सियस कठोर PDMS एक ओवन में कम से कम 12 घंटे के लिए बनाओ.

11. पंच छेद

पील और inlets और चैनलों की दुकानों के लिए मास्टर पंच छेद से PDMS बंद.

Cleanroom में () नहीं दिखाया

12. प्लाज्मा संबंध

चैनल दोनों PDMS परत और 1 मिनट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ गिलास स्लाइड के इलाज के बाद एक गिलास स्लाइड पर बंधुआ रहे हैं.

प्रयोगों से:

ऍक्स्प # 1: समुद्री रोगाणुओं के chemotactic सूक्ष्म पैमाने पर पोषक तत्वों की परतों को जवाब जांच

1) प्रयोग की स्थापना

  1. कांच सीरिंज जीवों और substrates जोड़ें
  2. खुर्दबीन मंच पर microfluidic चैनल प्लेस और उचित inlets और दुकानों को टयूबिंग देते हैं
  3. टयूबिंग कनेक्ट करने के लिए जलाशय को बर्बाद करने के लिए. सुनिश्चित करें कि टयूबिंग पूरी तरह से बेकार जलाशय में तरल पदार्थ में डूबे हुए दबाव दोलनों से बचने
  4. सिरिंज पंप पर जगह सीरिंज और वाल्व और टयूबिंग के लिए कनेक्ट
  5. प्रकाश स्थितियों, बढ़ाई, आदि: खुर्दबीन सेट
  6. चैनल में उपयुक्त स्थान पर फोकस
  7. डी बुलबुला बड़ा कृत्रिम समुद्री जल के साथ भर सिरिंज का उपयोग चैनल
  8. सिरिंज पंप पर उचित प्रवाह दर सेट. इस मामले में 2 मिलीग्राम / मिनट, जो चैनल में -1 220 एस सुक्ष्ममापी का एक मतलब प्रवाह वेग से मेल खाती है

2) प्रयोग रनिंग

  1. सिरिंज पंप शुरू करने के लिए चैनल में एक पोषक तत्व ढाल स्थापित
  2. एक बार प्रवाह स्थिर और पोषक तत्वों की एक बैंड विकसित की है, सिरिंज पंप पर प्रवाह को रोकने और इस बिंदु से समय रिकॉर्डिंग शुरू
  3. पोषक तत्व बैंड laterally फैलाना शुरू होता है
  4. नियमित समय अंतराल पर, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए फ्रेम के दृश्यों को रिकॉर्ड करने के लिए 'फ़िल्म' बना
  5. दो बाद में फ्रेम के बीच समय अंतर छवियों ले, ताकि केवल चलती वस्तुओं अब कल्पना कर रहे हैं, कि हमें गैर चलती कणों और पृष्ठभूमि शोर से चलता - फिरता कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुमति देता है के द्वारा तैराकी जीवों का भेदभाव
  6. लो फिल्में पी कोशिकाओं के संदर्भ के साथ चैनल में पदों का निर्धारणपोषक तत्व पैच के osition
  7. 10-20 मिनट के लिए नियमित अंतराल पर रिकार्ड फिल्में पदों और जीवों की तैराकी पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए
  8. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए विभिन्न फ्रेम में (प्रत्येक पिक्सेल के लिए अधिकतम प्रकाश तीव्रता फिल्म की अवधि से अधिक है कि पिक्सेल में दर्ज बताए) जीवों की स्थिति रखना, हम तैराकी कोशिकाओं के लिए प्रक्षेपवक्र जानकारी प्राप्त कर सकते हैं

# 2 ऍक्स्प: समुद्री बैक्टीरिया पर कतरनी के प्रभाव की जांच एक vortexZ में तैराकी

  1. अलग चैनल ज्यामिति का उपयोग करना, हम विभिन्न कतरनी दरों पर एक भंवर में तैर बैक्टीरिया के व्यवहार का पालन कर सकते हैं

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Discussion

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कैसे समुद्री रोगाणुओं उनके स्थानीय रासायनिक और भौतिक वातावरण के साथ बातचीत की समझ महासागरों और पोषक तत्व चक्र कार्बन (आजम और Malfatti 2007) में planktonic सूक्ष्मजीवों की भूमिका का एक और अधिक पूर्ण और सटीक धारणा के लिए आवश्यक है. हालांकि, छोटे तराजू (<मिमी) जिस पर कई महत्वपूर्ण माइक्रोबियल बातचीत जगह ले के कारण, तकनीकी सीमाओं विषम जैव भौतिक रासायनिक परिदृश्य के भीतर माइक्रोबियल व्यवहार के विस्तृत परीक्षाओं को रोका है भविष्यवाणी करने के लिए समुद्र में तैर रोगाणुओं द्वारा अनुभवी हो. Microfluidics में हाल के अग्रिमों (Whitesides एट अल 2001) सूक्ष्म पारिस्थितिकी के विस्तृत विश्लेषण के जटिल microhabitats के भीतर सक्षम है (माओ एट अल 2003, पार्क, एट अल. 2003, Keymer एट अल. मार्कोस, 2006 और 2006 Stocker). microfluidic उपकरणों यहाँ वर्णित हमें समुद्री रोगाणुओं के दोनों chemotactic एक diffusing के पोषक तत्व पैच के जवाब की जांच करने की अनुमति दी (ब्लैकबर्न एट अल 1998 1997) और अशांत कतरनी के भीतर रोगाणुओं की तैराकी व्यवहार एक एकल कोशिका के स्तर पर.

नरम lithographic निर्माण microfluidic चैनलों बनाने में शामिल की प्रक्रिया जटिल विवरण के लिए चैनल आर्किटेक्चर के भीतर बनाया जा अनुमति देता है, चैनलों के भीतर बहती है और gradients के सटीक नियंत्रण की अनुमति है. निर्माण तकनीक द्वारा afforded लचीलापन विभिन्न आयामों के तुलनात्मक अध्ययन के लिए बनाया जा चैनलों के लिए अनुमति देता है. छवि विश्लेषण प्रणाली लागू यहाँ व्यक्ति की कोशिकाओं और पोषक तत्वों की ढ़ाल के दृश्य परमिट, माइक्रोबियल तैराकी और chemotactic व्यवहार की विस्तृत मात्रात्मक विश्लेषण के लिए दोनों एक एकल कोशिका और जनसंख्या के स्तर पर एक मंच प्रदान.

हम समुद्री रोगाणुओं तैराकी की एक किस्म के लिए एक संवेदनशील chemotaxis परख के रूप में इस microfluidic चैनल आवेदन किया है और पाया है कि कई प्रजातियों के तेजी से पोषक तत्वों की एक diffusing के पैच का जवाब देने में सक्षम हैं, पैच के अंदर उच्च पोषक तत्व सांद्रता के भीतर कोशिकाओं के घने aggregations बनाने. पोषक तत्व पैच के भीतर कोशिकाओं के chemotactic संचय के दौरान, कुछ प्रजातियों को भी गति तैराकी और आवृत्ति मोड़ में परिवर्तन सहित व्यवहार परिवर्तन, के रूप में चिह्नित प्रदर्शन. हमारी टिप्पणियों परिकल्पना है कि समुद्री रोगाणुओं महत्वपूर्ण वृद्धि निवास के रूप में समुद्र में अल्पकालिक पोषक तत्व पैच का उपयोग कर सकते हैं के लिए प्रायोगिक समर्थन प्रदान करते हैं.

अलग चैनल ज्यामिति का उपयोग करना, हम करने के लिए जलीय वातावरण में माइक्रोबियल गतिशीलता के लिए प्रासंगिक पैमाने पर स्थिर microvortices उत्पन्न करने में सक्षम हैं. इस सेटअप हमें विभिन्न कतरनी दरों के जवाब में स्विमिंग बैक्टीरिया के व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है. मौन प्रवाह शर्त के तहत यादृच्छिक तैराकी व्यवहार के विपरीत में, एक मजबूत कतरनी की प्रभाव के तहत, जीवाणु दोनों का पालन प्रवाह क्षेत्र streamlines और उनके साथ गठबंधन कर रहे हैं. इस सेटअप सूक्ष्मजीवों और उनके तरल पदार्थ dynamical वातावरण के बीच मौलिक बातचीत पर बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

इन प्रयोगों में से प्रत्येक में, microfluidics गतिशील microhabitats के भीतर माइक्रोबियल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण साबित हो गया है. प्राकृतिक निवास, और microfluidic प्रौद्योगिकी के उपन्यास अनुप्रयोगों के भीतर माइक्रोबियल गतिशीलता के महत्व के एक बढ़ती हुई मान्यता के साथ, हम सुझाव है कि सूक्ष्म पारिस्थितिकी के साथ microfluidics के आगे युग्मन महत्वपूर्ण नए अंतर्दृष्टि उपज जाएगा.

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Acknowledgments

हम एमआईटी में माइक्रोसिस्टम्स प्रौद्योगिकी प्रयोगशालाओं हमें साफ कमरे की सुविधा में इस वीडियो की फिल्म का हिस्सा करने के लिए अनुमति देने के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning http://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100 Photoresist MicroChem Corp. www.microchem.com
Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope Microscope Nikon Instruments
PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) Tool Upchurch Scientific www.upchurch.com
Syringes (Luer-Lok Tip) Tool BD Biosciences
Fitting Part P-704-01 Tool Upchurch Scientific To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes
Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) Equipment Harvard Apparatus
CCD Camera (PCO 1600) Equipment Cook

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References

  1. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
  2. Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
  3. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
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  7. Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
  8. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
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Seymour, J. R., Marcos, Stocker, R. Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers. J. Vis. Exp. (4), e203, doi:10.3791/203 (2007).More

Seymour, J. R., Marcos, Stocker, R. Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers. J. Vis. Exp. (4), e203, doi:10.3791/203 (2007).

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