Summary
Deze video zal aantonen methoden om transurethrally veroorzaken muis infecties van de urinewegen en kwantificeren van de omvang van de resulterende infecties.
Abstract
Uropathogene bacteriestammen die van belang zijn gekweekt op agar. In het algemeen, uropathogene
Protocol
I. Voorbereiding van de urethrale katheters
- Voor elke muis blaas en nieren te bemonsteren, Plaats 5-6 roestvrij staal kralen (blaas, 1,6 mm formaat of 0,9-2,0 mm blend) of zirkoniumoxide kralen (nier, 0,5 mm formaat) in een cryovial buis, respectievelijk. Autoclaaf de kraal-bevattende buizen.
- Na de buizen afkoelen tot kamertemperatuur, voeg 200 microliter van steriele PBS aan elk roestvrij staal bead-bevattende buis en 400 microliter van steriele PBS aan elk zirkoonoxide bead-bevattende buis.
- We bereiden urethrale katheters zoals beschreven door Hung en Hultgren 13. Autoclaaf een schoon paar platte kop en fijn pincet schaar (iris of vergelijkbaar type) en laat de instrumenten om af te koelen tot kamertemperatuur. Veeg de oppervlakken van een laminaire stroming kap met 70% ethanol. In de kap, snijd een 30 cm (bij benadering) segment van polyethyleen buizen. Aseptisch plaats een steriele naald van 30 gauge (1 / 2 inch lange naald) in een steriele 3 cc spuit. Pick-up een eind van de snede polyethyleen buis met de geautoclaveerde tang en schuif de slang op de naald totdat het voldoet aan de hub. Snijd de slang, zodat ongeveer 2 cm langer is dan de punt van de naald. Verwijder de katheter uit de spuit en plaats in een steriele petrischaal.
- Ter vermindering van de kans op kruisbesmetting, maken we een katheter voor elke muis. Nadat alle katheters zijn gemaakt, steriliseren ze door blootstelling in een onbedekt petrischaaltje UV-bestraling voor ten minste 30 minuten. Niet rechtstreeks naar UV-lampen of bloot enig deel van het lichaam in de kap, terwijl lampen zijn geactiveerd. Na blootstelling aan UV, kunnen katheters worden opgeslagen op lange termijn in de petrischaal. Wij raden het afdichten van de schotel met Parafilm om te helpen steriliteit te behouden.
II. Dier inenting
- Muizen moeten komen op ten minste een week voor de experimentele manipulatie om stress geïnduceerde verstorende factoren te vermijden. Vrouwelijke muizen zijn gebruikt omdat de mannelijke muizen plasbuis is zeer moeilijk te kateterizeren. CBA / J is een algemeen gebruikt, UTI-gevoelige inteelt muizenstam. Muizen moeten worden gebruikt tussen de 8 en 12 weken oud zijn, want dit is de etalage van immunologische volwassenheid voorafgaand aan de veroudering. Op de eerste dag van het experiment, dip aan het einde van een steriele entnaald in een flacon van bevroren bacteriële voorraad. Schraap een klein inoculum en de streep uit op een geschikte agarplaat. In het algemeen, uropathogene E. coli (UPEC) en andere stammen kunnen 's nachts worden geteeld op Luria-Bertani (LB) agar bij 37 ° C in de lucht. UPEC stammen groeien als solide, geelachtig-wit doorschijnende kolonies op LB agar. Onmiddellijk de bacteriële voorraad terug te keren naar de vriezer. Uropathogene bacteriestammen kunnen minder virulent na verloop van tijd met herhaalde, seriële culturen. Daarom adviseren wij strepen uit een nieuwe agar plaat voor elk experiment.
- Op dag 2 van het experiment, na het bevestigen van een goede morfologie kolonie, enkele kolonies van agar platen en 's nachts plaats halen in ten minste 5 cc bouillon cultuur. LB bouillon kan gebruikt worden voor de meeste uropathogene bacteriestammen (37 ° C, 200 rpm in de lucht). Houd de doppen los op de bouillon cultuur buizen beluchting mogelijk te maken.
- Op dag 3 van het experiment nemen 10% van de eerste bouillon cultuur en de cultuur in bouillon weer 's nachts (meestal 37 ° C en 200 tpm), tot type I pili expressie te verbeteren. Serial bouillon culturen helpen om bacteriële uropathogenicity te optimaliseren, want type I pili is aangetoond dat een kritische virulentie factor voor uropathogens in vivo 1. Houd de doppen los op de bouillon cultuur buizen beluchting mogelijk te maken.
- Op dag 4 van het experiment, het meten van de OD 600 van de bouillon cultuur van dag 3. Als dit niet al bekend voor de bacteriestam wordt getest, moet u tien-voudige seriële verdunning plating over ten minste 7 logs (verdunningen uitgevoerd met PBS, culturen uitgevoerd op LB-agar, 37 ° C incubatie 's nachts) om de relatie tussen OD 600 en cfu te bepalen / ml. Als een vuistregel, een OD 600 van 0,4-0,5 komt overeen met het algemeen tot een 2x10-7 kve per 50 microliter. Zodra de relatie tussen de OD 600 en cfu / ml is vastgesteld, kan men de bouillon cultuur aan te passen aan de OD 600 overeenkomt met de gewenste kve per muis in 50 microliter van PBS. Wat werk heeft gesuggereerd dat inoculatie van 10 microliter, in plaats van 50, leidt tot minder reflux in de kidneys6. Toch hebben de meeste publicaties gemeld gebruik van 50 microliter per muis. Het algemeen, de gewenste cfu varieert tussen 10 6 en 108 cfu / muis, maar elke bacteriële / muis combinatie van stam moet empirisch worden getest in vivo.
- Om ervoor te zorgen dat de inocula worden niet ongeldig verklaard onmiddellijk na instillatie, moet muizen worden beroofd van water gedurende tenminste 30 minuten voor de inductie van algemene anesthesie. Een ander belangrijk manoeuvre is om te bewegen plassen voorafgaand aan de anesthesie-inductie door scruffing muizen en zachtjes op de onderste abdomen. Twee tot 2,5% isofluraan is een veilige inductie dosis voor 8-12 weken oude vrouwelijke CBA muizen, gevolgd door onderhoud van anesthesie met 1,8-2% isofluraan.
- Als de verdoving eenmaal is bereikt, worden muizen geplaatst in de rugligging met hun hoofd ingevoegd in een neuskegel verbonden met isofluraan-met zuurstof. De onderbuik wordt gemasseerd om de urine te evacueren uit de blaas. Als de blaas is relatief leeg is, kan deze manoeuvre niet toegeven urine. De onderbuik en het perineum is doordrenkt met 70% ethanol.
- Een steriele 1 cc spuit zonder naald wordt gebruikt voor het opstellen van de gewenste bacterieel inoculum. Vervolgens wordt een steriel urethrale catheter aseptisch op de spuit. Het teveel aan slangen is afgesneden van de katheter met een schaar, zodat slechts 1-2 millimeter van de slang blijven distaal van de punt van de naald. Vervolgens wordt de spuit getikt en de zuiger ingedrukt met de spuit rechtop om alle luchtbellen te verwijderen. Een klodder bacteriostatisch smerende is gelei gespoten op een steriele petrischaal of de binnenkant van steriele spuit wrapper. De tip van de katheter (met aangesloten spuit) is ondergedompeld in de gelei. Als er meerdere bacteriestammen worden getest in hetzelfde experiment, wees voorzichtig niet dezelfde daling van gelei te gebruiken om katheters met verschillende stammen te smeren.
- Met behulp van een stereo-microscoop (0,8 x tot 5x zoombereik) voor een vergroting, is de clitoris motorkap van de verdoofde muis zachtjes gevat in de niet-dominante hand met een paar fijn getande pincet en getogen craniale naar de diepe roze urethrale meatus bloot ( figuur 1). De spuit (met aangehechte katheter) is begrepen in de dominante hand met een potlood grip en de tip van de katheter is betrokken bij de urethra gehoorgang op een hoek van 45 graden. De clitoris kap is uitgerekt langs de lange as van de spuit, effectief "loading" de urinebuis op de katheter. Deze manoeuvre is van essentieel belang, omdat de muis plasbuis is overbodig. De katheter moet gemakkelijk in de blaas (tot de hub, figuur 2), en kan voorzichtig worden draaide om de overbodige plooien van de plasbuis te navigeren. Nadat de katheter is hubbed, kan de injectiespuit worden verlaagd totdat deze parallel met de lange as van de muis. De niet-dominante hand kan dalen de tang om de positie van de katheter en spuit de dominante hand wordt gebruikt om langzaam te injecteren de inoculum (minstens 5 seconden) te stabiliseren. Als vloeistof wordt gezien stroomt rond de katheter tijdens de injectie, ofwel de blaas vol is of de katheter wordt in de vagina (net caudaal van de plasbuis). Injectie moet onmiddellijk gestopt worden en de positie van de katheter zorgvuldig onderzocht. Als de katheter in de plasbuis was, moet de gegeven muis niet worden opgenomen in het experiment. Aan de andere kant kan een catheter misplaatst in de vagina worden verplaatst en de injectie opnieuw geprobeerd. Na injectie wordt de katheter en de injectiespuit langzaam uit de muis.
- Ter vermindering van de kans op vroege post-inoculatie plassen, wat kan evacueren toegediend bacteriën en daardoor leiden tot een variabele infectie niveaus, sommige onderzoekers te onderhouden muizen onder narcose gedurende 30 minuten na transurethrale inoculation10. Na de operatie moet muizen terug op een schone aarde deken met continue observatie om terug te keren van normale ademhaling en activiteit te bevestigen. Zodra dieren volledig hebben de mogelijkheid om kruipen hersteld, kunnen ze worden teruggestuurd naar beddengoed-bevattende kooien.
III. Het meten van CFU in geïnfecteerd weefsel
- Verschillende muis UTI publicaties gerapporteerd over de cultuur resultaten van 6 uur tot een week of langer na de inenting. De optimale tijd punten moeten empirisch worden bepaald voor elke bacteriële / muizenstam combinatie. Vervalt urine wordt verkregen voor cultuur door scruffing muis over een steriele petrischaal. Verzamelde urine dient te worden gehouden op ijs te allen tijde. Meerdere pogingen om vervallen urine te krijgen gedurende vele uren kan het nodig zijn, omdat de muis lediging is frequent, een laag volume (30-100 microliter per leegte), en stress-afhankelijk.
- Na het behalen van vernietigde urinemonsters, we offeren muizen met behulp van isofluraan en cervicale dislocatie. De buik is aseptisch geopend. Als een nietige urinemonster werd niet met succes eerder verkregen, kan een kleine hoeveelheid urine vaak worden opgezogen door de blaaswand met behulp van een 30 gauge naald en spuit.
- Een of beide nieren zijn verwijderd, gehakt in ten minste 4 stukken (elk stuk moet lager zijn dan 50 microgram) op een steriele petrischaaltje en geplaatst in zirkoon kraal / PBS-bevattende cryovials op het ijs. De blaas is verwijderd, gehakt in ten minste vier stukken, en geplaatst in roestvrij staal kraal / PBS-bevattende cryovials op het ijs. Het weefsel / kraal / PBS-bevattende cryovials worden geplaatst in een Bullet Blender homogenisator en de weefsels worden gehomogeniseerd met behulp van de "8" speed setting voor een minuut. Het is gebruikelijk dat voor sommige weefselfragmenten te blijven na homogenisering. Zolang 50-100 microliter vloeistof homogenaat kan worden gepipetteerd, solide fragmentenzijn niet noodzakelijk een probleem. Als homogenisering tijd wordt verhoogd voor een aantal monsters, is het essentieel om dit te doen voor alle weefsels in om de consistentie van homogenisering te behouden. We maken gebruik van een Bullet Blender homogenisator, omdat het voorkomt de mogelijkheid van cross-contaminatie, is sneller dan de verwerking van individuele monsters een voor een met een standaard homogenisator, en niet significant warmte de monsters gehomogeniseerd.
- Ten minste twee of drie tien-voudige verdunningen van de verzamelde urine en weefsel homogenaten moeten worden gemaakt in een microtiterplaat. Voor de inleidende experimenten kan het verstandig om ten minste zeven tien-voudige verdunningen te maken. Cultuur tot 100 microliter urine, blaas en / of nieren homogenaten over geschikte agar. Omdat de urine monsters kunnen worden volume-beperkt is, kan het nodig zijn om hun volumes voor te brengen tot 100 microliter tot het uitvoeren van tien-voudige verdunningen. Indien dit nodig is, zal de eerste verdunning (voor tien-voudige verdunning) moeten worden verwerkt in de definitieve berekeningen van de bacteriële oplevert. Wij geven de voorkeur kweken UPEC op eosine-methyleenblauw of MacConkey agar (overnacht incubatie bij 37 ° C), omdat deze media zijn selectief voor gramnegatieve organismen. UPEC stammen groeien op MacConkey agar zo centraal umbilicated, rood-roze kolonies vanwege hun vermogen om lactose te fermenteren.
- Na een nacht cultuur, tellen de CFU voor elke plaat. Voor serieel verdunde monsters, is de plaat verdunnen met 50 tot 100 kolonies beschouwd als de meest nauwkeurige telling. "Back" berekenen cfu per weefsel, per milligram weefsel, of per ml.
IV. Representatieve resultaten
Figuur 1. Urethrale meatus (donker roze weefsel) worden blootgesteld door het optillen van de clitoris kap craniale met een pincet (buiten top van de foto)
Figuur 2. Gecatheteriseerd urethra. De gespleten clitoris kan worden gezien net boven de katheter.
Figuur 3. Blaas cfu telt 2 dagen na transurethrale infectie van 8 weken oude vrouwelijke CBA / J muizen met uropathogene E. coli. Blazen werden gehomogeniseerd en cfu / ml bepaald door seriële verdunning uitplaten op MacConkey agar. Diamonds geven kve / ml voor individuele muizen, horizontale balk geeft mediaan kve / ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inductie van de muis urineweginfectie door transurethrale inoculatie van bacteriën is een reeds lang bestaande, maar technisch veeleisende procedure 11. Hung en Hultgren publiceerde onlangs een uitstekend overzicht van transurethrale technieken van de muis urineweginfectie 13. In dit artikel proberen we verder te illustreren de finesses van deze experimentele aanpak.
Beginners kunnen oefenen hun techniek door het uitvoeren van een midline laparotomie om de blaas bloot te leggen, het injecteren van een verdunde oplossing van Oost-Indische inkt (1% in PBS), en observeren voor de blauwe kleur van de blaas. We hebben ontdekt dat een volle blaas is een van de moeilijkste problemen om te gaan met de muis tijdens het urethrale injectie, en is het beste voorkomen door het watertekort en de pre-anesthesie plassen strategieën zoals hierboven beschreven. In onze handen, <10% van de muizen vertonen overloop van urine tijdens urethrale injectie. Een andere mogelijke struikelblok is traumatische catheterisatie, wat kan leiden tot perforatie urethra, ongepaste doses van blaas inocula, en zelfs sterfte van dieren. Gentle techniek en geduld zijn de belangrijkste tijdens de catheterisatie; succesvolle katheterisatie nooit nodig waardoor de katheter in de blaas.
Tot slot kunnen sommige laboratoria niet willen een Bullet Blender homogenisator of een ander "medium throughput" homogenisator, hetzij als gevolg van lage aantallen monsters of kostenoverwegingen gebruik. Een tussentijdse oplossing is om een standaard-homogenisator te gebruiken en het apparaat na elk monster schoon te maken. De meest economische oplossing is het gebruik van glas slijpmachines, die met succes voordat we gebruikt om te schakelen naar de Bullet Blender homogenisator. Onafhankelijk van het weefsel gebruikte homogenisering methode, zorgvuldige, aseptische en consistente techniek zijn cruciaal voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Shelly Xie en Jennifer Payne erkennen voor hun deskundige technische bijstand. Dit werk werd mogelijk gemaakt door subsidies van de Society of Pediatric Urologie en de Stanford Pediatric Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
- Rouschop, K. M. Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract. J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli. Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).
- Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).
- Hvidberg, H. Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies. Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).
- Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).
- Bishop, B. L. Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells. Nat Med. 13, 625-630 (2007).
- Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).
- Hagberg, L. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect Immun. 40, 273-283 (1983).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
