Summary
Dieses Video demonstriert Methoden zur transurethral induzieren Maus Harnwegsinfektionen und zu quantifizieren, das Ausmaß der daraus resultierenden Infektionen.
Abstract
Uropathogene Bakterienstämme von Interesse sind, auf Agar gewachsen. Generell uropathogene
Protocol
I. Vorbereitung der Harnröhren-Katheter
- Für jede Maus Blase und Niere entnommen werden, statt 5-6 Edelstahlkugeln (Blase, 1,6 mm Größe oder 0,9-2,0 mm Blend) oder Zirkonoxid-Perlen (Niere, 0,5 mm Größe) in einem Kryoröhrchen Rohr bzw.. Autoclave die Perle enthaltenden Röhrchen.
- Nach der Rohre auf Umgebungstemperatur abkühlen, 200 Mikroliter steriles PBS zu jeder Edelstahl bead-haltigen Schlauch und 400 Mikroliter steriles PBS in jedes Zirkonoxid bead-haltigen Röhre.
- Wir bereiten Harnleiterkatheter wie Hung und Hultgren 13 beschrieben. Autoclave ein sauberes Paar Flat-Head-Pinzette und einer feinen Schere (Iris oder ähnliches) und erlauben die Instrumente auf Raumtemperatur abkühlen. Wischen Sie die Oberflächen einer Sterilbank mit 70% Ethanol. In der Haube, schneiden Sie ein 30 cm (ca.) Segment der PE-Rohre. Aseptischen Bedingungen statt einer sterilen 30-Gauge-Nadel (2.1 inch lange Nadel) auf einer sterilen 3 ml Spritze. Pick-up ein Ende des Schnittes Polyethylen-Schlauch mit dem autoklaviert Zange und schieben Sie den Schlauch auf die Nadel bis sie den Hub erfüllt. Schneiden Sie den Schlauch so, dass ca. 2 cm über die Spitze der Nadel erstreckt. Entfernen Sie den Katheter aus der Spritze und in eine sterile Petrischale.
- Zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination, machen wir einen Katheter, der für jede Maus. Nachdem alle Katheter vorgenommen werden, sterilisieren durch die Exposition in einer ungedeckten Petrischale UV-Bestrahlung für mindestens 30 Minuten. Schauen Sie nicht direkt an UV-Lampen und setzen jeden Teil des Körpers in der Haube, während Lampen aktiviert werden. Nach UV-Bestrahlung kann Katheter langfristig aufbewahrt in der Petrischale werden. Wir empfehlen Abdichtung der Schale mit Parafilm zu helfen, der Aufrechterhaltung der Sterilität.
II. Tierversuch
- Mäuse ankommen sollten mindestens eine Woche vor dem experimentellen Manipulation, um Stress-induzierten Störfaktoren zu vermeiden. Weibliche Mäuse werden verwendet, weil die männliche Harnröhre Maus ist extrem schwierig, einen Katheter. CBA / J ist ein häufig genutzt, UTI-anfällig Inzucht Mausstamm. Mäuse sollte zwischen 8 und 12 Wochen alt werden, denn dies ist das Fenster der immunologischen Reife vor Seneszenz. Am ersten Tag des Experiments, tauchen am Ende einer sterilen Impföse in ein Fläschchen mit gefrorenen Bakterien Lager. Abkratzen ein kleines Inokulum und Streifen auf einem geeigneten Agarplatte. Generell uropathogene E. coli (UPEC) und andere Stämme können über Nacht auf Luria-Bertani (LB)-Agar bei 37 ° C in der Umgebungsluft. UPEC Stämme wachsen als feste, gelblich-weiße durchscheinende Kolonien auf LB-Agar. Sofort wieder die bakterielle Lager in den Gefrierschrank. Uropathogene Bakterienstämme können sich weniger virulent im Laufe der Zeit mit wiederholten, Serials Kulturen. Wir empfehlen daher, Schlieren eine frische Agarplatte für jedes Experiment.
- Am Tag 2 des Experiments, nach der Bestätigung richtige Koloniemorphologie, nehmen einzelne Kolonien von Agarplatten und in mindestens 5 ccm Bouillonkultur Nacht. LB-Medium kann für die meisten uropathogene Bakterienstämmen verwendet werden können (37 ° C, 200 rpm in der Luft). Halten Sie die Verschlusskappen locker auf der Bouillonkultur Rohre Belüftung zu ermöglichen.
- Am Tag 3 des Experiments, nehmen 10% der ersten Bouillonkultur und Kultur in der Brühe über Nacht wieder (in der Regel 37 ° C und 200 rpm), um Typ-I-Pili Expression zu verstärken. Serielle Brühenkulturen helfen, bakterielle uropathogenicity optimieren, da Typ-I-Pili haben gezeigt worden, um eine kritische Virulenzfaktor für uropathogens in vivo 1 sein. Halten Sie die Verschlusskappen locker auf der Bouillonkultur Rohre Belüftung zu ermöglichen.
- Am Tag 4 des Experiments, messen Sie die OD 600 der Bouillonkultur von Tag 3. Wenn nicht schon für den Bakterienstamm getestet bekannt, führen Sie das Zehnfache serielle Verdünnungsausstrichtest über mindestens 7 Logs (Verdünnungen mit PBS durchgeführt, Kulturen auf LB-Agar durchgeführt, 37 ° C Inkubation über Nacht), um die Beziehung zwischen OD 600 und cfu bestimmen / ml. Als Faustregel gilt, dass eine OD 600 von 0,4-0,5 allgemein entspricht 1-2x10 7 cfu pro 50 Mikroliter. Nachdem die Beziehung zwischen OD 600 und KBE / ml festgestellt worden ist, kann man die Brühe Kultur der OD 600 entsprechend der gewünschten KBE pro Maus in 50 Mikroliter PBS anpassen. Einige Arbeiten hat vorgeschlagen, dass Inokulation von 10 Mikroliter, anstatt 50, auf weniger Rücklauf in die kidneys6 führt. Allerdings haben die meisten Publikationen Verwendung von 50 Mikroliter pro Maus berichtet. Generell wird die gewünschte cfu liegt zwischen 10 6 und 108 KBE / Maus, aber jeder bakteriellen / Mausstamm Kombination muss empirisch in vivo getestet werden.
- Um sicherzustellen, dass Inokula sind nicht sofort nach der Anwendung ungültig, sollte Mäuse von Wasser für mindestens 30 Minuten vor der Einleitung einer Vollnarkose nicht entzogen werden. Ein weiteres wichtiges Manöver ist zu veranlassen Blasenentleerung vor der Narkose-Induktion durch schnappen Mäusen und leichtes Drücken auf die untere Abdomen. Zwei bis 2,5% Isofluran ist eine sichere Induktionsdosis für 8-12 Wochen alte weibliche CBA Mäusen, durch Aufrechterhaltung der Narkose mit 1,8-2% Isofluran gefolgt.
- Sobald Anästhesie erreicht ist, werden die Mäuse in Rückenlage mit dem Kopf in einem nosecone an Isofluran-Sauerstoff eingesetzt platziert. Der Unterleib ist massiert, um Urin aus der Blase zu evakuieren. Wenn die Blase ist relativ leer, so kann dieses Manöver nicht nachgeben Urin. Der Unterleib und Damm ist mit 70% Ethanol getränkt.
- Eine sterile 1 ml-Spritze ohne Nadel dient zur Erstellung der gewünschten bakteriellen Inokulums. Als nächstes wird eine sterile Harnröhrenkatheter aseptisch auf die Spritze gesetzt. Die überschüssige Schlauch ist aus der Katheter mit einer Schere geschnitten, so dass nur 1-2 Millimeter der Schläuche distal der Spitze der Nadel bleiben. Dann wird die Spritze abgenommen und der Kolben mit der Spritze aufrecht, um alle Luftblasen zu entfernen deprimiert. Ein Klacks bakteriostatische Gleitgel ist auf eine sterile Petrischale oder der Innenseite der sterilen Spritze Wrapper gespritzt. Die Spitze des Katheters (mit angeschlossenem Spritze) ist in das Gelee getaucht. Wenn mehrere Bakterienstämme in das gleiche Experiment getestet werden, darauf achten, nicht den gleichen Tropfen Gelee verwenden, um Katheter mit verschiedenen Stämme zu schmieren.
- Mit einem Stereo-Mikroskop (0.8x bis 5fach-Zoom-Bereich) für die Vergrößerung, ist die Vorhaut der Klitoris der narkotisierten Maus sanft in der nicht-dominanten Hand mit einem Paar feinzahnigen Pinzette gefasst und angehoben kopfwärts auf die dunkelrosa Urethraöffnung aussetzen ( Abbildung 1). Die Spritze (mit angeschlossenem Katheter) wird in der dominanten Hand mit einem Bleistift Grip erfassen und die Spitze des Katheters wird in der Harnröhre in einem 45 Grad-Winkel engagiert. Die Vorhaut der Klitoris entlang der Längsachse der Spritze gespannt ist, effektiv "Laden" die Harnröhre auf den Katheter. Dieses Manöver ist wichtig, da die Maus Harnröhre ist redundant. Der Katheter sollte sich leicht in die Blase (bis auf die Nabe, Bild 2) und kann sanft wirbelte um die Navigation der redundanten Falten der Harnröhre. Sobald der Katheter hubbed, kann die Spritze abgesenkt, bis sie parallel mit der Längsachse der Maus ist. Die nicht-dominante Hand fallen kann die Zange zur Stabilisierung der Position des Katheters und Spritze auf wie die dominante Hand wird verwendet, um langsam zu injizieren das Inokulum (mindestens 5 Sekunden). Wenn Flüssigkeit gesehen fließt um den Katheter während der Injektion, ist entweder die Blase voll ist oder die Katheter wird in die Vagina (nur kaudal der Harnröhre). Die Injektion sollte sofort gestoppt werden und die Position des Katheters sorgfältig geprüft. Wenn der Katheter in der Harnröhre, sollte die angegebene Maus nicht in das Experiment einbezogen werden. Auf der anderen Seite kann ein Katheter in die Vagina verlegt neu positioniert werden und die Injektion wieder versucht. Nach der Injektion wird der Katheter und Spritze langsam von der Maus gezogen.
- Zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit des frühen post-Impfung ungültig erklären, die verabreichten Bakterien evakuieren können und dadurch variable Infektionsraten führen, halten einige Forscher Mäusen unter Narkose für 30 Minuten nach transurethralen inoculation10. Nach der Operation sollte Mäusen auf eine saubere wärmende Decke mit kontinuierlicher Beobachtung wieder zur Rückkehr der normalen Atmung und Aktivität zu bestätigen. Sobald Tiere haben völlig die Fähigkeit zu kriechen erholt, können sie auf Betten-haltigen Käfige zurückgebracht werden.
III. Mess-CFU in infiziertem Gewebe
- Verschiedene Maus UTI Publikationen zu Kultur Ergebnisse von 6 Stunden bis eine Woche oder länger nach der Impfung berichtet. Der optimale Zeitpunkt Punkte müssen empirisch für jede bakterielle / Mausstamm Kombination bestimmt werden. Gelassene Urin ist für die Kultur schnappen Maus über eine sterile Petrischale erhalten. Gesammelten Urin sollte auf Eis zu jeder Zeit eingehalten werden. Mehrere Versuche, gelassene Urin über viele Stunden erhalten kann es notwendig sein, da Maus Blasenentleerung ist häufig, geringes Volumen (30-100 Mikroliter pro void) und Stress-abhängig.
- Nach Erhalt ungültig Urinproben, opfern wir Mäuse mit Isofluran und Genickbruch. Der Bauch ist aseptisch geöffnet. Wenn eine gelassene Urin Probe wurde nicht erfolgreich gewonnen erwähnt, kann eine kleine Menge von Urin oft durch die Blasenwand mit einer 30-Gauge-Nadel und Spritze abgesaugt werden.
- Eine oder beide Nieren entfernt werden, Hackfleisch in mindestens 4 Stück (je Stück sollte weniger als 50 Mikrogramm) auf einer sterilen Petrischale, und legte in Zirkon Perlen / PBS-haltigen Kryoröhrchen auf Eis. Die Blase wird entfernt, fein gehackt in mindestens 4 Stück, und legte in Edelstahl Perle / PBS-haltigen Kryoröhrchen auf Eis. Das Gewebe / Perlen / PBS-haltigen Kryoröhrchen werden in a Bullet Blender Homogenisator gegeben und das Gewebe homogenisiert mit der "8" Geschwindigkeit für 1 Minute. Es ist üblich, für einige Gewebestücke nach der Homogenisierung bleiben. Solange 50-100 Mikroliter Flüssigkeit Homogenat pipettiert werden kann, feste Fragmentesind nicht unbedingt ein Problem. Wenn Homogenisierung Zeit für ein paar Proben erhöht wird, ist es wichtig, dies zu tun für alle Gewebe, um die Konsistenz der Homogenisierung zu halten. Wir verwenden a Bullet Blender homogenisiert, weil es die Möglichkeit einer Kreuzkontamination vermieden wird, ist schneller als die Verarbeitung einzelner Proben nacheinander mit einem Standard-Homogenisator, und nicht wesentlich erwärmen die Proben homogenisiert.
- Mindestens zwei oder drei zehnfachen Verdünnungen der gesammelten Urin und Gewebehomogenaten sollte in einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden. Für Vorversuche kann es ratsam, mindestens sieben Zehnfache Verdünnungen machen. Kultur bis zu 100 Mikroliter Urin, Blasen-und / oder Nieren-Homogenaten auf geeigneten Agar. Da Urinproben können Volumen-begrenzt, kann es notwendig sein, um ihr Volumen auf 100 Mikroliter vor zu bringen, um die Durchführung Zehnfache Verdünnungen. Wenn dies erforderlich ist, wird die anfängliche Verdünnung (vor zehnfachen Verdünnung) müssen in die endgültige Berechnung der bakteriellen Erträge berücksichtigt. Wir bevorzugen Kultivierung UPEC auf Eosin-Methylenblau oder MacConkey Agar (Inkubation über Nacht bei 37 ° C), da diese Medien für Gram-negative Organismen selektiv. UPEC Stämme wachsen auf MacConkey Agar als zentral genabelt, rot-rosa Kolonien aufgrund ihrer Fähigkeit, Laktose zu fermentieren.
- Nach Übernacht-Kultur, zählen die cfu für jede Platte. Für seriell verdünnten Proben wird die Platte Verdünnung mit 50-100 Kolonien als die genaueste Zählung. "Zurück"-Berechnung KBE pro Gewebe pro Milligramm Gewebe oder pro ml.
IV. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Harnröhre (dunkelrosa Gewebe) durch Anheben Klitorisvorhaut mit einer Pinzette (jenseits oben Foto) kopfwärts ausgesetzt
Abbildung 2. Harnröhre katheterisiert. Die gespaltene Klitoris kann direkt über den Katheter zu sehen.
Abbildung 3. Bladder cfu zählt 2 Tage nach der transurethralen Infektion von 8 Wochen alte weibliche CBA / J-Mäusen mit uropathogene E. coli. Blasen wurden homogenisiert und KBE / ml bestimmt durch serielle Verdünnung Plattierung auf MacConkey Agar. Diamanten weisen KBE / ml für einzelne Mäuse, zeigt Reck Median KBE / ml.
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Discussion
Die Induktion der Maus Harnwegsinfektion durch transurethrale Inokulation von Bakterien ist eine seit langem etablierte, aber technisch anspruchsvollen Verfahren 11. Hung und Hultgren kürzlich veröffentlichten einen ausgezeichneten Überblick über transurethralen Techniken der Maus Harnwegsinfektion 13. In diesem Papier versuchen wir, weiter zu veranschaulichen, die Feinheiten dieser experimentelle Ansatz.
Anfänger können ihre Technik, indem Sie eine Mittellinie Laparotomie, um die Blase freizulegen, Injektion einer verdünnten Lösung von Tusche (1% in PBS), und die Beobachtung für die blaue Färbung der Blase Praxis. Wir haben festgestellt, dass eine volle Blase eines der schwierigsten Probleme, mit der Maus während der Harnröhre Injektion behandeln ist, und wird am besten durch den Wasserentzug und Pre-Narkose Blasenentleerung Strategien skizzierten verhindert. In unseren Händen, zeigen <10% der Mäuse Überlauf des Urins während der Harnröhre Injektion. Ein weiterer potenzieller Stolperstein ist traumatische Katheterisierung, die Harnröhre Perforation, unsachgemäße Dosen von Blase Inokula und sogar Tiere zum Tod führen kann. Schonende Technik und Geduld sind während der Katheterisierung Schlüssel, erfolgreiche Katheterisierung sollte niemals erforderlich zwingt den Katheter in die Blase.
Schließlich können einige Labors nicht wünschen, a Bullet Blender Homogenisator oder andere "mittleren Durchsatz" Homogenisator, entweder aufgrund der geringen Fallzahlen und Kosten Überlegungen verwenden. Eine Zwischenlösung ist es, einen Standard-Homogenisator Nutzung und Reinigung des Gerätes zwischen jeder Probe. Die wirtschaftlichste Lösung ist die Verwendung von Glasschleifer, die wir erfolgreich vor den Bullet Blender Homogenisator Wechsel eingesetzt. Unabhängig von der Gewebe-Homogenisierung Methode verwendet werden, sind sorgfältige, aseptisch, und konsistente Technik von entscheidender Bedeutung für den Erhalt von reproduzierbaren Ergebnissen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Shelly Xie und Jennifer Payne für ihre technische Unterstützung durch Experten bestätigt. Diese Arbeit wurde ermöglicht durch Zuschüsse aus dem Society of Pediatric Urology und der Stanford Pediatric Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
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