Summary
La fabrication des canaux microfluidiques et de leur mise en œuvre dans des expériences pour étudier le comportement chimiotactique butinage des microbes marins dans un paysage parcellaire des éléments nutritifs et le comportement de nage des bactéries dans les flux de cisaillement sont décrits.
Abstract
La mesure dans laquelle les microbes planctoniques peuvent exploiter des parcelles de ressources micro-aura des implications considérables pour trophodynamique océaniques et flux biogéochimiques. Cependant, pour profiter de correctifs de nutriments dans l'océan, les microbes de natation doit surmonter l'influence de forces physiques, y compris la diffusion moléculaire et turbulente de cisaillement, ce qui limite la disponibilité de correctifs et de la capacité des bactéries à les localiser. Jusqu'à récemment, les limites méthodologiques ont empêché les examens directs de comportement microbien dans des habitats fragmentaires et réaliste des conditions d'écoulement à petite échelle. Ainsi, beaucoup de nos connaissances actuelles concernant le comportement microbien dans l'océan a été obtenue à partir des prédictions théoriques. Pour obtenir de nouvelles informations sur le comportement alimentaire microbien dans l'océan, nous avons appliqué les techniques de fabrication souples lithographiques pour développer deux dispositifs microfluidiques, que nous avons utilisés pour créer des (i) micro-nutriments patchs avec des dimensions et des caractéristiques de diffusion pertinents pour les processus océaniques et (ii) micro- tourbillons, avec des taux de cisaillement correspondant à ceux attendus dans l'océan. Ces dispositifs microfluidiques ont permis un premier examen direct de la natation et le comportement microbien dans un paysage chimiotactiques hétérogènes et dynamiques. L'utilisation combinée de la microscopie à épifluorescence et contraste de phase permet d'examens directs des dimensions physiques et caractéristiques de diffusion de correctifs en éléments nutritifs, tout en observant la réponse agrégative niveau de la population, en plus du comportement de nage des microbes individuels. Ces expériences ont révélé que certaines espèces de phytoplancton, bactéries hétérotrophes et les protistes phagotrophic sont aptes à repérer et exploiter les ressources de diffusion des correctifs microscopique dans des délais très courts. Nous avons également montré que jusqu'à modérée des taux de cisaillement, les bactéries marines sont capables de lutter contre le flux et nager à travers leur environnement à leur propre gré. Cependant, au-delà d'un niveau de cisaillement seuil élevé, les bactéries sont alignés dans le flux de cisaillement et sont moins capables de nager sans perturbation de l'écoulement. Microfluidique représente une approche novatrice et peu coûteuse pour l'étude de l'écologie microbienne aquatique, et en raison de son aptitude à créer des champs d'écoulement précision réaliste et gradients substrat à l'échelle microscopique, est idéalement applicable aux examens du comportement microbien à la plus petite des échelles d'interaction. Nous suggérons donc que la microfluidique représente un outil précieux pour l'obtention d'une meilleure compréhension de l'écologie des microorganismes dans l'océan.
Protocol
Préparation
1. Créer un masque
Utiliser un logiciel de CAO, la conception du canal pour l'impression haute résolution sur un transparent. Ce sera le "masque".
Dans la salle blanche:
2. Nettoyez et faites cuire la galette
Tout d'abord, la plaquette gicler avec de l'acétone, puis rapidement avec du méthanol, puis à l'isopropanol. Enfin, la galette sèche à l'aide d'azote.
Cuire la galette dans le four (130 ° C) pendant 5 min.
3. Revêtement la plaquette
Placer la galette au centre de la machine spin-coating. Versez résine photosensible (SU-8) de la bouteille sur le wafer. Laissez le flux SU-8 et de détente pour ~ 10 s. Allumez le spin-coucheuse et rampe jusqu'à sa vitesse de 0 à 500 rpm pendant 5 s; garder à 500 rpm pendant 10 s; rampe jusqu'à la vitesse finale de plus de 10 s et de maintenir à la vitesse finale de 30 s. La vitesse finale dépend de l'épaisseur du revêtement ciblées et le SU-8 utilisé. Les détails peuvent être trouvés au http://www.microchem.com/
4. Soft-Cuire
Après le revêtement de la galette, faire cuire d'abord à 65 ° C, puis à 95 ° C. Le temps de cuisson varie en fonction de l'épaisseur et le type de cible photosensible utilisé. Ensuite, laissez la galette reposer à température ambiante pendant au moins 5 min.
5. Exposition
Placez le masque sur le dessus de la plaquette et la plaquette d'exposer à la lumière UV pendant la durée recommandée de la SU-8 manuel.
6. Post-exposition de pâtisseries
Cuire la galette à 65 ° C puis 95 ° C suivant les instructions de SU-8 manuel.
7. Développer la plaquette pour obtenir le "maître" (moule)
Préparer un bécher rempli avec le développeur de méthyle (PMMA). Plonger la plaquette dans le bécher tout en oscillant très doucement le bécher jusqu'à ce que la partie non exposée de la résine est lavé.
Dans notre laboratoire:
8. Préparer PDMS et la verser sur la plaquette
Mélanger le PDMS avec son durcisseur de 10:1 dans une tasse. Incorporer et mélanger de façon homogène c'est: cela va générer beaucoup de bulles et de rendre le mélange air opaque. Verser le mélange sur le «maître».
9. De-bulle dans la chambre à vide
Pour enlever les bulles, placé le mélange maître et PDMS qui est le couvrant dans une chambre à vide jusqu'à ce que toutes les bulles ont disparu.
10. Cuisson au four
Cuire au four pendant au moins 12 heures dans une étuve à 65 ° C pour durcir le PDMS.
11. Percez des trous
Décollez le PDMS du maître et de trous de perforation pour les entrées et sorties des chaînes.
En salle blanche (non montré)
12. Plasma de collage
Les canaux sont collés sur une lame de verre après le traitement à la fois la couche de PDMS et la lame de verre avec un plasma d'oxygène pendant 1 min.
Expériences:
Exp # 1: Étude de la réponse chimiotactique des microbes marins à micro-échelle couches nutriments
1) Mise en place de l'expérience
- Ajouter les organismes et les substrats aux seringues en verre
- Placez canal microfluidique sur platine du microscope et de joindre au tube entrées appropriées et des débouchés
- Relier les tubes à perdre réservoir. Assurez-vous que le tube est entièrement immergée dans le liquide dans le réservoir de déchets pour éviter les oscillations de pression
- Seringues Placer sur une pompe à seringue et raccorder aux vannes et tuyaux
- Mettre en place microscope: les conditions d'éclairage, grossissement, etc
- Focus sur la position appropriée dans le canal
- De la bulle plus grande chaîne à l'aide seringue remplie d'eau de mer artificielle
- Réglez le débit approprié sur une pompe à seringue. Dans ce cas, 2 ml / min, ce qui correspond à une vitesse moyenne d'écoulement de -1 220 um s dans le canal
2) Exécution de l'expérience
- Démarrer la pompe seringue pour établir un gradient de nutriments dans le canal
- Une fois de flux s'est stabilisé et une bande de nutriments a développé, arrêter le flux de la pompe seringue et commencer à enregistrer le temps de ce point
- Bande de nutriments commence à diffuser latéralement
- A intervalles de temps réguliers, utiliser un logiciel d'analyse d'image pour enregistrer des séquences d'images pour créer des «films»
- Discriminer les organismes de natation en prenant le temps de différence d'images entre deux images suivantes, de sorte que seuls les objets en mouvement sont maintenant visualisées, ce qui nous permet de différencier les cellules mobiles du non-déplacement des particules et de bruit de fond
- Prenez les films pour déterminer les positions des cellules dans le canal en référence à la position du patch nutriments
- Enregistrez des vidéos à intervalles réguliers pendant 10-20 min à analyser les positions et les habitudes de nage des organismes
- En utilisant le logiciel d'analyse d'image à superposer les positions des organismes dans différents cadres (en attribuant à chaque pixel de l'intensité lumineuse maximale enregistrée dans ce pixel sur la durée du film), nous pouvons obtenir des informations de trajectoire pour les cellules de la natation
Exp # 2: Étudier les effets de cisaillement sur des bactéries marines nageant dans un vortexZ
- En utilisant la géométrie canal différent, nous pouvons observer le comportement des bactéries nageant dans un vortex à différents taux de cisaillement
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Une compréhension de comment les microbes marins interagissent avec leur composition chimique locale et l'environnement physique est indispensable pour une perception plus complète et précise du rôle des micro-organismes planctoniques dans les océans des nutriments et de carbone de cycles (Azam et Malfatti 2007). Toutefois, en raison de la petite échelle (mm <) sur lequel de nombreuses interactions microbiennes importantes ont lieu, les limites techniques ont empêché un examen détaillé du comportement microbien dans le hétérogènes bio-physico-chimiques paysage prévu pour être vécue par les microbes nageant dans l'océan. Les progrès récents dans la microfluidique (Whitesides et al. 2001) ont permis à des analyses détaillées de l'écologie microbienne dans les microhabitats complexes (Mao et al. 2003, Park et al. 2003, Keymer et al. 2006, Marcos et Stocker 2006). Les dispositifs microfluidiques décrites ici nous a permis d'examiner à la fois la réponse chimiotactique des microbes marins à un patch diffusant des nutriments (Blackburn et al. 1997, 1998) et le comportement de nage des microbes à l'intérieur de cisaillement turbulent, à un niveau cellulaire unique.
Le procédé de fabrication lithographiques mous impliqués dans la prise de l'canaux microfluidiques permet de détails complexes d'être créée au sein de l'architecture de canaux, permettant le contrôle précis des flux et des gradients dans les canaux. Flexibilité offerte par la technique de fabrication permet de canaux de différentes dimensions pour être créé pour des études comparatives. Le système d'analyse d'image appliquée ici permet la visualisation des cellules individuelles et des gradients de nutriments, en fournissant une plateforme pour l'analyse quantitative détaillée de la natation et le comportement microbien chimiotactiques à la fois d'une seule cellule et niveau de la population.
Nous avons appliqué ce canal microfluidique comme un test de chimiotactisme sensibles pour une variété de microbes marins nage et ont constaté que de nombreuses espèces sont capables de répondre rapidement à un patch diffusant de nutriments, de former des agrégations denses de cellules dans des concentrations élevées en nutriments à l'intérieur du patch. Au cours de l'accumulation de chimiotactisme des cellules dans le patch en nutriments, certaines espèces ont également exposé a marqué des changements de comportement, y compris les changements en natation et en tournant la fréquence. Nos observations fournissent un support expérimental pour l'hypothèse que les microbes marins peuvent utiliser courte durée patchs de nutriments dans l'océan comme habitats de croissance important.
En utilisant la géométrie canal différent, nous sommes en mesure de générer microvortices stable sur des échelles pertinentes pour la dynamique microbienne dans l'environnement aquatique. Cette configuration nous permet d'observer le comportement des bactéries de natation en réponse à différents taux de cisaillement. En contraste avec le comportement aléatoire de natation sous la condition de flux de repos, sous l'influence d'un fort cisaillement, des bactéries à la fois suivre rationalise du champ d'écoulement et sont alignés avec eux. Cette configuration offre un aperçu précieux sur les interactions fondamentales entre les microorganismes et leur environnement fluide dynamique.
Dans chacune de ces expériences, la microfluidique s'est avéré être un outil efficace pour étudier le comportement microbien dans les microhabitats dynamique. Avec une reconnaissance croissante de l'importance de la dynamique microbienne dans les habitats naturels, et de nouvelles applications de la technologie microfluidique, nous suggérons que le couplage supplémentaire de la microfluidique à l'écologie microbienne donnera des indications importantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Microsystems Laboratories technologie au MIT pour nous permettre à une partie de film de cette vidéo dans la salle blanche.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
- Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
- Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
- Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
- Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
