Summary
此影片将展示transurethrally诱导小鼠尿路感染及造成的感染程度量化的方法。
Abstract
生长在琼脂利益肾盂肾炎的菌株。一般而言，肾盂肾炎
Protocol
一，准备尿道导管
- 对于每个鼠标膀胱和肾脏进行采样，5-6不锈钢珠（膀胱，1.6毫米大小0.9-2.0毫米混合）或氧化锆珠（肾，0.5毫米大小），分别放置在一个离心管管。高压灭菌的含珠管。
- 管冷却至室温后，加入200微升无菌PBS，每个不锈钢含珠管和400微升无菌PBS每个氧化锆珠含管。
- 我们准备由红，侯德群13所述的尿道导管。高压灭菌一双干净的平头镊子和剪刀（光圈或类似）的罚款，并让仪器冷却到环境温度。层流罩与70％的乙醇擦拭表面。在油烟机，切一个30厘米的聚乙烯管材（近似）段。 3毫升无菌注射器，无菌的地方无菌30号针头（1 / 2英寸长针）。用灭菌镊子拿起削减聚乙烯管材的一端滑入针管，直到它符合枢纽。切管，使约2厘米的延伸超出针尖。取出导管，注射器，并在无菌培养皿。
- 要减少交叉污染的可能性，我们每个鼠标一个导管。所有导管后，他们发现培养皿中接触到至少30分钟的紫外线照射消毒。不要直视紫外线灯或灯被激活时，暴露在罩体的任何部分。紫外线照射后，导管可长期存储在培养皿中。我们建议用封口膜密封盘，以帮助保持无菌。
二。动物接种
- 小鼠实验操作前至少一个星期到达，以避免应力引起的混杂因素。雌性小鼠的使用，因为雄性小鼠尿道是非常困难的导尿的。 CBA / J是一个普遍使用，尿路感染易感自交系小鼠品系。老鼠应使用8周和12岁之间，因为这是免疫成熟的窗口前衰老。在实验的第一天，浸成一小瓶冷冻细菌股票无菌接种环结束。刮了一个小接种适当的琼脂平板上，连胜了。一般而言，肾盂肾炎大肠杆菌大肠杆菌 （UPEC）和其他菌株可过夜卢里亚Bertani（LB）琼脂在37℃周围空气中的C。 UPEC菌株成长为坚实，黄白色半透明的菌落在LB琼脂。立即返回细菌股票冰柜。肾盂肾炎的菌株，可随着时间的推移变得不那么致命的反复，串行文化。因此，我们建议每一个实验裸奔新鲜琼脂平板。
- 在实验的第2天，确认后适当的菌落形态，至少5毫升肉汤培养物中挑选单菌落琼脂平板和地方过夜。 LB培养基可用于大多数肾盂肾炎的菌株（37℃，周围空气中的200 RPM）。保持宽松的肉汤培养管的上限，允许曝气。
- 在实验的第3天，第一肉汤培养和肉汤培养的10％再次过夜（一般为37 ° C和200 RPM），以提高I型菌毛的表达。串行肉汤培养有利于优化细菌uropathogenicity，因为I型菌毛已被证明是一个关键致病因子在体内 1尿路病原体。保持宽松的肉汤培养管的上限，允许曝气。
- 在实验的第4天，从第3天测量的肉汤培养物的OD 600。如果尚未被测试的菌株，执行了至少7原木（用PBS进行稀释，LB琼脂上执行的文化，37 ° C孵育过夜）10倍连续稀释电镀确定外径 600和CFU之间的关系/毫升。 0.4-0.5外径600作为一个经验法则，通常对应于1 - 2X10 7 CFU每50微升。一旦外径600 CFU /毫升之间的关系已经确定，可以调整肉汤培养物的OD 600对应所需的50微升的PBS CFU每鼠。 10微升，而不是50，接种，减少回流到kidneys6导致了一些工作建议。然而，大多数出版物使用鼠标微升50％。一般来说，10 6 108 CFU /鼠标，但每个细菌/小鼠品系组合需要经验体内测试所需的CFU范围。
- 为了帮助确保不作废，接种滴入后立即，老鼠应该被剥夺的水至少全身麻醉诱导前30分钟。另一个关键的动作是诱导scruffing小鼠麻醉诱导排尿前，轻轻地按较低的abdomEN。 2〜2.5％异氟醚是安全的诱导剂量为8-12星期岁的女CBA的小鼠，维持1.8-2％的异氟醚麻醉。
- 一旦实现了麻醉，小鼠被放置在他们的头插在异氟醚含氧连接到一个头锥仰卧位。按摩小腹疏散膀胱中的尿液。如果膀胱是比较空的，这个演习可能不会产生尿液。下腹及会阴部，用70％乙醇浸泡。
- 1无菌40cc的注射器没有针头是用来绘制所需的细菌接种。下一步，无菌导尿管无菌注射器放在。多余的管被切断导管，用一把剪刀，只有1-2毫米的管道，以便保持远端针尖。然后，注射器是挖掘和柱塞，用注射器直立删除所有气泡郁闷。抑菌润滑dollop果冻是喷到无菌培养皿或无菌注射器包装内。导管的尖端（附注射器）浸在果冻。在相同的实验测试，如果有多个细菌菌株正在小心，不要使用相同的果冻下降，润滑导管含有不同菌株。
- 使用立体显微镜的放大倍数（0.8倍到5倍变焦范围），麻醉鼠标阴蒂是在非主导的手轻轻抓住一双细齿镊，并提出头侧揭露深粉红色的尿道口（图1）。注射器（附加导管）是掌握在占主导地位的手，握铅笔和导管尖端在从事尿道口在45度角。阴蒂是捉襟见肘，沿长轴注射器有效的“加载”到导管尿道。这一演习是必要的，因为鼠标尿道是多余的。应该很容易滑动导管进入膀胱（集线器，图2），可以轻轻飞旋，以帮助导航尿道多余的褶皱。一旦是hubbed导管，注射器，可降低，直到它与鼠标长轴平行。非主导的手可以放下镊子，以帮助稳定的立场是用来为主导的导管和注射器慢慢注入接种（至少5秒钟）。如果流体导管周围流动注射过程中，无论是膀胱全部或导管的阴道（只是尾椎尿道）。注射液，应立即停止，并仔细检查导管的位置。导管在尿道，如果给定的鼠标不应该被包括在实验中。另一方面，可以重新定位和错位的阴道的导管，重新尝试注射。注射后，导管和注射器慢慢地从鼠标撤回。
- 为了减少早期接种后排尿，这可能撤离管理的细菌，从而导致变量的感染水平的可能性，一些研究人员在麻醉状态下保持30分钟后，经尿道前列腺电inoculation10的小鼠。手术后，小鼠恢复连续观测，以确认返回正常的呼吸方式和活动，在一个干净的变暖毯。一旦动物已经完全恢复抓取的能力，他们可能会返回到床上用品，含笼。
三。在受感染的组织测量的CFU
- 各种鼠标UTI的出版物，报告从6小时到一个星期或更长的时间接种后的培养结果。需要凭经验确定每个细菌/小鼠品系组合的最佳时间点。尿scruffing无菌培养皿中的鼠标，获得文化。收集的尿液应保持在任何时候都冰。多的尝试，取得了很多时间，尿可能是必要的，因为鼠标排尿频繁，小批量（30-100微升每无效），并强调依赖。
- 取得尿标本后，我们牺牲了使用异氟醚和颈椎脱位的小鼠。腹部是在无菌条件下打开。如果尿标本未成功获得早期，往往可以被吸出少量的尿液经膀胱壁使用30号针头和注射器。
- 一个或两个肾脏取出，剁碎成至少4件（每件作品应不少于50微克）无菌培养皿中，并放入锆珠/ PBS含离心管放在冰上。膀胱取出，剁碎到至少4件，并放置到不锈钢珠/ PBS离心管放在冰上。组织/磁珠/ PBS离心管置于搅拌机均质机的子弹和组织匀浆使用“8”的速度设定为一分钟。这是常见的一些组织碎片后仍然同质化。只要50-100微升液体匀浆可吸管，固体碎片不一定是一个问题。如果同质化的时间是增加一些样品，关键是做所有组织，以保持同质化的一致性。我们利用一颗子弹搅拌机均质机，因为它避免了交叉污染的可能性，是较快速处理个别样品使用一个标准的均质之一，并没有明显的热量匀浆的样品。
- 在微孔板应至少有两个或三个收集的尿液和组织匀浆稀释十倍。初步的实验中，它可能是审慎的做法，使至少7个10倍稀释。文化可达100微升尿，膀胱，和/或肾匀浆适当的琼脂。尿液标本可能是由于体积有限，可能有必要把其体积为100微升之前执行10倍稀释。如果这是必需的，初始稀释（前10倍稀释）将需要为细菌产量的最终计算的因素。我们宁可培养统一企业曙红亚甲蓝或麦康凯琼脂（在37 ° C孵育过夜），因为这些媒体是革兰氏阴性菌生物的选择性。 UPEC菌株麦康凯琼脂上生长，因为他们的能力发酵乳糖的中央脐，粉红色菌落。
- 培养过夜后，每块板的菌落计数。对于连续稀释的样本，含有50-100个菌落的平板稀释被认为是最准确的计数。 “返回”计算，每组织CFU，每毫克组织，或每毫升。
四。代表性的成果
图1。起重钳（照片上方超越）头侧的阴蒂与暴露尿道口（暗粉色组织）
图2。尿道插管。双歧阴蒂，可以看到正上方的导管。
图3。膀胱CFU计数8周龄雌性CBA / J小鼠肾盂肾炎大肠杆菌经尿道感染后第2天大肠杆菌 。膀胱被同质化和麦康凯琼脂上连续稀释电镀CFU / ml的确定。钻石表明个别小鼠CFU /毫升，单杠表示位数CFU / ml为。
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Discussion
经尿道的细菌接种的小鼠泌尿道感染的感应，是一个历史悠久，但技术要求高的程序11。红和侯德群最近发表的鼠标尿路感染13经尿道前列腺电技术的一个很好的回顾。在本文中，我们试图进一步说明这个实验方法的更细点。
初学者可练习他们的技术，由执行中线剖腹探查术，暴露膀胱，注入了墨汁在PBS（1％）的稀溶液中，观察膀胱蓝色着色。我们发现，一个完整的膀胱是最困难的问题来处理与尿道注射在小鼠之一，而且最好是通过水的匮乏和麻醉前排尿上文所述的战略预防。在我们的手中，<10％的小鼠表现出溢出的尿液在尿道注射。另一个潜在的绊脚石，是外伤性导尿，可导致尿道穿孔，膀胱接种剂量不当，甚至动物死亡。温和的技术和耐心是关键，在导管插入术;成功导尿不应该要求迫使导管进入膀胱。
最后，一些实验室可能不希望使用的子弹搅拌机均质机或其他“中等吞吐量”均质机，无论是由于样本数低或成本的考虑。一个折衷的解决办法是使用标准的匀浆，每个样品之间的清洁设备。最经济的解决方案是使用玻璃研磨机，我们成功地采用了之前切换到子弹搅拌机均质机。无论组织均匀化方法使用，细致，无菌的，一致的技术获得可重复性的结果至关重要。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想雪莉谢和珍妮弗佩恩承认他们的专家技术援助。通过小儿泌尿外科学会和斯坦福大学的儿科研究基金的拨款，这项工作成为可能。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
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