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Biology

Respuesta quimiotáctica de los microorganismos marinos a escala micro nutrientes Capas

doi: 10.3791/203 Published: May 28, 2007

Summary

La fabricación de los canales de microfluidos y su aplicación en los experimentos para estudiar el comportamiento quimiotáctico de alimentación de los microbios marinos dentro de un paisaje marino irregular de nutrientes y el comportamiento de la natación de las bacterias dentro del flujo de corte se describen.

Abstract

El grado en que los microbios planctónicos pueden explotar los parches de la microescala de recursos tendrán una repercusión importante en trofodinámica oceánica y el flujo de bioquímicos. Sin embargo, para tomar ventaja de los parches de nutrientes en el océano, los microbios de natación deben superar las influencias de las fuerzas físicas como la difusión molecular y turbulenta corte, lo que limitará la disponibilidad de parches y la capacidad de las bacterias para localizarlos. Hasta hace poco, las limitaciones metodológicas han impedido exámenes directos del comportamiento microbiano en los hábitat irregulares y realista a pequeña escala las condiciones de flujo. Por lo tanto, gran parte de nuestros conocimientos actuales sobre el comportamiento microbiano en el océano ha sido obtenida a partir de las predicciones teóricas. Para obtener nueva información sobre el comportamiento de forrajeo de microbios en el océano se han aplicado las técnicas de fabricación suave litográfica para desarrollar dos dispositivos de microfluidos, que hemos utilizado para crear (i) micro nutrientes parches con las dimensiones y características difusivas relevante para los procesos oceánicos y microescala (ii) vórtices, con tasas de corte correspondiente a los esperados en el océano. Estos dispositivos de microfluidos, han permitido un primer examen directo de la natación microbianas y el comportamiento quimiotáctico dentro de un paisaje marino heterogéneo y dinámico. El uso combinado de epifluorescencia y microscopía de contraste de fase permite exámenes directos de las dimensiones físicas y las características difusivas de los parches de nutrientes, mientras que la observación de la respuesta de agregación a nivel de población, además de la conducta de nado de los microbios individuales. Estos experimentos han revelado que algunas especies de fitoplancton, bacterias y protistas heterótrofos phagotrophic son expertos en localizar y explotar la difusión de los parches de los recursos de la microescala, en plazos muy cortos. También se ha demostrado que hasta las moderadas tasas de corte, las bacterias marinas son capaces de luchar contra la corriente y nadar a través de su entorno a su propia voluntad. Sin embargo, más allá de un umbral de corte de alta, las bacterias se alinean en el flujo de tensiones y son menos capaces de nadar sin interrupción de la corriente. Microfluídica representa un enfoque novedoso y de bajo costo para el estudio de la ecología microbiana acuática, y debido a su idoneidad para la creación de campos con precisión realista del flujo y los gradientes de sustrato en la microescala, es ideal aplicable a los exámenes del comportamiento microbiano en las escalas más pequeñas de la interacción. Por lo tanto, sugieren que la microfluídica representa una herramienta valiosa para la obtención de una mejor comprensión de la ecología de los microorganismos en el océano.

Protocol

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Preparación

1. Crear una máscara

El uso de un software de CAD, el diseño del canal de alta resolución de impresión en una transparencia. Esta será la "máscara".

En la sala limpia:

2. Limpia y hornear la hostia

En primer lugar, chorro de la oblea con acetona, y rápidamente con metanol, y luego con isopropanol. Por último, secar la oblea con nitrógeno.

Hornee la oblea en el horno (130 ° C) durante 5 min.

3. Revestimiento de la oblea

Lugar de la oblea en el centro de la máquina de spin-coating. Vierta fotosensible (SU-8) de la botella sobre la oblea. Deja que el flujo de SU-8 y relajarse durante unos 10 s. A su vez en el spin-aplicador y la rampa de la velocidad de aceleración de 0 a 500 rpm durante 5 s; mantener a 500 rpm durante 10 s; la rampa hasta la velocidad final de más de 10 s, y mantener a la velocidad final de 30 s. La velocidad final depende del espesor del recubrimiento blanco y el SU-8 utilizados. Los detalles se pueden encontrar en http://www.microchem.com/

4. Soft-cocer al horno

Después del recubrimiento de la oblea, se hornea primero a 65 º C y luego a 95 ° C. El tiempo de cocción varía con el espesor objetivo y el tipo de fotoprotector utilizado. A continuación, que la oblea reposar a temperatura ambiente durante al menos 5 min.

5. Exposición

Coloque la máscara en la parte superior de la oblea y exponer la hostia a la luz ultravioleta durante el tiempo recomendado en el SU-8 manual.

6. Después de la exposición hornear

Hornee la oblea a 65 ° C y 95 ° C después de la SU-8 manual instrucciones.

7. El desarrollo de la oblea para obtener el "maestro" (moho)

Prepare un vaso lleno con el desarrollador (PMMA). Sumerja la oblea en el vaso, mientras que muy suavemente oscilantes el vaso hasta que la parte expuesta de la fotosensible es eliminada.

En nuestro laboratorio:

8. Prepare PDMS y se vierte sobre la oblea

Mezclar el PDMS con su agente de curado en relación 10:1 en una taza. Revolver y mezclar homogéneamente: esto va a generar muchas burbujas y hacer la mezcla de mirada opaca. Vierta la mezcla sobre el "maestro".

9. De la burbuja en la cámara de vacío

Para eliminar las burbujas, coloca la mezcla principal y PDMS que es lo que cubre en una cámara de vacío hasta que todas las burbujas se han ido.

10. Hornear en horno

Hornear durante al menos 12 horas en un horno a 65 ° C para endurecer el PDMS.

11. Hacer agujeros

Despegue el PDMS del maestro y agujeros para entradas y salidas de los canales.

En salas blancas (no se muestra)

12. Plasma la unión

Canales se unen a un portaobjetos de vidrio, después de tratar tanto la capa de PDMS y la lámina de vidrio con plasma de oxígeno durante 1 min.

Experimentos:

Exp N º 1: Análisis de la respuesta quimiotáctica de los microbios marinos a micro-escala de las capas de nutrientes

1) Configuración del experimento

  1. Añadir los organismos y los sustratos de jeringas de vidrio
  2. Lugar canal de microfluidos en platina del microscopio y coloque la tubería a las entradas y salidas adecuadas
  3. Conecte el tubo de residuos depósito. Asegúrese de que la tubería está totalmente sumergido en el líquido en el depósito de residuos para evitar oscilaciones de la presión
  4. Coloque las jeringas en la bomba de jeringa y conectar a las válvulas y la tubería
  5. Establecer microscopio: las condiciones de luz, ampliación, etc
  6. Se centran en la posición adecuada en el canal
  7. De la burbuja de canal con mayor jeringa llena con agua de mar artificial
  8. Ajuste la velocidad de flujo apropiado de la bomba de jeringa. En este caso 2 ml / min, que corresponde a una velocidad media del flujo de -1 220 m s en el canal

2) Ejecución del experimento

  1. Arranque de la bomba jeringa para establecer un gradiente de nutrientes en el canal
  2. Una vez que el flujo se ha estabilizado y una banda de nutrientes ha desarrollado, detener el flujo de la bomba de jeringa y comience a registrar el tiempo desde este punto
  3. Banda de nutrientes comienza a difundirse lateralmente
  4. A intervalos regulares de tiempo, el uso de software de análisis de imagen para grabar secuencias de fotogramas para crear "películas"
  5. Discriminar los organismos de natación por tomar imágenes de diferencia de tiempo entre dos fotogramas posteriores, de modo que sólo los objetos en movimiento se visualizan ahora, lo que nos permite diferenciar las células móviles de que no se mueve las partículas y el ruido de fondo
  6. Tomar películas para determinar las posiciones de las células en el canal de relación con la pPOSICIÓN del parche de nutrientes
  7. Grabar películas a intervalos regulares durante 10-20 min para analizar las posiciones y los patrones de nado de los organismos
  8. Al utilizar el software de análisis de imágenes para superponer las posiciones de los organismos en diferentes marcos (asignando a cada píxel de la intensidad de luz máxima registrada en ese píxel durante la duración de la película), podemos obtener información de la trayectoria de las células de la natación

Exp N º 2: Investigar los efectos de la corte sobre las bacterias marinas nadando en un vortexZ

  1. Utilizando la geometría del canal diferente, podemos observar el comportamiento de las bacterias a nadar en un vórtice a diferentes velocidades de corte

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Discussion

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Una comprensión de cómo los microbios marinos interactúan con sus productos químicos locales y el medio ambiente físico es imprescindible para una percepción más completa y precisa del papel de los microorganismos del plancton en los océanos y los nutrientes de carbono de ciclos (Azam y Malfatti 2007). Sin embargo, debido a las pequeñas escamas (mm <) sobre el cual muchas de las interacciones microbianas importantes tienen lugar, las limitaciones técnicas han impedido que los exámenes detallados del comportamiento microbiano dentro del heterogéneo bio-físico-químicas del paisaje predijo que ser experimentado por los microbios nadando en el mar. Los recientes avances en microfluidos (Whitesides et al. 2001) han permitido un análisis detallado de la ecología microbiana en microhábitats complejos (Mao et al. 2003, Park et al. 2003, Keymer et al. 2006, Marcos y Stocker 2006). Los dispositivos de microfluidos aquí descritos nos ha permitido examinar tanto la respuesta quimiotáctica de los microbios marinos a un parche de nutrientes de difusión (Blackburn et al. 1997, 1998) y el comportamiento de la natación de los microbios dentro de cizalla turbulenta, con un nivel de células individuales.

El proceso de fabricación suave litográfica involucrados en la toma de los canales de microfluidos permite complicados detalles que se cree en la arquitectura de canal, permitiendo el control preciso de los flujos y gradientes dentro de los canales. La flexibilidad que ofrece la técnica de fabricación permite que los canales de diversas dimensiones que deben crearse para estudios comparativos. El sistema de análisis de imágenes aplicadas aquí permite la visualización de las células individuales y los gradientes de nutrientes, proporcionando una plataforma para el análisis cuantitativo detallado de la natación microbianas y el comportamiento quimiotáctico tanto de una sola célula-y el nivel de población.

Hemos aplicado este canal de microfluidos como un ensayo de quimiotaxis sensible para una gran variedad de microbios marinos nadando y han descubierto que muchas especies son capaces de responder rápidamente a un parche de difusión de nutrientes, formando densas agregaciones de células dentro de las altas concentraciones de nutrientes en el interior del parche. Durante la acumulación quimiotáctica de las células dentro de la revisión de los nutrientes, algunas especies también se han exhibido marcados cambios de comportamiento, incluyendo los cambios en la natación de velocidad y giro de frecuencia. Nuestras observaciones proporcionan soporte experimental para la hipótesis de que los microbios marinos pueden utilizar parches de corta duración de nutrientes en el mar como hábitat de un importante crecimiento.

Utilizando la geometría del canal diferente, son capaces de generar microvortices estable en escalas relevantes para la dinámica microbiana en el medio acuático. Esta configuración nos permite observar el comportamiento de las bacterias nadar en respuesta a diferentes velocidades de corte. En contraste con el comportamiento de nado al azar bajo condiciones de flujo en reposo, bajo la influencia de una fuerte cizalladura, las bacterias ambos siguen líneas de corriente del campo de flujo y se alinean con ellos. Esta configuración ofrece una valiosa visión sobre la interacción fundamental entre los microorganismos y su medio ambiente dinámica de fluidos.

En cada uno de estos experimentos, la microfluídica ha demostrado ser una herramienta efectiva para estudiar el comportamiento microbiano en microhábitats dinámico. Con un creciente reconocimiento de la importancia de la dinámica microbiana dentro de los hábitats naturales y las nuevas aplicaciones de la tecnología de microfluidos, se sugiere que el acoplamiento de más de microfluidos con la ecología microbiana brindar importantes conocimientos nuevos.

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Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias Microsystems Technology Laboratories en el MIT por permitirnos filmar parte del video en las instalaciones de sala blanca.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning http://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100 Photoresist MicroChem Corp. www.microchem.com
Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope Microscope Nikon Instruments
PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) Tool Upchurch Scientific www.upchurch.com
Syringes (Luer-Lok Tip) Tool BD Biosciences
Fitting Part P-704-01 Tool Upchurch Scientific To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes
Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) Equipment Harvard Apparatus
CCD Camera (PCO 1600) Equipment Cook

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References

  1. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
  2. Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
  3. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
  4. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
  5. Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
  6. Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
  7. Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
  8. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
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Seymour, J. R., Marcos, Stocker, R. Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers. J. Vis. Exp. (4), e203, doi:10.3791/203 (2007).More

Seymour, J. R., Marcos, Stocker, R. Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers. J. Vis. Exp. (4), e203, doi:10.3791/203 (2007).

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