Summary
이 동영상은 transurethrally 마우스 요로 감염을 유발하고 결과 감염의 범위를 정할 방법을 보여 것입니다.
Abstract
관심 Uropathogenic 세균성 변종은 한천을 재배하고 있습니다. 일반적으로, uropathogenic
Protocol
요도 카테터의 I. 준비
- 각 마우스 방광과 샘플로 신장을위한 각각 한 cryovial 튜브 5-6 스테인리스 스틸 비즈 (방광, 1.6 mm의 크기 또는 0.9-2.0 mm의 조화) 또는 지르코늄 산화물 비즈 (신장, 0.5 mm 크기)을 놓으십시오. 비드 함유 튜브 압력솥.
- 주변 온도로 냉각 튜브 후, 각각의 스테인레스 스틸 비드 함유 튜브 및 각 지르코늄 산화물 비드 함유 관에 멸균 PBS 400 microliters에 멸균 PBS 200 microliters를 추가합니다.
- 저희는 형수와 Hultgren 13에 기술된 요도 카테터를 준비합니다. 플랫 헤드 포셉 및 고급 가위 (홍채 또는 유사한 유형)의 깨끗한 쌍을 압력솥과 악기는 주위 온도에 냉각 수 있습니다. 70 % 에탄올과 층류 후드의 표면을 닦아주십시오. 후드에서 폴리에틸렌 튜브의 30cm (대략) 세그먼트를 잘라. 무균 살균 세 CC 주사기에 멸균 30 게이지 바늘 (1 / 2 인치 긴 바늘)을 놓으십시오. autoclaved 포셉와 컷 폴리에틸렌 튜브의 한쪽 끝을 들고 그것이 허브를 만날 때까 바늘에 튜빙을 슬라이드. 약 2cm의 바늘의 끝을 초과되도록 튜브를 잘라. 멸균 배양 접시에있는 주사기와 장소에서 카테터를 제거합니다.
- 교차 오염의 가능성을 줄이기 위해, 우리는 각각의 마우스를 하나의 카테 테르합니다. 모든 카테터가 만들어진 후, 적어도 30 분 동안 자외선을 조사하기 위해 덮개는 배양 접시에 노출하여 그들을 소독. UV 램프 똑바로 쳐다보지 또는 램프가 활성화하는 동안 모자 신체의 어떤 부분을 노출시키지 마십시오. UV 노출 후, 카테터는 배양 접시에있는 장기 저장할 수 있습니다. 우리는 불임을 유지하기 위해 Parafilm으로 접시를 밀봉하는 것이 좋습니다.
II. 동물 접종
- 마우스 스트레스 유발 혼란함을 주죠 요인을 방지하기 위해 실험 조작하기 전에 적어도 일주일에 도착해야합니다. 남성 마우스 요도가 ...에 카테 테르를 꽂다 매우 어려운 있기 때문에 여성의 생쥐를 사용합니다. CBA / J는 일반적으로 활용, UTI - 민감한 근친 마우스 변형입니다. 이것이 노화하기 전에 면역 성숙의 윈도우이기 때문에 생쥐, 연령 8 및 12 주 정도 사용해야합니다. 실험의 첫 날, 냉동 세균성 주식의 유리병에 살균 inoculating 루프의 끝부분을 찍어. 적절한 한천 플레이트에 작은 inoculum 및 연속 출력을 다쳤어요. 일반적으로, uropathogenic E. 대장균 (UPEC) 및 기타 종자는 37 Luria - Bertani (LB) 한천에서 밤새 성장 수 있습니다 ° C 주위 공기. UPEC의 계통 LB 한천에 고체, 노란 흰색 반투명 식민지로 성장합니다. 즉시 세균성 주식은 냉동실로 돌아갑니다. Uropathogenic 박테리아 계통 반복, 시리얼 문화와 함께 시간이 지남에 따라 덜 치명이 될 수 있습니다. 따라서, 우리는 각각의 실험에 대한 새로운 한천 플레이트를 줄이 것이 좋습니다.
- 실험의 일 2, 적절한 콜로니 형태를 확인 후, 밤새 국물 문화의 적어도 5 CC에서 한천 플레이트와 장소에서 하나의 식민지를 선택하십시오. LB의 국물이 가장 uropathogenic 박테리아 변종에 사용할 수 있습니다 (37 ° C, 주변 공기 200 RPM). 폭기을 허용하도록 국물 문화 튜브에 느슨하게 뚜껑을 유지.
- 실험 3 일에, 유형 I 필리 표현을 향상시키기 위해, (일반적으로 37 ° C와 200 RPM) 다시 밤새 국물 최초의 국물 문화와 문화의 10 %를 가져가라. 유형 I 필리가 생체내 1 uropathogens에 대한 중요한 독성 인자로 표시되었습니다 이후 시리얼 수프 문화는 박테리아 uropathogenicity을 최적화하는 데 도움이됩니다. 폭기을 허용하도록 국물 문화 튜브에 느슨하게 뚜껑을 유지.
- 실험의 일 4 일 3 국물 문화의 OD 600 측정합니다. 이미 테스트되고있는 세균성 긴장 유명하지 않은 경우, OD 600 cfu 사이의 관계를 결정하기 위해 최소 7 로그 (PBS로 수행 dilutions, LB 한천에서 수행 문화, 37 ° C 부화 야간) 이상의 10 배로 시리얼 희석 도금을 수행 / ML. 엄지의 규칙으로 0.4-0.5의 OD 600 일반적으로 50 microliters 당 1 - 2x10 7 cfu에 해당합니다. OD 600 cfu / ML 사이의 관계가 결정되면, 하나는 PBS의 50 microliters에서 마우스마다 원하는 cfu에 해당하는 OD 600 국물 문화를 조정할 수 있습니다. 일부 작업은 오히려 50 10 microliters의 접종은 kidneys6에 덜 역류에 이르게 것을 제안했다. 그러나, 대부분의 출판물은 마우스 최대 50 microliters의 사용을보고합니다. 일반적으로, 10 6 108 cfu / 마우스하지만, 각각의 박테리아 / 마우스 변형 조합이 경험적으로 생체내에 검증이 필요 사이의 원하는 cfu 범위.
- 그 inocula가 떨어뜨림 후에 즉시 무효화되지 않도록하기 위해 생쥐 전에 전신 마취의 유도하기 위해 최소 30 분 동안 물을 박탈해야합니다. 또 다른 주요 작전 쥐를 scruffing하여 마취 유도 전에 voiding 유도하고 부드럽게 낮은 abdom을 눌러입니다ko 페이지를 참조하십시오. isoflurane 두 2.5 %는 1.8-2 % isoflurane과 유지 보수 마취 다음 8-12주 오래된 여성 CBA 마우스에 대한 안전 유도 복용입니다.
- 마취가 달성되면, 생쥐는 isoflurane 함유 산소에 연결된 nosecone에 삽입 자신의 머리를 위로 향한 위치에 배치됩니다. 낮은 복부는 방광에서 소변을 철수하는 마사지입니다. 방광은 상대적으로 비어있는 경우,이 책략은 소변을 양보하지 않을 수 있습니다. 낮은 복부와 회음부는 70 % 에탄올로 적셔 있습니다.
- 바늘없는 무균 한 CC의 주사기는 원하는 세균 inoculum을 작성하는 데 사용됩니다. 다음 멸균 요도 카테터는 무균 주사기에 배치됩니다. 관만이 1-2밀리미터은 바늘의 끝부분에 말초 남아 있도록 여분의 튜브는 가위로 카테터를 차단합니다. 그런 다음 주사기는 도청과 플런저가 똑바로 모든 거품을 제거하기 위해 주사기와 우울증이다. 정균 윤활의 덩어리가 젤리 멸균 페트리 접시 또는 멸균 주사기 래퍼의 내부에 squirted입니다. 카테터의 끝 (첨부 주사기 포함) 젤리에 담근이다. 여러 박테리아 변종이 같은 실험에서 테스트되고있다면, 다른 변종을 포함하는 카테터에 기름칠을하는 젤리 같은 드롭을 사용하지 않도록주의합니다.
- 확대를위한 스테레오 현미경 (배 줌 범위 0.8x)를 사용하여 anesthetized 마우스 clitoral 후드는 부드럽게 미세 이빨 포셉 한 쌍의와 비 지배적인 손에 쥐었다하고 깊은 분홍색 요도 (外耳道) (노출 cephalad 제기 그림 1). 주사기는 (첨부 카테터)를 연필 그립으로 지배적인 손에 쥐었다하고 카테터의 끝은 45도 각도에서 요도 (外耳道)에 종사합니다. clitoral 후드는 주사기의 긴 축을 따라 뻗어이며, 효과적으로 카테 테르에 요도를 "로딩". 마우스 요도가 중복되어 있기 때문에이 작전 필수적입니다. 카테 테르는 방광 (최대 허브에, 그림 2)으로 쉽게 슬라이드해야하고, 부드럽게 요도의 중복 주름을 탐색하는 데 도움이 twirled 수 있습니다. 카테터가 hubbed되면 그것이 마우스의 긴 축을과 병렬 때까지 주사기가 낮아 수 있습니다. 비 지배적인 손으로 천천히 inoculum을 (적어도 5 초) 주입하는 데 사용되는 지배적인 손으로 카테터와 주사기의 위치를 안정화 있도록 포셉를 놓을 수 있습니다. 액체가 주입하는 동안 카테터 주위에 흐르는 볼 경우 방광 하나가 가득하거나 카테 테르의 질 (요도에 바로 꼬리)에 있습니다. 사출은 즉시 중단하고 카테터의 위치를주의 깊게 검사해야합니다. 카테터가 요도에있다면, 주어진 마우스가 실험에 포함되지 않습니다. 반면에, 질에 잃어 버렸어요 카테터가 재지정 수 있으며 사출 다시 시도. 주사 후, 카테터와 주사기가 천천히 마우스 철회 있습니다.
- 관리 세균을 철수시키고 가변 감염 수준으로 이어질 수 있습니다 초기 이후의 접종의 voiding의 가능성을 줄이기 위해 일부 조사는 transurethral inoculation10 후 30 분 동안 마취 생쥐를 유지합니다. 수술 후, 생쥐는 정상적인 호흡 패턴 및 활동의 반환을 확인하는 지속적인 관찰과 함께 깨끗한 온난 화 담요에 복구해야합니다. 일단 동물이 완전히 크롤 링하는 능력을 회복, 그들은 침구 함유 새장을 위해 제공될 수 있습니다.
III. 감염된 조직에 측정 CFU
- 다양한 마우스 UTI 간행물은 6 시간에서 한 주 이상 사후 접종에 문화 결과를보고했습니다. 최적의 시간 지점은 각 세균 / 마우스 스트레인 조합에 대해 경험적으로 결정해야합니다. 무효화 소변은 멸균 페트리 접시 마우스를 scruffing하여 문화 얻을 수 있습니다. 수집된 소변은 항상 얼음에 보관해야합니다. 몇 시간 동안 무효화 소변을 얻기 위해 여러 시도는 마우스 voiding가 자주, 낮은 볼륨 (무효 당 30-100 microliters)이기 때문에, 필요하고, 스트레스에 의존 수 있습니다.
- 무효화 소변 표본을 얻기 후에, 우리는 isoflurane과 경추 탈구를 사용하여 마우스를 희생. 복부는 무균 열립니다. 무효화 소변 표본이 성공적으로 이전 얻은 정보가 아닌 경우, 소변의 작은 금액은 종종 30 게이지 바늘과 주사기를 사용하여 방광 벽을 통해 aspirated 수 있습니다.
- 하나 또는 둘 모두 신장이 제거 멸균 배양 접시에 최소한 4 개 (각 조각은 50 미만 마이크로 그램한다)에 다진과에 배치됩니다 지르코늄 구슬 / PBS 함유 얼음 cryovials합니다. 방광이 제거 최소 4 조각으로 다진하고, 스테인레스 스틸 비드 /에 위치합니다 PBS 함유 얼음 cryovials합니다. 조직 / 구슬 / PBS 함유 cryovials 것은 총알이 블렌더 균 질기에 배치되고 조직은 일분에 대한 "8"속도 설정을 사용 균질하고 있습니다. 어떤 조직 조각 균질 후 유지하는 것이 일반적입니다. 액체 homogenate의 50-100 microliters가 pipetted 수있는만큼, 고체 파편문제를 반드시하지 않습니다. 균질화 시간이 몇 가지 샘플에 대한 증가하는 경우, 그것은 균질의 일관성을 유지하기 위해 모든 조직에 대해 그렇게 할 중요합니다. 그것이, 교차 오염의 가능성을 피할 개별 샘플에게 표준 균 질기를 사용하여 하나씩 처리를보다 신속하고, 상당히 균질되는 샘플을 가열하지 않기 때문에 우리는 총알 블렌더 균 질기를 활용.
- 수집된 소변 및 조직 homogenates 적어도 두 개 또는 세 10 배로 dilutions은 microtiter 접시에하여야한다. 예비 실험의 경우는 최소 7 10 배로 dilutions를 만들기 위해 신중한 수 있습니다. 적절한 한천의 문화는 최대 100 소변의 microliters, 방광, 및 / 또는 신장 homogenates. 소변 표본은 볼륨 제한 수 있기 때문에, 그것은 10 배로 dilutions를 수행하기 전에 100 microliters 자신의 볼륨을 가지고해야 할 수도 있습니다. 이것이 필요한 경우, 초기 희석은 (10 배 희석 전) 세균성 산출의 최종 계산에 고려해야합니다. 이러한 미디어 그램 부정적인 유기체를위한 선택이기 때문에 우리는, eosin - 메틸렌 블루 또는 MacConkey 한천 배지 (37시 야간 보육 ° C)에 culturing의 UPEC를 선호합니다. UPEC의 변종 유제품을 발효 능력으로 인해 중앙 umbilicated, 빨강 - 분홍색 식민지로 MacConkey 한천 배지에서 성장.
- 하룻밤 문화 후, 각각의 접시 cfu을 계산합니다. 순차적으로 희석 시료의 경우, 50-100 식민지가 포함된 플레이트 희석은 가장 정확한 카운트로 간주됩니다. "뒤로"조직의 밀리그램 당 조직마다 cfu을 계산하거나, ML 당.
IV. 대표 결과
그림 1. 포셉 (사진 맨 위로 넘어)로 cephalad clitoral 후드를 리프팅하여 노출 요도 (外耳道) (어두운 분홍색 조직)
그림 2. 요도를 Catheterized. 이열의 클리토리스가 방금 카테터 위에 볼 수 있습니다.
그림 3. 블레더 cfu 2 일 uropathogenic E. 함께 8주 오래된 여성 CBA / J 생쥐의 transurethral 감염 후 카운트 대장균. Bladders는 MacConkey 한천에 시리얼 희석 도금에 의해 균질하고 cfu / ML 결정됩니다. 다이아몬드 개별 생쥐에 대한 cfu / ML을 나타냅니다, 수평 막대가 중간 cfu / ML을 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
박테리아의 transurethral 접종하여 마우스 요도의 요로 감염의 유도는 오랜 설립하지만, 기술적으로 까다로운 절차 11. 기형 및 Hultgren 최근 마우스 요로 감염 13 transurethral 기술의 우수 리뷰를 발표했다. 본 논문에서는, 우리는 더 이상이 실험 방법의 미세한 포인트를 설명하려고합니다.
초보자는 방광을 폭로 정중선 개복술을 수행하는 인도 잉크 (PBS 1 %)의 희석 용액을 주입하고, 방광의 청색 착색에 대한 관찰하여 기술을 연습 있습니다. 우리는 방광 마우스 요도 주입하는 동안 처리하는 가장 어려운 문제 중 하나입니다 것으로 나타났습니다, 그리고 최고의 물 부족과 위에서 설명한 사전 마취 voiding 전략에 의해 예방됩니다. 우리 손에, 마우스의 <10 %는 요도 주입하는 동안 소변의 오버플로우를 나타냅니다. 또 다른 잠재적인 걸림돌은 요도 천공, 방광 inocula의 부적 절한 복용, 심지어는 동물의 죽음을 초래할 수 충격 catheterization 있습니다. 젠틀 기술과 인내가 catheterization 동안 열쇠입니다, 성공 catheterization은 방광에 카테터를 강제로 요구하지 않습니다.
마지막으로, 일부 실험실 총알 블렌더 균 질기 또는 낮은 샘플 번호 또는 비용 고려 사항으로 인해 중 다른 "중간 처리"균질 화기를 사용하실 수 없습니다. 중급 솔루션은 표준 균 질기를 사용하여 각 샘플 사이의 장치를 청소하는 것입니다. 가장 경제적인 솔루션은 우리가 성공적으로 총알 블렌더 균질 화기로 전환하기 전에 고용 유리 분쇄기의 사용이다. 상관없이 사용하는 조직 균질 방식, 세심한, 무균, 그리고 일관성있는 기술은 재현성 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 자신의 전문 기술 지원을 셸리 샤오와 제니퍼 펜을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 소아 비뇨기과와 스탠포드 소아 연구 기금의 학회에서 부여를 통해 가능하게되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
- Rouschop, K. M. Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract. J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli. Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).
- Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).
- Hvidberg, H. Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies. Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).
- Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).
- Bishop, B. L. Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells. Nat Med. 13, 625-630 (2007).
- Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).
- Hagberg, L. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect Immun. 40, 273-283 (1983).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
