Summary
Bu video transüretral fare idrar yolu enfeksiyonlarına neden ve enfeksiyonların sonucunda dereceye ölçmek için yöntemler gösterecektir.
Abstract
Ilgi üropatojenik bakteri suşlarının agar yetiştirilmektedir. Genellikle, üropatojenik
Protocol
Üretral kateterler I. Hazırlık
- Numune alınacak her bir fare mesane ve böbrek için, sırasıyla, bir cryovial tüp içinde 5-6 paslanmaz çelik boncuk (mesane, 1.6 mm boyutlarında veya 0,9-2,0 mm karışımı) veya zirkonyum oksit boncuk (böbrek, 0.5 mm boyutlarında) yerleştirin. Boncuk içeren tüplere Otoklav.
- Ortam sıcaklığına kadar soğumasını tüpleri sonra, her paslanmaz çelik boncuk içeren tüp ve her zirkonyum oksit boncuk içeren tüp steril PBS 400 mikrolitre 200 mikrolitre steril PBS ekleyin.
- Biz, Hung ve Hultgren 13 tarafından açıklandığı gibi üretral kateterler hazırlar . Temiz bir çifti düz başlı forseps ve ince makas (iris veya benzer tipte) Otoklav ve aletlerin ortam sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. % 70 etanol ile laminer akış kaput yüzeyleri silin. Kaput, polietilen boru, 30 cm (yaklaşık) segmentinde kesti. Aseptik olarak steril bir 3 cc şırınga, steril bir 30 iğne (1 / 2 inç uzun bir iğne) yerleştirin. Otoklavlanmış forseps ile kesilen polietilen boru bir ucunu Pick up ve hub karşılar kadar iğne üzerine boru slayt. Yaklaşık 2 cm iğne ucu ötesine uzanan boru böylece kesin. Kateter steril bir petri şırınga ve yerden çıkarın.
- Çapraz bulaşma olasılığını azaltmak için, biz her fare için bir kateter olun. Tüm kateterler yapıldıktan sonra, onları en az 30 dakika süreyle UV radyasyona maruz kalma ile ortaya bir petri sterilize edin. UV lambaları ile doğrudan veya lambaları aktif iken kaputu vücudun herhangi bir parçası maruz bırakmayın. UV ışınlarına maruz kalan, kateter petri uzun vadeli saklı olabilir. Biz kısırlık korumaya yardımcı olmak için Parafilm çanak sızdırmazlık öneririz.
II. Hayvan Aşılama
- Fare, strese bağlı karıştırıcı faktörlerin önlemek için haftada en az bir deneysel manipülasyon önce gelmelisiniz. Erkek fare üretra catheterize son derece zor, çünkü dişi fareler kullanılır. CBA / J yaygın olarak kullanılan, idrar yolu enfeksiyonu duyarlı kendilenmiş fare suşu. Bu immünolojik olgunluk, yaşlılık önce pencere olduğundan, Fare, 8 ile 12 hafta arasında yaş kullanılmalıdır. Deneyin ilk gününde, donmuş bakteriyel stok bir şişeye steril bir aşılama döngünün sonuna batırın. Uygun bir agar plaka üzerine küçük bir inokulum ve çizgi dışı Toplayıp. Genellikle, üropatojenik E. coli (UPEC) ve diğer suşları 37 Luria-Bertani (LB) agar gecede büyüdü ° C, havadaki. UPEC suşları LB agar katı, sarımsı-beyaz saydam koloniler olarak büyür. Hemen bakteriyel stok dondurucu dönmek. Üropatojenik bakteri suşlarının tekrarlanan, seri kültürleri ile zamanla daha az öldürücü olabilir. Dolayısıyla, her bir deney için taze bir agar plaka şeritli tavsiye ederiz.
- Deney 2 gün, uygun koloni morfolojisi onayladıktan sonra, bir gecede en az 5 cc suyu kültür agar plakları ve yerden tek koloniler almak. LB suyu en üropatojenik bakteri suşları için kullanılabilir (37 ° C, havadaki 200 rpm). Havalandırma izin suyu kültür tüpleri kapakları gevşek tutun.
- Deney 3 gün, tip I pili ifade artırmak için (genellikle 37 ° C ve 200 rpm) bir gecede% 10 suyu ilk suyu kültür ve kültür. Tip I pili in vivo 1 üropatojenler için kritik bir virülans faktörü olduğu gösterilmiştir beri Seri suyu bakteri kültürleri, uropathogenicity optimize etmek için yardımcı olur. Havalandırma izin suyu kültür tüpleri kapakları gevşek tutun.
- Deney 4 gün, 3 gün suyu kültürü OD 600 ölçer. Test edilen bakteri suşu için zaten bilinen değilse, OD 600 ve kob arasındaki ilişkiyi belirlemek için en az 7 günlükler (PBS ile yapılan dilüsyonları, LB agar üzerinde yapılan kültürler, 37 ° C de inkübasyon gecede) üzerinden on kat seri seyreltme kaplama yapmak / ml. Genel bir kural olarak, 0,4-0,5 bir OD 600 50 mikrolitre başına 1-2x10 7 kob yaygın karşılık gelir. OD 600 ve kob / ml arasında bir ilişki tespit edildikten sonra, bir OD 600 PBS 50 mikrolitre fare başına istenen kob karşılık gelen suyu kültürü ayarlayabilirsiniz. Bazı iş yerine 50 den 10 mikrolitre, aşılama, kidneys6 içine az reflü yol açtığını öne sürmüştü. Ancak, çoğu yayınlar ortalama 50 mikrolitre fare kullanımı bildirdin. Genel olarak, 10 6 ve 108 kob / fare, ama her bakteriyel / fare suşu kombinasyonu in vivo deneysel olarak test edilmesi gerekmektedir arasında istenen kob aralıkları.
- Bu inocula instilasyon hemen sonra işeme değildir sağlamaya yardımcı olmak için, fare genel anestezi indüksiyonu öncesinde en az 30 dakika süreyle su yoksun olmalıdır. Bir diğer önemli manevra scruffing fareler anestezi indüksiyonu öncesinde işeme neden ve yavaşça alt abdom basaraktr. Iki ila% 2,5 'izofluran% 1,8-2 izofluran ile bakım anestezi ile 8-12 haftalık kadın CBA fareler için güvenli bir indüksiyon dozu,.
- Anestezi sağlandıktan sonra, farelerin izofluran içeren oksijen bağlı bir roket ucu konisi takılı kafası ile yatar pozisyonda yerleştirilir. Alt karın mesaneden idrar tahliye için masaj yapılır. Mesane nispeten boş ise, bu manevra idrar verim olmayabilir. Alt karın ve perine% 70 etanol ile ıslatılır.
- Olmayan bir steril bir iğne 1 cc şırınga istenilen bakteriyel inokulum çekmek için kullanılır. Sonra steril bir üretral kateter aseptik şırınga yerleştirilir. Sadece 1-2 milimetre boru iğne ucu distal kalır, böylece aşırı boru bir makas ile kateter kesilir. Sonra, şırınga vurdu ve piston tüm kabarcıklar dik kaldırmak için şırınga ile depresif. Bakteriyostatik yağlayan bir topak sütü steril bir petri veya steril enjektör sarmalayıcı iç üzerine etmedik. Kateterin ucu (ekli şırınga ile), jöle batırılmış. Birden fazla bakteri suşlarının aynı deneyi test ediliyor, farklı suşları içeren kateterler yağlamak için aynı damla jöle kullanmamaya dikkat edin.
- Anestezi fare için bir stereo mikroskop büyütme (5x optik zum aralığı 0.8x) kullanarak, klitoral başlık nazik, ince dişli forseps bir çift ile non-dominant el kavradı ve derin pembe üretral meatus (maruz sefalad kaldırdı Şekil 1). Bağlı kateter) şırınga (bir kalem kavrama ile dominant el kavradı ve kateterin ucu 45 derecelik bir açıyla üretral meatus ile uğraşmaktadır. Klitoral kaput şırınga uzun ekseni boyunca gergin, kateterin üzerine etkili üretra "yükleme". Bu manevra, fare üretra gereksiz olduğundan çok önemlidir. Kateter mesane (hub, Şekil 2) kolayca slayt, ve yavaşça üretra gereksiz kıvrımları gezinmenize yardımcı twirled olabilir. Kateter hubbed sonra fare uzun eksenine paralel olana kadar, şırınga düşürülebilir. Baskın olmayan el inokulum (en az 5 saniye) yavaş yavaş enjekte etmekte kullanılan dominant el olarak kateter ve şırınga konumunu istikrara kavuşturmak için forseps bırakabilirsiniz. Sıvı enjeksiyon sırasında kateter etrafında akan görülürse, mesane ya tam veya kateter vajina (üretra sadece kaudal). Enjeksiyon hemen durdurulur ve kateter pozisyonu dikkatle incelenmelidir. Kateter üretra ise, verilen fare deneyinde yer olmamalıdır. Öte yandan, vajina içinde yanlış bir kateter yerleştirilmesine ve enjeksiyon yeniden girişimi. Enjeksiyondan sonra, kateter ve şırınga fare yavaş yavaş geri çekilir.
- Uygulanan bakteri tahliye ve böylece değişken enfeksiyon düzeylerine yol açabilir erken aşılama sonrası işeme olasılığını azaltmak için, bazı araştırmacılar anestezi altında transüretral inoculation10 sonra 30 dakika süreyle fareler korumak. Ameliyattan sonra, farelerin normal nefes desen ve faaliyet dönüş onaylamak için sürekli gözlem ile temiz bir ısınma battaniye kurtarmak olmalıdır. Bir kez hayvanlar tam tarama yeteneği iyileşti, onlar çarşaf içeren kafeslerde iade edilebilir.
III. Enfekte Doku Ölçü CFU
- Çeşitli fare İYE yayınlar 6 saat, bir hafta veya daha uzun bir post-aşılama kültür sonuçları bildirdin. En uygun zaman her bakteriyel / fare suşu kombinasyonu için ampirik olarak tespit edilmesi gerekir. Iflenen idrar kültürü için steril bir Petri kabı üzerine fare scruffing elde edilir. Toplanan idrar, her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Işeme idrar kaç saat içinde elde etmek için birden çok deneme fare işeme, sık, düşük hacimli (geçersiz ortalama 30-100 mikrolitre) olduğundan, gerekli ve strese bağlı olabilir.
- Işeme idrar örnekleri alındıktan sonra, izofluran ve servikal dislokasyon kullanarak fareleri kurban. Karın aseptik açıldı. Işeme idrar örneği başarıyla daha önce elde değilse, küçük bir idrar miktarı genellikle 30 gauge iğne ve şırınga kullanılarak mesane duvarının üzerinden aspire edilebilir.
- Bir veya iki böbreğin kaldırılır steril bir petri üzerinde en az 4 adet (her parça en az 50 mikrogram olmalıdır) içine kıyılmış ve yerleştirilir zirkonyum boncuk / PBS içeren buz üzerinde cryovials. Mesane, kaldırılır, en az 4 adet içine kıyılmış ve paslanmaz çelik boncuk / yerleştirilir PBS içeren buz üzerinde cryovials. Doku / boncuk / PBS içeren cryovials Bullet Blender homojenizatör yerleştirilir ve dokuları, bir dakika süreyle "8" hız ayarı kullanarak homojenize edilir. Bazı doku parçaları homojenizasyon sonra kalması için yaygındır. Sıvı Homojenat 50-100 mikrolitre pipetlenebilir sürece, katı parçalarımutlaka bir sorun değildir. Homojenizasyon zaman bazı örnekler arttırılabilir ise, homojenizasyon tutarlılığı korumak için bütün dokular için bunu yapmak için kritik öneme sahiptir. Bullet Blender homojenizatör, çapraz bulaşma olasılığını ortadan kaldırır, bireysel örnekler standart bir Homojenizatör kullanarak tek bir işlem daha hızlı ve örnekleri homojenize önemli ölçüde ısı değildir çünkü kullanmaktadır.
- En az iki ya da üç kez toplanan idrar ve doku homojenatlarında on kat dilüsyonları mikrotiter plate yapılmalıdır. Ön deneyler için en az yedi on kat dilüsyonları yapmak için ihtiyatlı olabilir. 100'e kadar uygun agar Kültür idrar mikrolitre, mesane ve / veya böbrek homojenatlarında. Idrar örnekleri hacmi sınırlı olabilir bu yana, on kat dilüsyonları gerçekleştirmeden önce 100 mikrolitre birimleri getirmek için gerekli olabilir. Eğer bu talep ediliyorsa, ilk seyreltme (on kat seyreltme önce) bakteriyel verimi son hesaplamalarına dahil çarpanlarına gerekecektir. Bu medya Gram negatif organizmalar için seçici olduğundan, eozin metilen mavisi veya MacConkey agar (37 gecelik inkübasyon ° C) kültür UPEC tercih. MacConkey agar UPEC suşları laktoz fermente yeteneği nedeniyle merkezi umblike, kırmızı-pembe koloniler olarak büyür.
- Gece kültürden sonra, her plaka için kob sayılır. 50-100 koloni içeren plaka seyreltme seri seyreltilmiş numuneler için en doğru sayısı olarak kabul edilir. "Geri" doku miligram başına, doku başına kob hesaplamak veya ml'de.
IV. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 forseps (fotoğraf üst ötesinde) ile sefalad klitoral kaput kaldırma maruz Üretral meatus (koyu pembe doku) .
Şekil 2 üretra kateterize. Bifid klitoris kateter hemen üstünde görülebilir.
Şekil 3 Mesane kob üropatojenik E. ile 8 hafta yaşında kadın CBA / J fareler transüretral enfeksiyonu 2 gün sonra sayılır coli. Mesanesi MacConkey agar seri seyreltme kaplama homojen ve kob / ml tespit edildi. Elmas bireysel fareler için kob / ml gösterir, yatay çubuk medyan kob / ml gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İndüksiyon fare idrar yolu enfeksiyonu, bakteri transüretral aşılama köklü ama teknik olarak zor bir işlemdir 11. Hung ve Hultgren fare idrar yolu enfeksiyonu 13 transüretral teknikler son zamanlarda mükemmel bir inceleme yayınladı. Bu çalışmada, biz bu deneysel yaklaşım daha ince göstermek için çalışırlar.
Yeni başlayanlar, mesane ortaya çıkarmak için bir orta hat laparotomi yapmak, Hindistan mürekkep (PBS içinde% 1) bir çözelti enjekte ve mesane mavi rengi gözlemleyerek, onların tekniğini uygulama. Biz tam bir mesane, fare üretral enjeksiyon sırasında ile başa çıkmak için en zor sorunlardan biri olduğunu bulduk ve en iyi su kısıtlaması ve yukarıda özetlenen öncesi anestezi işeme stratejileri ile önlenir. Bizim ellerde, farelerin <% 10 üretral enjeksiyon sırasında idrar taşması sergilerler. Başka bir potansiyel engel travmatik kateterizasyon, üretra perforasyonu, mesane inocula yanlış doz, ve hayvan ölüme bile yol açabilir. Nazik tekniği ve sabır kateterizasyon sırasında anahtar; kateter mesane içine iterler başarılı kateterizasyon gerektiren asla.
Son olarak, bazı laboratuvarlar Bullet Blender homojenizatör veya düşük örnek numaraları veya maliyet hususları nedeniyle ya diğer "orta verim" homojenizatör, kullanmak istediğiniz olmayabilir. Bir ara çözüm standart bir Homojenizatör kullanın ve her bir numune arasında cihaz temiz. En ekonomik çözümü başarıyla Bullet Blender homojenizatör geçiş öncesinde istihdam değirmenleri, cam kullanılması. Kullanılan doku homojenizasyon yöntemi ne olursa olsun, aseptik, titiz ve tutarlı bir tekniktir tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, uzman teknik yardım için Shelly Xie ve Jennifer Payne, kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Pediatrik Üroloji Derneği ve Stanford Pediatrik Araştırma Fonu hibe yoluyla mümkün olmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
- Rouschop, K. M. Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract. J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli. Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).
- Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).
- Hvidberg, H. Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies. Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).
- Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).
- Bishop, B. L. Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells. Nat Med. 13, 625-630 (2007).
- Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).
- Hagberg, L. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect Immun. 40, 273-283 (1983).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
