Protocol
I. הכנה של צנתרים השופכה
- במשך כל שלפוחית השתן העכבר כליה להיות שנדגמו, מקום 5-6 חרוזים נירוסטה (שלפוחית השתן, בגודל 1.6 מ"מ או תערובת 0.9-2.0 מ"מ) או חרוזים זירקוניום אוקסיד (כליות בגודל 0.5 מ"מ) הגליל האחד cryovial, בהתאמה. החיטוי חרוז המכילים צינורות.
- לאחר צינורות להתקרר לטמפרטורת הסביבה, להוסיף 200 מיקרוליטר של PBS סטרילי זה צינור נירוסטה חרוז המכילים ו 400 מיקרוליטר של PBS סטרילי זה צינור זירקוניום אוקסיד חרוז המכילים.
- אנחנו מכינים קטטר השופכה כפי שתואר על ידי Hung ו Hultgren 13. החיטוי זוג נקי של שטוח ראש מלקחיים ומספריים קנס (איריס או סוג דומה) ולאפשר המכשירים להתקרר לטמפרטורת הסביבה. נגבו את פני השטח של ברדס למינרית לזרום עם אתנול 70%. בשכונה, חתך 30 ס"מ (בקירוב) קטע של צינורות פוליאתילן. בסביבה נקייה מחיידקים, במקום מחט סטרילית 30 מד (מחט ארוכה 1 / 2 אינץ') על מזרק 3 סמ"ק סטרילי. להרים קצה אחד של צינורות פוליאתילן לחתוך עם מלקחיים autoclaved והחלק את צינור אל המחט עד שהוא פוגש את הרכזת. חותכים את צינורות כך כ 2 ס"מ חורג קצה המחט. הסר את הקטטר מן המזרק ומניחים בצלחת פטרי סטרילית.
- כדי להקטין את הסבירות של זיהום צולב, אנו לעשות אחד קטטר עבור כל עכבר. אחרי הכל צנתרים נעשים, לעקר מהם על ידי חשיפה בצלחת פטרי חשפו קרינה UV במשך 30 דקות לפחות. אל תסתכל ישירות על מנורות UV או לחשוף כל חלק של הגוף בשכונה בעוד מנורות מופעלים. לאחר החשיפה UV, צנתרים ניתן לאחסן לטווח ארוך בצלחת פטרי. אנו ממליצים איטום צלחת עם Parafilm כדי לעזור לשמור על סטריליות.
השנייה. בעלי חיים הרכבת חיסון
- העכברים צריכים להגיע לפחות שבוע לפני מניפולציה ניסויית על מנת למנוע מתח המושרה גורמים סותרים. עכברים נקבה משמשים כי השופכה עכבר זכר קשה מאוד קטטר. CBA / J הוא מנוצל בדרך כלל, UTI-רגישים למתח עכבר מולדת. עכברים אמור לשמש בין 8 ל 12 שבועות של גיל, שכן זהו חלון של בגרות החיסונית לקראת ההזדקנות. ביום הראשון של הניסוי, לטבול את קצה לולאה inoculating סטרילי לתוך בקבוקון של מלאי חיידקים קפואים. לגרד inoculum קטן החוצה פס בצלחת אגר המתאים. באופן כללי, uropathogenic E. coli (UPEC) ו זנים אחרים ניתן לגדל לילה בשעה 37 על אגר (LB) לוריא-Bertani מעלות הסביבה האוויר. זנים UPEC לגדול כמו מוצק, לבן צהבהב שקוף מושבות על אגר LB. מיד להחזיר את מלאי החיידקים למקפיא. זני חיידקים Uropathogenic יכול להיות ארסית פחות לאורך זמן עם תרבויות חזר סדרתי. לפיכך, אנו ממליצים פסים צלחת אגר טרי עבור כל ניסוי.
- ביום 2 של הניסוי, לאחר אישור מורפולוגיה המושבה נכונה, לבחור אחת מן המושבות צלחות אגר ומניחים סמ"ק לפחות 5 התרבות מרק לילה. מרק LB יכול לשמש זני חיידקים uropathogenic ביותר (37 ° C, 200 סל"ד בתוך הסביבה האוויר). שמור את כמוסות רופף על צינורות תרבות מרק כדי לאפשר אוורור.
- ביום 3 של הניסוי, לקחת 10% של התרבות מרק התרבות הראשון במרק לילה שוב (בדרך כלל 37 ° C ו סל"ד 200), כדי לשפר את סוג הביטוי אני פילי. תרבויות מרק סידורי לעזור כדי לייעל uropathogenicity בקטריאלי, שכן סוג אני פילי הוכחו להיות גורם קריטי עבור ארסיות uropathogens in vivo 1. שמור את כמוסות רופף על צינורות תרבות מרק כדי לאפשר אוורור.
- ביום 4 של הניסוי, למדוד את OD 600 של התרבות מרק מיום 3. אם לא ידוע כבר זן חיידקי נבדק, לבצע פי עשרה ציפוי דילול סדרתי על לפחות 7 יומנים (דילולים הופיע עם PBS, תרבויות שבוצעו על אגר LB, 37 ° C הדגירה לילה) כדי לקבוע את הקשר בין OD 600 ו CFU / ml. ככלל אצבע, OD של 600 0.4-0.5 כלל מתאים CFU 1 2x10-7 ל 50 מיקרוליטר. לאחר מערכת היחסים בין OD 600 ו CFU / ml נקבע, ניתן להתאים את התרבות מרק ל OD 600 המתאים CFU הרצוי לכל העכבר 50 מיקרוליטר של PBS. עבודה חלק הציעו כי חיסון של 10 מיקרוליטר, במקום 50, המוביל ריפלוקס פחות לתוך kidneys6. עם זאת, רוב הפרסומים דיווחו על שימוש של 50 מיקרוליטר לכל עכבר. ככלל, טווחי CFU הרצוי בין 10 ו - 6 108 CFU / עכבר, אבל כל שילוב זן חיידקי / עכבר צריך להיבדק באופן אמפירי in vivo.
- כדי להבטיח inocula לא ביטל מיד לאחר החדרה, עכברים יש לשלול מים במשך לפחות 30 דקות לפני אינדוקציה של הרדמה כללית. עוד תמרון המפתח הוא לגרום הרקה לפני הגיוס הרדמה ידי scruffing עכברים בעדינות לחיצה על abdom נמוךen. שני עד 2.5% isoflurane הוא מנה אינדוקציה בטוח 8-12 בן שבוע נקבות עכברים CBA, ואחריו הרדמה תחזוקה עם 1.8-2% isoflurane.
- לאחר הרדמה מושגת, עכברים ממוקמים בעמדה פרקדן עם הראש שלהם הוכנס nosecone המחובר חמצן isoflurane המכילים. הבטן התחתונה היא עיסה לפנות את השתן משלפוחית השתן. אם השלפוחית ריקה יחסית, התמרון הזה לא עשוי להניב שתן. בבטן התחתונה חיץ הנקבים ספוגה אתנול 70%.
- מזרק סטרילי 1 סמ"ק ללא מחט משמש כדי למשוך את inoculum חיידקי הרצוי. בשלב הבא, קטטר השופכה סטרילי ממוקם בסביבה נקייה מחיידקים, על המזרק. צינורות עודף לנתק את הקטטר עם זוג מספריים, כך שרק 1-2 מילימטרים של צינורות נותרים דיסטלי אל קצה המחט. ואז, המזרק הוא טפח ואת הבוכנה מדוכא עם המזרק זקוף כדי להסיר את כל הבועות. מנה של סיכה bacteriostatic ג'לי הוא ניתז על גבי צלחת פטרי סטרילית או את החלק הפנימי של עטיפת מזרק סטרילי. בקצה הקטטר (עם מזרק המצורף) הוא טבל את ג'לי. אם זני חיידקים מרובות נבדקות בניסוי אותו, להיזהר שלא להשתמש ירידה זהה של ג'לי לשמן צנתרים המכיל זנים שונים.
- באמצעות מיקרוסקופ סטריאופוני (0.8x טווח זום 5x) עבור ההגדלה, מכסה מנוע הדגדגן של העכבר הרדים הוא תפס בעדינות עם זוג נאה שיניים מלקחיים ביד הלא דומיננטי והעלה cephalad לחשוף את meatus השופכה ורוד עמוק ( איור 1). מזרק (עם קטטר המצורפת) הוא תפס ביד הדומיננטית עם אחיזת עיפרון בקצה הקטטר עוסקת meatus השופכה בזווית של 45 מעלות. מכסה המנוע הדגדגן נמתח לאורך ציר זמן של המזרק, ביעילות "טוען" את השופכה על הקטטר. תמרון זה חיוני מאז השופכה העכבר הוא מיותר. קטטר צריכה להחליק בקלות לתוך שלפוחית השתן (עד הרכזת, איור 2), והוא יכול להיות סובב בעדינות כדי לעזור לנווט את קפלי מיותר של השופכה. לאחר קטטר הוא hubbed, המזרק ניתן להוריד עד שהוא מקביל עם ציר האורך של העכבר. היד הלא דומיננטית יכולים להוריד את המלקחיים כדי לעזור לייצב את המיקום של קטטר ו מזרק כמו היד הדומיננטית משמש לאט להזריק את inoculum (לפחות 5 שניות). אם הנוזל הוא ראה זורם סביב הקטטר במהלך ההזרקה, או שלפוחית השתן מלאה או קטטר הוא בתוך הנרתיק (הזנב רק כדי השופכה). הזרקת יש להפסיק מיד את מיקומו של הקטטר לבחון היטב. אם הקטטר היה השופכה, העכבר לא ניתן לכלול בניסוי. מצד שני, קטטר במקומה בנרתיק יכול להיות מיקומו ואת הזריקה מחדש ניסו. לאחר ההזרקה, קטטר ואת המזרק היא נסוגה לאיטה מן העכבר.
- כדי להקטין את הסיכוי של הרקה שלאחר חיסון מוקדם, שעשוי לפנות מנוהל חיידקים, ובכך להוביל רמות זיהום משתנה, חוקרים מסוימים לשמור על עכברים תחת הרדמה במשך 30 דקות לאחר inoculation10 transurethral. לאחר הניתוח, עכברים צריך להתאושש על שמיכה מחממת נקי עם תצפית רציפה כדי לאשר שובו של דפוסי נשימה נורמלי פעילות. לאחר חיות התאוששו באופן מלא את היכולת לזחול, הם עשויים להיות חזר מצעים המכילים בכלובים.
ג. CFU מדידת ברקמה מאשרום
- עכבר פרסומים שונים UTI דיווחו על תוצאות של תרבות 6 שעות בשבוע אחד או יותר לאחר חיסון. נקודות זמן אופטימלי צריך להיקבע באופן אמפירי עבור שילוב זן חיידקי כל / עכבר. שתן מבוטלות מתקבל לתרבות ידי scruffing העכבר מעל צלחת פטרי סטרילית. השתן שנאסף יש לשמור על הקרח בכל עת. ניסיונות מרובים להשיג שתן בטלה על פני שעות רבות עשוי להיות נחוץ, שכן הרקה העכבר נפח תכופים, נמוך (3-10 מיקרוליטר לכל חלל), מתח תלויי.
- לאחר השגת דגימות שתן בטלה, אנו להקריב בעכברים באמצעות פריקה isoflurane ואת צוואר הרחם. הבטן היא פתחה בסביבה נקייה מחיידקים. אם דגימת שתן בטלה לא התקבל בהצלחה קודם לכן, כמות קטנה של שתן לעתים קרובות ניתן aspirated דרך הקיר שלפוחית השתן באמצעות מחט מד מזרק 30 ו.
- אחת או שתי הכליות מוסרים, טחון לתוך לפחות 4 חתיכות (כל חתיכה צריכה להיות פחות מ 50 מיקרוגרם) על צלחת פטרי סטרילית, והניח לתוך חרוז זירקוניום / PBS המכילים cryovials על הקרח. שלפוחית השתן מוסר, טחון לתוך לפחות 4 חתיכות, מכניסים נירוסטה חרוז / PBS המכילים cryovials על הקרח. רקמה / חרוזים / PBS המכילים cryovials ממוקמים כדור בלנדר homogenizer ואת רקמות הומוגני באמצעות "8" קביעת מהירות למשך דקה אחת. זה נפוץ כמה קטעי רקמות להישאר אחרי homogenization. כל עוד 5-10 מיקרוליטר של homogenate נוזלי ניתן pipetted, שברי מוצקהם לא בהכרח בעיה. אם הזמן הוא גדל homogenization עבור כמה דוגמאות, חשוב לעשות זאת במשך כל רקמות על מנת לשמור על עקביות של homogenization. אנו מנצלים כדור בלנדר homogenizer כי זה ימנע את האפשרות של זיהום צולב, היא מהירה יותר מאשר עיבוד דגימות בודדות אחד אחד באמצעות homogenizer רגיל, ואינו משמעותי החום דגימות להיות הומוגני.
- לפחות שתיים או שלוש עשרה לקפל דילולים של שתן שנאספו homogenates רקמות צריכים להיעשות צלחת microtiter. בניסויים ראשוניים זה עשוי להיות נבון כדי להפוך לפחות שבעה פי עשרה דילולים. תרבות עד 100 מיקרוליטר של שתן, שלפוחית השתן, ו / או homogenates כליה על אגר המתאים. מאז דגימות שתן עשוי להיות נפח מוגבל, ייתכן שיהיה צורך להביא כרכים שלהם 100 מיקרוליטר לפני ביצוע פי עשרה דילולים. אם זה נדרש, דילול ראשוני (לפני דילול פי עשרה) יהיה צורך בחשבון חישובים הסופי של התשואות חיידקי. אנחנו מעדיפים UPEC culturing על eosin-מתילן כחול או אגר MacConkey (הדגירה לילה בשעה 37 ° C), שכן התקשורת אלה סלקטיבית של אורגניזמים גראם שליליים. זנים UPEC גדלים על אגר MacConkey כמו umbilicated מרכזי, אדום ורוד מושבות בשל יכולתם להתסיס לקטוז.
- לאחר לילה תרבות, לספור את CFU עבור כל צלחת. לקבלת דוגמיות בדילול סדרתי, הדילול צלחת ובה 50-100 מושבות נחשבת ספירה מדויקת ביותר. "חזרה" לחשב CFU לכל רקמה, מיליגרם של רקמות, או לכל מ"ל.
IV. נציג תוצאות
באיור 1. Meatus השופכה (רקמה ורוד כהה) שנחשפו על ידי הרמת מכסה המנוע הדגדגן cephalad עם מלקחיים (מעבר גבי צילום)
איור 2. צינתור השופכה. הדגדגן bifid ניתן לראות בדיוק מעל הקטטר.
איור 3. שלפוחית השתן CFU ספירת 2 ימים לאחר ההדבקה transurethral של 8 שבוע הישן CBA / י נקבות עכברים עם uropathogenic E. coli. שלפוחיות היו הומוגני ו CFU / ml נקבע על ידי ציפוי דילול סדרתי על אגר MacConkey. יהלומים מצביעים CFU / ml עבור עכברים בודדים, הפס האופקי מציין CFU חציון / ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
- Rouschop, K. M. Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract. J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli. Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).
- Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).
- Hvidberg, H. Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies. Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).
- Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).
- Bishop, B. L. Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells. Nat Med. 13, 625-630 (2007).
- Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).
- Hagberg, L. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect Immun. 40, 273-283 (1983).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
